Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (Nei. 2019M3A9E2061789), og av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329). Vi er takknemlige til Eunsoo Kim og Eugene Lee for deres tekniske assistanse.

Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Sungkyunkwan University og Seoul National University.
1. Tilberedning av løsninger: kunstig spytt og smakstoffer
<ol><li>Forbered kunstig spytt ved å oppløse 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4og 1,8 mM HCl i destillert vann (>1 L), og ju...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Beskrevet her er en detaljert protokoll for å bruke μTongue til undersøkelse av funksjonelle aktiviteter av smaksceller in vivo. I denne protokollen utføres funksjonell avbildning på smakscellene ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer. I tillegg til bruk av transgene mus kan elektroforetisk lasting av kalsiumfargestoffer (eller spenningssensorfarger) på smakscellene være et alternativ.
Alle smaksløsningene mindre enn 1.336 av brytningsindeksen ble brukt i dette eksper...

Det intravitale fluorescensmikroskopet brukes mye til å studere den romlige dynamikken på levende vev. Forskere utvikler raskt genetisk kodede sensorer som gir spesifikke og sensitive transformasjoner av de biologiske prosessene til fluorescenssignaler - som lett kan registreres ved hjelp av fluorescensmikroskoper som er allment tilgjengelige1,2. Selv om de fleste indre organer i gnagere har blitt undersøkt ved hjelp av mikroskopet, har den vellykkede applikasjonen til tungen ennå ikke vært vellykket3.
Tidligere studier på kalsiumavbildning av smaksceller ble utført ex vivo ved tynnseksjon av et tungevev for å oppnå circumvallate smaksløker4,5,6 eller ved å skrelle av smaksepitelet for å oppnå soppform smaksløk7,8. Utarbeidelsen av disse prøvene var uunngåelig invasiv, og dermed ble de naturlige mikromiljøene som nerver innervasjon, permeabilitetsbarrierer og blodsirkulasjon i stor grad forstyrret. Det første intravitale tungeavbildningsvinduet ble rapportert i 2015 av Choi et al., men pålitelig funksjonelt opptak var ikke oppnåelig på grunn av bevegelsen og optiske gjenstander forårsaket av fluidiske tastant stimuli9.
Nylig ble mikrofluidikk-på-en-tunge (μTongue) introdusert10. Denne enheten integrerer et mikrofluidisk system med et bildevindu på musetungen. Ved å oppnå en kvasi-steady-state strøm av tastant stimuli gjennom bildeperioden, kan artefakter fra fluidisk bevegelse minimeres (Figur 1). Inngangsporten mates av en rekke flerkanals trykkregulatorer, mens utgangsporten er koblet til en sprøytepumpe, som opprettholder 0,3 ml/ min. I tillegg ble optiske artefakter forårsaket av forskjellen i brytningsindekser av tastantløsninger minimert ved at rasjonmetrisk analyse introduserte en kalsiumfølsom indikator (tdTomato) samt kalsiumindikatoren (GCaMP6)11. Denne designen ga mikroskopisk stabilitet av smaksceller in vivo selv med brå veksling mellom fluidiske kanaler. Følgelig implementerer μTongue en pålitelig funksjonell screening av flere smaksstoffer til musens smaksløker in vivo.
I denne protokollen forklares de eksperimentelle prosedyrene i detalj for kalsiumavbildning av mussvampform smaksløkene in vivo ved hjelp av μTongue. For det første er utarbeidelsen av kunstig spytt og tastantløsninger beskrevet. For det andre innføres oppsettet av mikrofluidisk system for å oppnå kvasi-steady-state-strømmen. For det tredje avgrenses prosedyrene som brukes til å montere musetungen på μTongue for å tillate bildeanskaffelse. Til slutt angis hvert trinn for bildeanalyse, inkludert korrigering av laterale bevegelsesartefakter og rasjonmetri. Denne protokollen kan enkelt tilpasses ethvert forskningslaboratorium med et museanlegg og et to-foton mikroskop eller tilsvarende utstyr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

Intravital fluorescensmikroskopi er et verktøy som brukes mye til å studere multicellulær dynamikk i et levende dyr. Det har imidlertid ikke blitt brukt i smakssensorisk organ. Ved å integrere mikrofluidikk i det intravitale tungeavbildningsvinduet, gir μTongue pålitelige funksjonelle bilder av smaksceller in vivo under kontrollert eksponering for flere smaksstoffer. I dette dokumentet presenteres en detaljert trinnvis prosedyre for å bruke μTongue-systemet. Det er fem underavsnitt: forberedelse av tastantløsninger, oppsett av en mikrofluidisk modul, prøvemontering, anskaffelse av funksjonelle bildedata og dataanalyse. Noen tips og teknikker for å løse de praktiske problemene som kan oppstå når du bruker μTongue, presenteres også.

Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen ble brukt til å få et smaksløkbilde. Overflaten på musetungen var dekket med autofluorescent filiform papillae. Smaksløkene spres sparsomt over tungens overflate (Figur 4A). Bildene av smaksløken og dens struktur ble anskaffet ved hjelp av tre forskjellige filterdetektorer. Ved hjelp av filtersettet 607/70 nm ble tdTomato-signalet fra smakscellene oppnådd for forholdsmetrisk analyse (figur 4B). Ved hjelp av 525/50 nm filtersett...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Artikkelen introduserer μTongue (mikrofluidics-on-a-tongue) enheten for funksjonell smak celle avbildning in vivo ved å integrere mikrofluidikk i et intravitalt bildevindu på tungen.

μTongue: En mikrofluidikkbasert funksjonell bildeplattform for tungen In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Denne protokollen gjør det mulig å observere funksjonene til smaksceller i et naturlig mikromiljø med nevrale forbindelser og blodsirkulasjonen forblir intakt. Ved hjelp av denne teknikken kan celle-til-celle-kommunikasjon undersøkes in vivo. For å begynne å fylle reservoarene i det trykksatte strømningsperfusjonssystemet med kunstig spytt og smaksstoffer.Koble trykkluftledningen til regulatorinngangen og sett lufttrykket i det fluidiske leveringssystemet til 30 til 50 pund per kvadrattomme. Sett regulatorens utgangstrykk til 0,4 pund per kvadrattomme og kontroller om væsken begynner å strømme ut av røret. Koble manifolden fra reservoarene til mikrotungens inngangsport, koble deretter mikrotungens utgangsport til en sprøytepumpe og trekk væsken ut ved ca. 300 mikroliter per minutt for å etablere en steady state-tilstand.Kontroller at volumet på dråpen som henger under mikrotungen forblir konstant og juster lufttrykket og strømningshastigheten for å oppnå ønsket prøvehøyde. Når mikrofluidsystemet er satt opp, kobler du fra trykkluftledningen og slår av sprøytepumpen til musen er klargjort for in vivo-avbildning. Etter å ha administrert anestesi til musen, injiser intravenøst TRITC-dextran gjennom en retro-orbital rute for å observere blodsirkulasjonen under avbildning.Med musen plassert i en liggende stilling, spray 70% etanol på hodet. Bruk tang til å løfte hodehuden lett, og bruk deretter saks til å klippe av omtrent syv kvadratmillimeter hud. Etter rengjøring av håret rundt hodebunnen, fjern periosteumet fra under huden og påfør et øyeblikkelig lim på skallen.Fest deretter den tilpassede hodefikseren. Når det umiddelbare limet er herdet, påfør tannlim rundt hodefikseren og størk den ved belysning med blått lys. Bruk øyeblikkelig lim for å lime underleppen av musen til den nederste enheten på mikrotungen, legg deretter musen på musens forberedelsesbrett og fest bunnenheten på mikrotungen til holdstolpene ved å justere hullene på kanten av mikrotungen med stolpene.Stram festeanordningen for musehodet til hodefikserholderen på brettet og juster avstanden mellom musehodet og enheten. Deretter roterer du musehodet jevnt med ca. 45 grader ved hjelp av hodefikserholderen. Etter å ha festet musen til brettet, bruk plast pinsett for å tegne tungen forsiktig.Fest deretter den ventrale siden av tungen til oversiden av den nederste enheten på mikrotungen ved hjelp av øyeblikkelig lim. For å holde tungen fuktig, tørk overflaten med en våt bomullspinne, legg deretter et stykke vev gjennomvåt i kunstig spytt på den eksponerte overflaten av tungen. Plasser de buede skivene på stolpene, hold den nederste delen av mikrotungen, og flytt deretter musepreparatet til mikroskopstadiet.Plasser den eksponerte tungen på musen under det omtrentlige midten av mikroskopets objektive område, sørg for ikke å avvike fra det dynamiske området på scenen, og stram deretter skruene for å feste musebrettet på scenen. Plasser en varmepute under musen for å opprettholde kroppstemperaturen mellom 36,5 og 37,5 grader Celsius. For å forhindre at væske kommer inn i musens luftrør, legg et tynt stykke vridd papir inne i musens munn, fjern deretter det våte vevet som er plassert på overflaten av tungen og plasser den forberedte mikrotungen på musetungen, slik at overflaten av tungen er synlig gjennom bildevinduet.Fest mikrotungen ved å skru forsiktig i begge ender med minimalt trykktrykk. For å begynne å anskaffe bilder, åpne mikroskopprogramvaren, og slå deretter på 920 nanometer to-foton laser. Monter vann nedsenkningsmålet på mikroskopet, senk deretter målet på mikrotungens bildevindu og senk målet.I kameramodus lyser du opp overflaten på tungen ved å slå på det blå lyset fra en kvikksølvlampe. For å finne det omtrentlige fokusplanet, juster Z-aksen og søk etter et autofluorescence-signal fra filiform papillen. Finn deretter en smaksløk ved hjelp av X- og Y-justeringsknappen.Bytt til multi-photon-modus, og still deretter inn eksitasjonsbølgelengden, utslippsfiltersettet, skannemodusen og rammestørrelsen for bildeanskaffelse. Med smaksløken i midten av bildevinduet, finn blodkarene rundt smaksløken på omtrent to tredjedeler av smaksløkens høyde og visualiser blodsirkulasjonen. Hvis blodstrømmen er tilstoppet, løsner du festeskruene litt for å gjenoppta blodstrømmen.Juster Z-aksen for å finne Z-planet til en smaksløk som inneholder et tilstrekkelig antall smaksceller, og fortsett deretter med kalsiumavbildning ved to til seks Hertz i 80 sekunder. Etter at avbildningen har startet, slår du på reservoaret i det fluidiske systemet for å gi en smaksløsning i 20 sekunder. Etter 20 sekunder med smakstimulering, bytt reservoaret tilbake til kunstig spytt.Under bildet, vent i omtrent tre til fire minutter mellom økter konsekvent gi kunstig spytt for å holde tungen fuktig og vaske bort tastant gjenværende fra forrige økt. Tungeoverflaten til Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen er dekket med autofluorescent filiform papillae og spredt smaksløker. Den filiform papille i gult er fanget ved hjelp av en fotodetektor på 500 til 550 nanometer og kan observeres fra selve overflaten av tungen opp til ca 25 mikrometer i dybden.GCaMP-signalene i grønt oppdaget av 500 til 550 nanometrefilteret og tdTomato-signalene i rødt, oppdaget av 607 til 670 nanometerfilteret, representerer smakscellene. tdTomato-signalet oppnås for ratio metrisk analyse. Blodkarene som omgir smaksløken er anskaffet ved hjelp av 500 til 550 nanometerfilteret satt i kollagen bindevevet, som strukturelt støtter smaksløken, er anskaffet ved hjelp av 447 til 460 nanometer filtersett.I dette representative eksemplet på in-vivo smaksscreening ved hjelp av kalsiumavbildning, blir hver smakscelle avgrenset av stiplede linjer. I denne studien reagerte celle 2 på både søte og umami-smakstoffer. Og celle 3 reagerte på både lave og høye saltsmakemidler.Ingen av cellene i denne smaksløken reagerte på sur smak. Siden formålet med dette eksperimentet er å observere smakscellefunksjon i det naturlige miljøet, er det viktig å levere fluorescerende i blodkarene på forberedelsestrinnet og bekrefte sirkulasjonen under eksperimentet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo avbildning av Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Bruke Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Høyoppløselig Structural Magnetic Resonance Imaging of Human subcortex<I&gt; I Vivo</I&gt; Og Post mortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Volumetrisk metode for kvantifisering av Cerebral vasospasme i en Murine modell av Hjernehinneblødning

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

I Vivo To-fotonet avbilding av kortikale nevroner i Neonatal mus

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

I vivo Imaging av spinal Fluid transport gjennom intakt Mouse Skull bruker fluorescens Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...