Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Ciência Básica (IBS-R015-D1), a Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789), e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) subvenção financiada pelo governo da Coreia (MSIT) (nº 2019M3E5D2A01058329). Somos gratos a Eunso Kim e Eugene Lee por sua assistência técnica.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e da Universidade Nacional de Seul.
1. Preparação de soluções: saliva artificial e tastants
<ol><li>Prepare a saliva artificial dissolvendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4e 1,8 mM HC...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Descrito aqui é um protocolo detalhado para aplicar μTongue à investigação de atividades funcionais de células de paladar in vivo. Neste protocolo, é realizada a imagem funcional nas células gusticuladas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados. Além do uso de camundongos transgênicos, o carregamento eletroforético de corantes de cálcio (ou corantes de sensoriamento de tensão) nas células gustativas pode ser uma opção alternativa.
Todas as soluções...

O microscópio de fluorescência intravital é amplamente utilizado para estudar a dinâmica espostetemporal em tecidos vivos. Pesquisadores estão desenvolvendo rapidamente sensores geneticamente codificados que fornecem transformações específicas e sensíveis dos processos biológicos em sinais de fluorescência - que podem ser registrados prontamente usando microscópios de fluorescência que estão amplamente disponíveis1,2. Embora a maioria dos órgãos internos em roedores tenham sido investigados usando o microscópio, sua aplicação bem sucedida na língua ainda não foi bem sucedida3.
Estudos anteriores sobre a imagem de cálcio das células gustativas foram realizados ex vivo por secção fina de um tecido da língua para obter papilas gustativas circunvaloladas4,5,6 ou descascando o epitélio de sabor para obter papilas gustativas fungiformas7,8. A preparação dessas amostras foi inevitavelmente invasiva, assim, os microambientes naturais, como a inervação dos nervos, as barreiras de permeabilidade e a circulação sanguínea, foram em grande parte perturbados. A primeira janela intravital de imagem da língua foi relatada em 2015 por Choi et al., mas a gravação funcional confiável não foi alcançável devido ao movimento e artefatos ópticos causados pelo estímulo tastante fluido9.
Recentemente, microfluidos-em-uma-língua (μTongue) foi introduzido10. Este dispositivo integra um sistema microfluido com uma janela de imagem na língua do rato. Ao atingir um fluxo de estado quase estável de estímulos tastantes durante todo o período de imagem, artefatos do movimento fluido poderiam ser minimizados(Figura 1). A porta de entrada é alimentada por uma série de controladores de pressão multicanal, enquanto a porta de saída está conectada a uma bomba de seringa, que mantém 0,3 mL/min. Além disso, artefatos ópticos causados pela diferença nos índices de refração das soluções tastant foram minimizados pela análise ratiométrica introduzindo um indicador insensível de cálcio (tdTomato) bem como o indicador de cálcio (GCaMP6)11. Este design proporcionou estabilidade microscópica das células de paladar in vivo mesmo com a troca abrupta entre canais fluidos. Consequentemente, o μTongue implementa uma triagem funcional confiável de vários tastants para as papilas gustativas do mouse in vivo.
Neste protocolo, os procedimentos experimentais são explicados em detalhes para a imagem de cálcio das papilas gustativas fungiformas do camundongo in vivo usando μTongue. Em primeiro lugar, descreve-se a preparação de saliva artificial e soluções saborosas. Em segundo lugar, a configuração do sistema microfluido para alcançar o fluxo de estado quase estável é introduzida. Em terceiro lugar, os procedimentos utilizados para montar a língua do rato no μTongue para permitir a aquisição de imagens são delineados. Por fim, cada passo para análise de imagem, incluindo correção de artefatos de movimento lateral e razãometria, é especificado. Este protocolo pode ser adaptado prontamente para qualquer laboratório de pesquisa com uma instalação de mouse e um microscópio de dois fótons ou equipamento equivalente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

A microscopia de fluorescência intravital é uma ferramenta amplamente utilizada para estudar a dinâmica multicelular em um animal vivo. No entanto, não foi usado com sucesso no órgão sensorial de sabor. Ao integrar microfluidos na janela de imagem intravital da língua, o μTongue fornece imagens funcionais confiáveis de células de paladar in vivo sob exposição controlada a vários tastants. Neste artigo, é apresentado um procedimento passo a passo detalhado para utilizar o sistema μTongue. São cinco subseções: preparação de soluções tastant, criação de um módulo microfluido, montagem de amostras, aquisição de dados de imagem funcionais e análise de dados. Algumas dicas e técnicas para resolver as questões práticas que podem surgir ao usar o μTongue também são apresentadas.

O mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato foi usado para obter uma imagem de paladar. A superfície da língua do rato estava coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes. As papilas gustativas são espalhadas esparsamente sobre a superfície da língua(Figura 4A). As imagens da papila gustativa e sua estrutura foram adquiridas utilizando três detectores de filtros diferentes. Utilizando o conjunto de filtros de 607/70 nm, o sinal tdTomato das células gustares foi obtido para análise r...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

O artigo introduz o dispositivo μTongue (microfluidos-em-uma-língua) para imagens de células de paladar funcional in vivo, integrando microfluidos em uma janela de imagem intravital na língua.

μTongue: Uma plataforma de imagem funcional baseada em microfluidics para a língua in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Este protocolo permite observar as funções das células de paladar em um microambiente natural com conexões neurais e circulação sanguínea permanecendo intacta. Usando essa técnica, a comunicação célula-celular pode ser investigada in vivo. Para começar, encha os reservatórios do sistema de perfusão de fluxo pressurizado com saliva artificial e tastants.Conecte a linha de ar comprimido à entrada do regulador e coloque a pressão de ar no sistema de entrega fluidica para 30 a 50 libras por polegada quadrada. Defina a pressão de saída do regulador para 0,4 libras por polegada quadrada e verifique se o líquido começa a fluir para fora do tubo. Conecte o coletor dos reservatórios à porta de entrada da micro-língua, depois conecte a porta de saída da micro língua a uma bomba de seringa e retire o líquido a aproximadamente 300 microliters por minuto para estabelecer uma condição de estado estável.Confirme que o volume da gotícula pendurada sob a micro língua permanece constante e ajuste a pressão de ar e a taxa de fluxo para obter a altura amostral desejada. Uma vez configurado o sistema microfluido, desconecte a linha de ar comprimido e desligue a bomba de seringa até que o mouse esteja preparado para imagens in vivo. Depois de administrar anestesia ao camundongo, injete intravenosamente tritc-dextran através de uma rota retro-orbital para observar a circulação sanguínea durante a imagem.Com o mouse colocado em uma posição supina, borrife 70% de etanol na cabeça. Use fórceps para levantar a pele da cabeça levemente, em seguida, use a tesoura para cortar aproximadamente sete milímetros quadrados de pele. Depois de limpar o cabelo ao redor do couro cabeludo, remova o periósteo debaixo da pele e aplique um adesivo instantâneo no crânio.Em seguida, anexe o fixador de cabeça personalizado. Uma vez que o adesivo instantâneo é endurecido, aplique cola dentária ao redor do fixador da cabeça e solidifice-o por iluminação com uma luz azul. Usando adesivo instantâneo para colar o lábio inferior do mouse à unidade inferior da micro língua, em seguida, colocou o mouse na placa de preparação do mouse e segurou a unidade inferior na micro língua para os postes de redo pé, alinhando os orifícios na borda da micro língua com os postes.Aperte o fixador da cabeça do mouse no suporte do fixador da cabeça na placa e ajuste a distância entre a cabeça do mouse e o dispositivo. Em seguida, usando o suporte do fixador de cabeça, gire a cabeça do mouse suavemente em aproximadamente 45 graus. Depois de fixar o mouse na placa, use pinças de plástico para desenhar sua língua suavemente.Em seguida, usando adesivo instantâneo, conecte o lado ventral da língua ao lado superior da unidade inferior da micro-língua. Para manter a língua úmida, limpe a superfície com um cotonete molhado e coloque um pedaço de tecido encharcado em saliva artificial na superfície exposta da língua. Coloque as arruelas curvas nos postes, segurando a parte inferior da micro-língua, em seguida, mova a preparação do mouse para o estágio do microscópio.Posicione a língua exposta do mouse sob o centro aproximado da área objetiva do microscópio, certificando-se de não desviar da faixa dinâmica do palco e, em seguida, aperte os parafusos para fixar firmemente a placa do mouse no palco. Coloque uma almofada de aquecimento sob o mouse para manter sua temperatura corporal entre 36,5 e 37,5 graus Celsius. Para evitar que o líquido entre na traqueia do rato, coloque um fino pedaço de papel torcido dentro da boca do rato, em seguida, remova o tecido molhado colocado na superfície da língua e coloque a micro língua preparada na língua do rato, de tal forma que a superfície da língua seja visível através da janela de imagem.Fixar a micro-língua paraparando suavemente ambas as extremidades com pressão compressiva mínima. Para começar a adquirir imagens, abra o software do microscópio e ligue o laser de 920 nanômetros de dois fótons. Monte o objetivo de imersão de água no microscópio, depois baixe o objetivo na janela de imagem da micro língua e mergulhe o objetivo.No modo câmera, ilumine a superfície da língua ligando a luz azul de uma lâmpada de mercúrio. Para encontrar o plano focal aproximado, ajuste o eixo Z e procure um sinal de autofluorescência a partir da papila filiforme. Em seguida, usando o botão de ajuste X e Y, localize uma papila gustativa.Mude para o modo multifótons e, em seguida, defina o comprimento de onda de excitação, o conjunto de filtros de emissão, o modo de varredura e o tamanho do quadro para aquisição de imagens. Com a papila gustativa no centro da janela de imagem, localize os vasos sanguíneos ao redor da papila gustativa em cerca de dois terços da altura da papila gustativa e visualize a circulação sanguínea. Se o fluxo sanguíneo estiver entupido, solte ligeiramente os parafusos de fixação para retomar o fluxo sanguíneo.Ajuste o eixo Z para encontrar o plano Z de uma papila gustativa contendo um número adequado de células gustativas, em seguida, proceda com imagens de cálcio em dois a seis Hertz por 80 segundos. Após o início da imagem, ligue o reservatório do sistema fluido para fornecer uma solução de sabor por 20 segundos. Após 20 segundos de estimulação do sabor, mude o reservatório de volta para saliva artificial.Durante a imagem, espere cerca de três a quatro minutos entre as sessões fornecendo consistentemente saliva artificial para manter a língua úmida e lavar o tastant restante da sessão anterior. A superfície da língua do mouse Pirt-GCaMP6f-tdTomato é coberta com papilas filiformes filiformes autofluorescentes e papilas gustativas pouco espalhadas. As papilas filiformas em amarelo são capturadas usando um detector de fotos a 500 a 550 nanômetros e podem ser observadas desde a própria superfície da língua até aproximadamente 25 micrômetros de profundidade.Os sinais GCaMP em verde detectados pelo filtro de 500 a 550 nanômetros e os sinais tdTomato em vermelho, detectados pelo filtro de 607 a 670 nanômetros, representam as células gustiáveis. O sinal tdTomato é obtido para análise métrica de razão. Os vasos sanguíneos que circundam a papila gustativa são adquiridos usando o filtro de 500 a 550 nanômetros fixado no tecido conjuntivo de colágeno, que sustenta estruturalmente a papila gustativa, é adquirido usando o conjunto de filtros de 447 a 460 nanômetros.Neste exemplo representativo de rastreamento de sabor in vivo usando imagem de cálcio, cada célula de sabor é demarcada por linhas tracejadas. Neste ensaio, a célula 2 respondeu aos tastants doces e umami. E a célula 3 respondeu aos tastantes de sal baixo e alto.Nenhuma das células deste paladar respondeu aos gostos azedos. Uma vez que o objetivo deste experimento é observar a função celular do paladar no ambiente natural, é importante entregar os fluorescentes nos vasos sanguíneos na etapa de preparação e confirmar sua circulação durante o experimento.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Mapeamento funcional com MEG e EEG em simultâneo

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Neurociência

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo de imagens de pós-natal Cerebelar Granule migração celular Usando confocal Macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

De alta resolução de ressonância magnética estrutural do Subcórtex Humano<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...