Name: &#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi olan Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R015-D1) tarafından desteklenmiştir (Hayır. 2019M3A9E2061789) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (No. 2019M3E5D2A01058329). Eunsoo Kim ve Eugene Lee'ye teknik yardımları için minnettarız.

Tüm cerrahi prosedürler Sungkyunkwan Üniversitesi ve Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması: yapay tükürük ve şok tabancaları
<ol><li>2 mM NaCl, 5 mM KCl çözünerek yapay tükürük hazırlayın, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, damıtılmış suda 0,12 mM KH2PO4ve 1,...

<ol>
	<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators.">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain.">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li><li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence+microscopy:+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment.">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li><li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Ca2++imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells.">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li><li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds.">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li><li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels.">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li><li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice.">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li><li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+salt+recruits+aversive+taste+pathways.">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li><li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation.">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li><li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo.">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li><li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes.">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li><li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+/+6J+mice.">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li><li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength.">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference.">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li><li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+anion+in+salt+(NaCl)+detection+by+mouse+taste+buds.">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li><li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1.">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li></ol>

Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.
Bu ...

Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar - bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır3.
Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalışmalar, sirkülasyon tat tomurcukları 4,5,6elde etmek için bir dil dokusunu ince bölümlere ayırarak veya mantar formu tat tomurcukları elde etmek için tat epitelini soyarak ex vivo yapıldı7,8. Bu örneklerin hazırlanması kaçınılmaz olarak invazivdi, bu nedenle sinirlerin innervasyonu, geçirgenlik bariyerleri ve kan dolaşımı gibi doğal mikroçevreler büyük ölçüde pertüre edildi. İlk intravital dil görüntüleme penceresi 2015 yılında Choi ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir, ancak akışkan tastant uyaranların neden olduğu hareket ve optik eserler nedeniyle güvenilir fonksiyonel kayıt elde edilemedi9.
Son zamanlarda, mikroakışkanlar-on-a-language (μTongue)tanıtıldı 10. Bu cihaz, fare dilinde bir görüntüleme penceresi ile mikroakışkan bir sistemi entegre eder. Görüntüleme süresi boyunca sabit bir uyarıcı uyaran akışı elde edilerek, akışkan hareketten elde edilen eserler en aza indirilebilir (Şekil 1). Giriş porti bir dizi çok kanallı basınç kontrolörü tarafından beslenirken, çıkış bağlantı noktası 0,3 mL/ dk tutan bir şırınna pompasına bağlanır. Ek olarak, şok çözeltilerinin kırılma indekslerindeki farklılık nedeniyle oluşan optik eserler, kalsiyuma duyarsız bir gösterge (tdTomato) ve kalsiyum göstergesi (GCaMP6)11.'yitanıtan oranmetrik analiz ile en aza indirilmiştir. Bu tasarım, akışkan kanallar arasında ani geçişle bile tat hücrelerinin vivo mikroskobik stabilitesini sağladı. Sonuç olarak, μTongue, vivo fare tat tomurcuklarına birden fazla şok tabancasının güvenilir bir fonksiyonel taramasını uygular.
Bu protokolde, μTongue kullanılarak in vivo fare mantar formu tat tomurcuklarının kalsiyum görüntülemesi için deneysel prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İlk olarak, yapay tükürük ve lezzetli çözeltilerin hazırlanması açıklanmaktadır. İkinci olarak, yarı sabit durum akışını sağlamak için mikroakışkan sistemin kurulmasına geçilir. Üçüncü olarak, görüntü alımına izin vermek için fare dilini μTongue'a monte etmek için kullanılan prosedürler tanımlanmıştır. Son olarak, yanal hareket yapıtlarının ve oranmetrisinin düzeltilmesi de dahil olmak üzere görüntü analizi için her adım belirtilir. Bu protokol, bir fare tesisi ve iki foton mikroskobu veya eşdeğer bir ekipman ile herhangi bir araştırma laboratuvarına kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>acesulfame K</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04054-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0759-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>01810-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>denatonium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5765-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental glue</td>
			<td>Denkist</td>
			<td>P0000CJT-A2</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>57510-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Loctite 4161, Henkel</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3786-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Yuhan</td>
			<td>Ketamine 50</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0662-25G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>237205-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathwork</td>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>49601-100G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutiphoton microscope</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td>&#160;Bergamo II</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>792519-500G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N16XLWD-PF</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaflow</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>OCTAFLOW II</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>LG</td>
			<td>Lg15N54</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ORION STAR AZ11</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>806562</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Q1125-5G</td>
			<td>Artificial saliva / tastant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Havard Apparatus</td>
			<td>PHD ULTRA 4400</td>
			<td>Fluidic control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>52194-1G</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast fiber laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>FFultra920 01042</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer Korea</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>Animal preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

&#181;tongue: a microfluidics-based functional imaging platform for the tongue in vivo

İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.

Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresi tat alma tokası görüntüsü elde etmek için kullanıldı. Fare dilinin yüzeyi otofluoresan filiform papilla ile kaplıydı. Tat tomurcukları dilin yüzeyine seyrek olarak yayılır (Şekil 4A). Tat alma tomurcukunun ve yapısının görüntüleri üç farklı filtre dedektörü kullanılarak elde edildi. 607/70 nm filtre seti kullanılarak, oranmetrik analiz için tat hücrelerinden tdTomato sinyali elde edildi (Şekil 4B). 525...

Watch this Scientific Journal Video about Ã‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo at JoVE.com

Ãƒâ€šÃ‚ÂµTongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.

μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Bu protokol, sinirsel bağlantılar ve kan dolaşımı bozulmadan kalan doğal bir mikroçevrimde tat hücrelerinin işlevlerini gözlemlemeye izin verir. Bu teknik kullanılarak hücreden hücreye iletişim in vivo olarak araştırılabilir. Başlamak için, basınçlı akış perfüzyon sisteminin rezervuarlarını yapay tükürük ve şok tabancaları ile doldurun.Basınçlı hava hattını regülatör girişine bağlayın ve akışkan dağıtım sistemindeki hava basıncını inç kare başına 30 ila 50 pounda ayarlayın. Regülatörün çıkış basıncını inç kare başına 0,4 pound olarak ayarlayın ve sıvının tüpten akmaya başlayıp başlamay olduğunu kontrol edin. Manifoldu rezervuarlardan mikro dilin giriş portuna bağlayın, ardından mikro dilin çıkış portu bir şırınga pompasına bağlayın ve sabit bir durum durumu oluşturmak için sıvıyı dakikada yaklaşık 300 mikrolitrede çekin.Mikro dilin altında asılı damlacığın hacminin sabit kaldığını onaylayın ve istenen numune yüksekliğini elde etmek için hava basıncını ve akış hızını ayarlayın. Mikroakışkan sistem kurulduktan sonra basınçlı hava hattını çıkarın ve fare in vivo görüntüleme için hazırlanana kadar şırınga pompasını kapatın. Fareye anestezi uyguladıktan sonra, görüntüleme sırasında kan dolaşımını gözlemlemek için TRITC-dektranı retro yörüngesel bir yoldan intravenöz olarak enjekte edin.Fare geri zeka pozisyonuna yerleştirilmişken, kafasına% 70 etanol püskürtün. Baş derisini hafifçe kaldırmak için tokmaklar kullanın, ardından yaklaşık yedi milimetre kare deriyi kesmek için makas kullanın. Saç derisinin etrafındaki saçları temizledikten sonra, periosteumu cildin altından çıkarın ve kafatasına anında bir yapıştırıcı uygulayın.Ardından özelleştirilmiş kafa düzelticiyi takın. Anında yapıştırıcı sertleştikten sonra, baş düzelticinin etrafına diş yapıştırıcısı uygulayın ve mavi ışıkla aydınlatarak katılaştırın. Farenin alt dudağını mikro dilin alt birimine yapıştırmak için anında yapıştırıcı kullanarak fareyi fare hazırlama tahtasına yerleştirin ve mikro dilin kenarındaki delikleri direklerle hizalayarak mikro dildeki alt üniteyi tutma noktalarına sabitleyin.Fare kafası düzelticisini tahtadaki kafa düzeltici tutucusuna sıkın ve fare kafası ile cihaz arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, kafa düzeltici tutucuyu kullanarak fare kafasını yaklaşık 45 derece döndürün. Fareyi tahtaya sabitledikten sonra, dilini nazikçe çizmek için plastik cımbız kullanın.Daha sonra anında yapıştırıcı kullanarak, dilin ventral tarafını mikro dilin alt ünitesinin üst tarafına takın. Dili nemli tutmak için, yüzeyi ıslak bir pamuklu çubukla silin, ardından dilin açık yüzeyine suni tükürük içine batırılmış bir doku parçası yerleştirin. Kavisli pulları mikro dilin alt kısmını tutarak direklere yerleştirin, ardından fare hazırlığını mikroskop aşamasına getirin.Farenin açık dilini mikroskop nesnel alanının yaklaşık merkezinin altına yerleştirin, aşamanın dinamik aralığından sapmamaya dikkat edin, ardından fare tahtasını sahneye sıkıca takmak için vidaları sıkın. Vücut sıcaklığını 36,5 ila 37,5 santigrat derece arasında korumak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Sıvının fare nefes borusuna girmesini önlemek için, farenin ağzının içine ince bir bükülmüş kağıt parçası yerleştirin, ardından dilin yüzeyine yerleştirilen ıslak dokuyu çıkarın ve hazırlanan mikro dili, dilin yüzeyinin görüntüleme penceresinden görülebilecek şekilde fare diline yerleştirin.Her iki ucını da minimum basınç basıncıyla hafifçe vidalayarak mikro dili sabitleyin. Görüntü almaya başlamak için mikroskop yazılımını açın, ardından 920 nanometre iki foton lazeri açın. Su daldırma hedefini mikroskop üzerine monte edin, ardından hedefi mikro dilin görüntüleme penceresine diraye bırakın ve hedefi daldırın.Kamera modunda, bir cıva lambasından mavi ışığı açarak dilin yüzeyini aydınlatın. Yaklaşık odak düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın ve filiform papilladan bir otofluoresans sinyali arayın. Ardından X ve Y ayar düğmesini kullanarak bir tat alma tomurcuk bulun.Çoklu foton moduna geçin, ardından görüntü alımı için heyecan dalga boyunu, emisyon filtresi kümesini, tarama modunu ve çerçeve boyutunu ayarlayın. Görüntüleme penceresinin ortasındaki tat alma tomurcukları ile, tat tomurcukunun yaklaşık üçte iki yüksekliğinde tat tomurcukunu çevreleyen kan damarlarını bulun ve kan dolaşımını görselleştirin. Kan akışı tıkanırsa, kan akışına devam etmek için sabitleme vidalarını hafifçe gevşetin.Yeterli sayıda tat hücresi içeren bir tat tomurcukunun Z düzlemini bulmak için Z eksenini ayarlayın, ardından 80 saniye boyunca iki ila altı Hertz'de kalsiyum görüntülemeye devam edin. Görüntüleme başladıktan sonra, 20 saniye boyunca bir tat çözeltisi sağlamak için akışkan sistemin rezervuarını kapatın. 20 saniyelik tat stimülasyonundan sonra rezervuarı tekrar yapay tükürük sınayın.Görüntüleme sırasında, dili nemli tutmak ve önceki seanstan kalan ıslıyı yıkamak için sürekli olarak yapay tükürük sağlayan seanslar arasında yaklaşık üç ila dört dakika bekleyin. Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresinin dil yüzeyi otofluoresan filiform papilla ve seyrek yayılmış tat tomurcukları ile kaplıdır. Sarı filiform papilla, 500 ila 550 nanometrede bir fotoğraf dedektörü kullanılarak yakalanır ve dilin yüzeyinden yaklaşık 25 mikrometre derinliğe kadar gözlemlenebilir.500 ila 550 nanometre filtre tarafından algılanan yeşildeki GCaMP sinyalleri ve 607 ila 670 nanometre filtresi tarafından algılanan kırmızı tdTomato sinyalleri tat hücrelerini temsil eder. TdTomato sinyali oran ölçüm analizi için elde edilir. Tat alma tomurcuklarını çevreleyen kan damarları, tat tomurcuklarını yapısal olarak destekleyen kollajen bağ dokusunda ayarlanan 500 ila 550 nanometre filtre seti kullanılarak elde edilir.Kalsiyum görüntüleme kullanılarak in-vivo tat taramasının bu temsili örneğinde, her tat hücresi kesik çizgilerle çizilir. Bu denemede, hücre 2 hem tatlı hem de umami tastantlarına yanıt verdi. Ve hücre 3 hem düşük hem de yüksek tuz lekelerine cevap verdi.Bu tat tomurcuklarındaki hücrelerin hiçbiri ekşi tatlara cevap vermedi. Bu deneyin amacı doğal ortamda tat hücre fonksiyonunu gözlemlemek olduğundan, floresanların hazırlık adımında kan damarlarına teslim etmek ve deney sırasında dolaşımını onaylamak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

Eşzamanlı MEG ve EEG Fonksiyonel Haritalama

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

İnsan Subcortex yüksek çözünürlüklü yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme<I&gt; İn Vivo</I&gt; Ve Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subaraknoid kanama, bir fare modeli serebral Vasospasm miktar hacimsel bir yöntemi

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...