Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
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财政支助由国家科学基金会赠款CBET-1752197和空军科学研究办公室赠款FA9550-19-1-0213提供。

1. 加热夹具准备
<ol><li>收集2块1毫米厚的绝缘橡胶修剪为25毫米×40毫米的宽度和长度，分别2件6毫米厚的橡胶，也是25毫米×40毫米，一个预制的铝基夹具组装，和一个丙烯酸油藏，适合在铝基夹具的观景窗口（见 图S1，S2和S3 的制造细节和爆炸的组装视图）。首先将铝夹具连接到夹具底部，用紫外线可固化胶粘剂将玻璃盖片查看窗口连接起来，并将 1 个电阻加热元件固定在每根 25 mm x ...

此处描述的协议为组装和操作用于形成 DIB 的油和液滴的温度提供了组装和操作实验系统的说明。它特别有利于使用温度高于RT的脂质形成DIB。此外，通过精确改变油藏的温度，可以操纵双层温度来研究温度升高对各种膜特性和特征的影响，包括电容、面积、厚度、诱导的温带相变化、膜活性物种的动力学以及双层界面37、38的粘附能量。
<p class="jove_c...

细胞膜是选择性渗透屏障，由数千种脂质类型1、蛋白质、碳水化合物和固醇组成，这些屏障封装和细分所有活细胞。因此，了解其组成如何影响其功能，揭示自然分子和合成分子如何与细胞膜相互作用、粘附、破坏和转移，是生物学、医学、化学、物理学和材料工程领域具有广泛影响的重要研究领域。
这些发现的目的直接受益于经过验证的组装、操纵和研究模型膜的技术，包括从合成或自然产生的脂质中组装的脂质双层，这些双层细胞模仿其细胞对应体的组成、结构和传输特性。近年来，在油脂涂层水滴之间构建平面脂质双层的液滴接口双层（DIB）方法2、3、4受到重视，5、6、7、8、9、10、11、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，在模型膜形成的其他方法上显示出实用优势：DIB方法操作简单， 不需要复杂的制造或准备（例如， "绘画"）的基板，以支持膜，一贯产生膜与优越寿命长，允许标准电生理学测量，并简化模型膜的形成与不对称的传单成分3。因为双层在液滴之间自发形成，每个液滴都可以在位置和妆容中量身定做， DIB技术也吸引了相当的兴趣，开发细胞启发材料系统，建立在使用刺激反应膜18，24，25，26，27，28，29、平衡分割和运输14、30、31和组织状材料17、23、32、33、34、35、36。
大多数已公布的模型膜实验，包括使用 DIB 的实验，都是在室温下（RT，+20-25 °C）和少量合成脂质（如 DOPC、DPHPC 等）进行的。这种做法限制了可在模型膜中研究的生物物理问题的范围，基于观察，它还可以限制可用于组装DIB的脂质类型。例如，合成脂质，如 DPPC，其熔化温度为 42 °C，不会在 RT37中组装紧密包装的单层或形成 DIB。室温下的DIB形成也被证明是困难的自然提取物，如那些来自哺乳动物（如大脑总脂质提取物，BTLE）38或细菌（如大肠杆菌总脂质提取物，ETLE）37，其中含有许多不同类型的脂质，并来自细胞，居住在高温（37°C）。因此，能够研究不同的成分，为了解生物相关条件下膜介介的过程提供了机会。
提高油的温度可以达到两个目的：它增加单层组件的动力学，并可能导致脂质经历融化过渡，以达到液体紊乱阶段。这两种后果都有助于单层组件39，这是 DIB 的先决条件。除了为双层形成加热外，形成后冷却膜还可用于识别单脂双层38中的热向过渡，包括天然脂质混合物（如BTLE）中难以使用热量测量检测的热向过渡。除了评估脂质的温电性过渡外， 精确改变DIB的温度可用于研究膜结构38 的温度诱发变化，并检查脂质组成和流动性如何影响膜活性物种的动力学（例如，孔隙形成肽和转膜蛋白37），包括哺乳动物和细菌模型膜在生理相关温度（37°C）。
在此，将解释如何组装经过改进的 DIB 油藏并操作反馈温度控制器，以便在高于 RT 的温度下实现单层组件和双层地层的形成。与以前的第40号议定书不同，在油藏DIB的组装和定性的同时，对测量和控制温度所需的仪器进行了整合，其中包括了明确的细节。因此，该过程将使用户能够应用此方法在各种科学环境中在各种温度下形成和研究 DIB。此外，具有代表性的结果为膜结构和离子传输中可能因温度变化而发生的可测量变化类型提供了具体示例。这些技术是许多生物物理研究的重要补充，这些研究可以在DIB中有效设计和执行，包括研究不同膜成分中膜活性物种的动力学。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

用于组装脂质双层的液滴接口双层 （DIB） 方法 （即， 与其它方法相比，油中脂质涂层水滴之间的 DIB 具有关键益处：DIB 是稳定的，而且通常具有持久性，双层区域可以逆向调整，传单不对称很容易通过液滴成分控制，并且通过相邻的许多液滴可以获得类似组织的双层水滴网络。形成 DIB 需要在液滴表面自发地将脂质组装成高密度脂质单层。虽然这在室温下很容易发生，但足够的单层或稳定的双层纤维不能在类似条件下形成，其熔点高于室温，包括一些细胞脂质提取物。这种行为可能限制了模型膜研究中DIB的组成——或许还有生物学相关性。为了解决这个问题，提出了一个实验方案，以仔细加热油藏托管DIB液滴，并描述温度对脂质膜的影响。具体来说，此协议展示了如何使用反馈环控制的热导电铝夹具和电阻加热元件来规定温度升高，从而改善单层组件和双层形成，用于更广泛的脂质类型。通过测量 DIB 电容的变化，可以量化膜的结构特征以及由双层纤维组成的脂质的温相过渡。该程序有助于评估模型膜中不同温度的生物物理现象，包括确定多成分脂质混合物的有效熔化温度（TM）。因此，这种能力将允许在模型膜中更密切地复制自然相位转换，并鼓励从更广泛的膜成分（包括那些能够更好地捕获其细胞对应体异质性）形成和使用模型膜。

图1显示了铝夹具和丙烯酸油储层是如何在显微镜阶段为DIB形成准备的。装配步骤 1.2-1.4 用于将固定装置与舞台隔热，以便更高效地加热。步骤 1.5-1.7 显示如何正确地将热电偶连接到夹具上并定位油藏，步骤 1.8 -1.9 显示将油分配到这些部件中的建议位置。
图 2 概述用于建立反馈温度控制并在 DIB 上执行电气测量的组件：PC、固定增?...

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Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

该协议详细说明了使用反馈温度控制加热系统来促进脂质单层组件和液滴接口双层形成，用于熔化温度升高的脂质，以及电容测量，以描述膜中温度驱动的变化。

温度控制组件和液滴接口比莱耶的特征

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

该协议使研究人员能够精确加热液滴接口双层，或DIB，模型膜，这允许研究在细胞环境中发生的各种温度相关的影响。核心优势在于能够在不妨碍 DIB 电气或光学特征访问的情况下，对小容量储层中的浴缸温度进行局部测量和控制。精确加热流体浴的能力开启了研究由更广泛的膜成分（包括天然细胞提取物）形成的 DIB 中的传输和信号特性的可能性。这是一个多步骤协议，利用多个设备，必须密切跟踪，以实现足够的实验精度，因此，任何模糊的书面过程可以通过视觉演示来澄清。开始收集两块一毫米厚的绝缘橡胶，修剪成25乘40毫米长，两块6毫米厚的橡胶，也是25乘40毫米，一个准备好的铝基夹具组装，和一个丙烯酸油藏，适合铝基夹具的观景窗。将较薄的橡胶片放在显微镜的舞台上，使每块橡胶片的长边与舞台开口切线相切。将铝基夹具放置在绝缘垫的顶部，夹具的查看窗口位于目标镜头上方。在每个电阻加热元件上放置一块较厚的橡胶，然后使用显微镜舞台夹将其保持到位，以保护加热元件免受舞台夹造成的损坏，并绝缘以防止意外的电气短路。小心地弯曲热电偶的测量端，在距离末端约四毫米时实现 90 度角。将热电偶的弯曲尖端插入铝夹具的左下角，用锁螺丝轻轻固定。在将六角油添加到铝夹具的油井中之前，将丙烯酸储层放入铝夹具的井中，以最大限度地降低在观景窗和丙烯酸储层底部之间捕获气泡的风险。将大约 1000 微升六甲基蔗油放入铝夹具的井中，以提供最大表面面积，以便进行传热，同时不允许油溢出夹具的边缘到显微镜舞台或客观透镜上。将大约1000微升六角蔗油放入丙烯酸储层，而不会过度填充。测量膜的名义电容，同时从允许双层形成的设定点降低油浴温度，以识别膜中脂质的温相过渡。右键单击GUI上的温度图，并清除显示数据，以确保缓冲区有足够的空间用于后续记录。使用连接到贴片夹放大器的波形发生器，在液滴接口双层或 DIB、电极上应用三角电压波形，并通过双层器记录诱导电流响应。通过以五度增量降低设定点温度来冷却双层，在新的稳定状态温度下等待至少五分钟，直到达到所需的温度。在油浴并将双层冷却到所需的最低温度后，再次右键单击GUI中的温度图，并将温度数据与时间一起导出到电子表格软件。停止当前录制。从测量的电流中，计算平方波电流响应与冷却期间时间的名义电容。绘制名义电容与温度，观察膜电容的变化，然后定位电容与温度的非单调变化，以确定熔化温度。同样，通过连续增加油浴和双层区域的温度，评估双层在固定温度下的准静电位电容。使用GUI以10摄氏度的增量更改设定点温度，使系统与新温度相等。执行先前描述的步骤，以启动电容电流和记录的测量。使用微型操纵器仔细调整电极的位置，改变双层区域。允许方波电流达到稳定的状态振幅并收集 DIB 的图像，以便计算膜面积与时间。使用安装在显微镜上的摄像机对从光圈看到的双层进行成像。同时将数字标签添加到当前录制软件中，以标记图像收集的相应时间点。共获取五张 DIB 图像和双层电流的稳定状态区域，然后重置温度并重复成像。在与稳定状态双层区域相对应的标记时间点分析当前记录和 DIB 图像，提取每种温度的双层电容和区域。绘制每个温度的电容与面积，并计算第一个顺序回归的斜率，该坡度表示每种温度下双层的特定电容。然后绘制特定电容与各自温度的绘图值。检查特定电容与温度数据，以识别非单调变化，以确定融化的温度。通过在双层中生成直流电压步进，评估电压依赖离子通道形成的动态。将初始电压设置为所需的毫伏步值，将最终电压和步幅大小设置为高于所需步骤的值。在几秒钟内为步骤输入设置所需的持续时间，然后为步输入选择所需的极性。切换贴片夹放大器，将来自实验室视图或电压输出模块的命令电压发送到头部阶段，打开电压并记录诱导电流响应，这应抑制 S 形对临界电压的反应。单独在所需的温度下为膜获取动态电流电压关系，以揭示电压依赖关系，如离子通道行为。切换贴片夹放大器，将来自波形发生器的命令电压发送到头部阶段，并启动电流记录。在波形发生器上，输出具有所需振幅、偏移和频率的连续鼻窦波形。记录一个或多个周期的诱导电流响应，并根据需要重复不同的西恩波振幅、频率和温度。温度控制系统用于显示由大脑总脂质提取物（BTLE）形成的DIB的温度依赖性。电容电流和温度与时间的测量显示在从室温到约 60 摄氏度的加热周期中。记录了在60摄氏度的初始双层形成后，一个完整的冷却/加热周期的名义电容与温度的变化。在不同温度下对特定电容的准静态测量可用于识别脂质熔化温度。绘制双层与双层区域的电容允许线性回归，其中坡度表示特定电容值。DIB 图像显示，当温度低于熔化温度时，膜采用高度粘合状态，即使在由分离良好的电极导致的拉伸液滴的张力下也是如此。显示的电流与电压痕迹是通过施加鼻窦膜电压来获得的，该电流在两种不同的温度下测量诱导电流。箭头和随后的数字有助于可视化鼻窦电压在时间上的连续季度。此处显示了在同一电压水平和两种不同温度下单一异虫素掺杂 BTLE 膜的测量电流密度。正确将六角油分配到铝夹具的井中至关重要。如果这样做不合时宜或不仔细，气泡将在丙烯酸井下形成，这将阻碍DIB的自下而上视图。用户还必须记住在每次测量之前清除温度控制软件中的数据缓冲区，以确保完整记录。此过程允许对一系列温度的生物仿生膜进行特征化，这是研究膜结构和运输温度依赖性所需。此外，该功能还可用于揭示其他膜活性物种的纳米级效应，如生物离子通道和工程纳米材料。

Research

JoVE Journal

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