Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
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Finanzielle Unterstützung wurde durch den National Science Foundation Grant CBET-1752197 und das Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213 gewährt.

1. Beheizte Vorrichtungsvorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie 2 Stück von 1 mm dicken isolierenden Gummi auf 25 mm x 40 mm in der Breite und Länge getrimmt, 2 Stück eines 6 mm dicken Gummis, die auch 25 mm x 40 mm sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung und ein Acrylölreservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basishalterung passt (siehe Abbildungen S1, S2 und S3 für Details zur Fertigung und eine explosionsartige Ansicht der Montage). Bereiten Sie die Aluminiumhalterung zuerst vor, in...

Das hier beschriebene Protokoll enthält Anweisungen für die Montage und den Betrieb eines experimentellen Systems zur Steuerung der Temperatur des Öls und der Tröpfchen, die zur Bildung von DIBs verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft für die Aktivierung der DIB-Bildung mit Lipiden, die Schmelztemperaturen über RT haben. Darüber hinaus kann durch präzise Variation der Temperatur des Ölreservoirs die Doppelschichttemperatur manipuliert werden, um die Auswirkungen erhöhter Temperaturen auf verschiedene Mem...

Zellmembranen sind selektiv durchlässige Barrieren, die aus Tausenden von Lipidtypen1,Proteinen, Kohlenhydraten und Sterolen bestehen, die alle lebenden Zellen verkapseln und unterteilen. Zu verstehen, wie ihre Zusammensetzungen ihre Funktionen beeinflussen, und zu zeigen, wie natürliche und synthetische Moleküle mit Zellmembranen interagieren, anhaften, stören und translozieren, sind daher wichtige Forschungsbereiche mit weitreichenden Implikationen in Biologie, Medizin, Chemie, Physik und Materialtechnik.
Diese Entdeckungsziele profitieren direkt von bewährten Techniken zur Montage, Manipulation und Untersuchung von Modellmembranen – einschließlich Lipid-Doppelschichten, die aus synthetischen oder natürlich vorkommenden Lipiden zusammengesetzt sind –, die die Zusammensetzung, Struktur und Transporteigenschaften ihrer zellulären Gegenstücke imitieren. In den letzten Jahren hat die Droplet-Schnittstelle Bilayer (DIB) Methode2,3,4 für den Bau einer planaren Lipid-Bilayer zwischen lipidbeschichteten Wassertröpfchen in Öl hat erhebliche Aufmerksamkeit erhalten5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, und hat praktische Vorteile gegenüber anderen Ansätzen für die Modellmembranbildung gezeigt: die DIB-Methode ist einfach durchzuführen, erfordert keine ausgeklügelte Herstellung oder Zubereitung (z. B. "Lackierung") eines Substrats zur Unterstützung der Membran, liefert durchgängig Membranen mit überlegenen Langlebigkeit, ermöglicht Standard-Elektrophysiologie-Messungen und vereinfacht die Bildung von Modellmembranen mit asymmetrischen Packungsbeilage-Zusammensetzungen3. Da sich die Bilayer spontan zwischen Tröpfchen und jedem Tröpfchen in Position und Make-up maßgeschneidert werden können, Die DIB-Technik hat auch großes Interesse an der Entwicklung von zellinspirierten Materialsystemen geweckt, die auf der Verwendung von Reizen-responsiven Membranen18,24,25,26,27,28,29, ausgewogene Abschottung und Transport14,30,31, und gewebeähnliche Materialien17,23,32,33,34,35,36.
Die meisten veröffentlichten Experimente an Modellmembranen, einschließlich der er mit DIBs, wurden bei Raumtemperatur (RT, 20-25 °C) und mit einer Handvoll synthetischer Lipide (z. B. DOPC, DPhPC usw.) durchgeführt. Diese Praxis begrenzt den Umfang biophysikalischer Fragen, die in Modellmembranen untersucht werden können, und kann, basierend auf Beobachtung, auch die Arten von Lipiden einschränken, die zur Montage von DIBs verwendet werden können. Beispielsweise montiert ein synthetisches Lipid wie DPPC, das eine Schmelztemperatur von 42 °C hat, keine eng gepackten Monolayer oder bildet DIBs bei RT37. Die DIB-Bildung bei Raumtemperatur hat sich auch für natürliche Extrakte als schwierig erwiesen, z. B. von Säugetieren (z. B. Gehirn-Gesamtfettextrakt, BTLE)38 oder Bakterien (z.B. Escherichia coli Total LipidExtrakt, ETLE)37, die viele verschiedene Arten von Lipiden enthalten und von Zellen stammen, die bei erhöhten Temperaturen (37 °C) leben. Die Ermöglichung des Studiums unterschiedlicher Zusammensetzungen bietet somit die Möglichkeit, membranvermittelte Prozesse unter biologisch relevanten Bedingungen zu verstehen.
Die Erhöhung der Temperatur des Öls kann zwei Zwecken dienen: Es erhöht die Kinetik der Monolayer-Montage und es kann dazu führen, dass Lipide einen Schmelzübergang durchlaufen, um eine flüssige ungeordnete Phase zu erreichen. Beide Folgen helfen in der Monolayer-Baugruppe39, eine Voraussetzung für ein DIB. Neben der Erwärmung für die Bilayer-Bildung kann die Kühlung der Membran nach der Bildung verwendet werden, um thermotrope Übergänge in einzelnen Lipid-Doppelschichten38zu identifizieren, einschließlich derjenigen in natürlichen Lipidmischungen (z. B. BTLE), die mit Kalorimetrie schwer zu erkennen sind. Neben der Beurteilung thermotroper Lipidübergänge kann die Temperatur des DIB genau variieren, um temperaturinduzierte Veränderungen der Membranstruktur38 zu untersuchen und zu untersuchen, wie Lipidzusammensetzung und Fließfähigkeit die Kinetik membranaktiver Arten (z. B. porenbildende Peptide und Transmembranproteine37) beeinflussen, einschließlich Säugetier- und Bakterienmodellmembranen bei einer physiologisch relevanten Temperatur (37 °C).
Hierin wird eine Beschreibung der Montage eines modifizierten DIB-Ölbehälters und des Betriebs eines Rückkopplungs-Temperaturreglers erläutert, um die Monolayer-Montage und Bilayer-Bildung bei Temperaturen über RT zu ermöglichen. Von einem früheren Protokoll40unterscheidet, sind explizite Details über die Integration von Instrumenten enthalten, die für die Messung und Regelung der Temperatur parallel zur Montage und Charakterisierung des DIB im Ölreservoir erforderlich sind. Das Verfahren wird es dem Anwender somit ermöglichen, diese Methode zur Bildung und Untersuchung von DIBs über einen Temperaturbereich in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Kontexten anzuwenden. Darüber hinaus liefern die repräsentativen Ergebnisse spezifische Beispiele für die Arten messbarer Veränderungen sowohl in der Membranstruktur als auch im Ionentransport, die bei unterschiedlicher Temperatur auftreten können. Diese Techniken sind wichtige Ergänzungen zu den vielen biophysikalischen Studien, die effektiv in DIBs entworfen und durchgeführt werden können, einschließlich der Untersuchung der Kinetik membranaktiver Arten in verschiedenen Membranzusammensetzungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

Die Droplet Interface Bilayer (DIB)-Methode zur Montage von Lipid-Doppelschichten (d.h. DIBs) zwischen lipidbeschichteten wässrigen Tröpfchen in Öl bietet im Vergleich zu anderen Methoden wichtige Vorteile: DIBs sind stabil und oft langlebig, bilayerBereich kann reversibel abgestimmt werden, Prospektasymmetrie wird leicht über Tröpfchenzusammensetzungen gesteuert und gewebeähnliche Netzwerke von Doppeltöten können durch angrenzende. Die Bildung von DIBs erfordert eine spontane Montage von Lipiden in hochdichte Lipidmonolayer an den Oberflächen der Tröpfchen. Während dies bei gemeinsamen synthetischen Lipiden leicht bei Raumtemperatur vorkommt, bildet sich bei Lipiden mit Schmelzpunkten oberhalb der Raumtemperatur, einschließlich einiger zellulärer Lipidextrakte, keine ausreichende Monoschicht oder stabile Doppelschicht. Dieses Verhalten hat wahrscheinlich die Zusammensetzungen – und vielleicht die biologische Relevanz – von DIBs in Modellmembranstudien eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, wird ein experimentelles Protokoll vorgelegt, um das Ölreservoir, das DIB-Tröpfchen beherbergt, sorgfältig zu erwärmen und die Auswirkungen der Temperatur auf die Lipidmembran zu charakterisieren. Insbesondere zeigt dieses Protokoll, wie eine thermisch leitfähige Aluminiumhalterung und resistive Heizelemente, die durch eine Rückkopplungsschleife gesteuert werden, verwendet werden, um erhöhte Temperaturen vorzuschreiben, was die Monolayer-Montage und Diebesbildung für einen breiteren Satz von Lipidtypen verbessert. Die strukturellen Eigenschaften der Membran sowie die thermotropen Phasenübergänge der Lipide, die die Bilayer umfassen, werden durch Messung der Veränderungen der elektrischen Kapazität des DIB quantifiziert. Zusammen kann dieses Verfahren bei der Bewertung biophysikalischer Phänomene in Modellmembranen über verschiedene Temperaturen helfen, einschließlich der Bestimmung einer effektiven Schmelztemperatur (TM) für Mehrkomponenten-Lipidmischungen. Diese Fähigkeit wird somit eine engere Replikation natürlicher Phasenübergänge in Modellmembranen ermöglichen und die Bildung und Verwendung von Modellmembranen aus einem größeren Spektrum von Membranbestandteilen fördern, einschließlich derjenigen, die die Heterogenität ihrer zellulären Gegenstücke besser erfassen.

Abbildung 1 zeigt, wie die Aluminiumhalterung und das Acrylölreservoir auf der Mikroskopbühne auf die DIB-Bildung vorbereitet werden. Die Montageschritte 1.2-1.4 dienen dazu, die Leuchte von der Bühne für eine effizientere Erwärmung wärmezudämmen. Die Schritte 1.5-1.7 zeigen, wie das Thermoelement richtig an der Halterung befestigt und das Ölreservoir positioniert wird, und die Schritte 1.8 -1.9 zeigen empfohlene Orte für die Ölabgabe in diese Teile an.
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Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines temperaturgesteuerten Wärmesystems zur Förderung der Lipid-Monolayer-Montage und der Tröpfchen-Schnittstellen-Bilayerbildung für Lipide mit erhöhten Schmelztemperaturen und Kapazitätsmessungen zur Charakterisierung temperaturgetriebener Veränderungen in der Membran.

Temperaturgesteuerte Montage und Charakterisierung eines Droplet Interface Bilayers

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, eine Dialet-Schnittstelle Bilayer, oder DIB, Modellmembran präzise zu erwärmen, die es ermöglicht, eine Vielzahl von temperaturbedingten Effekten zu untersuchen, die in zellulären Umgebungen auftreten. Der Hauptvorteil ergibt sich aus der Möglichkeit, die Badtemperatur in einem Low-Volume-Reservoir lokal zu messen und zu steuern, ohne den Zugang zu den elektrischen oder optischen Charakterisierungen des DIB zu behindern. Die Fähigkeit, das Flüssigkeitsbad präzise zu erwärmen, eröffnet die Möglichkeit, die Transport- und Signaleigenschaften in DIBs zu untersuchen, die aus einer viel größeren Vielfalt von Membranbestandteilen, einschließlich natürlicher Zellextrakte, gebildet werden.Dies ist ein mehrstufiges Protokoll, das mehrere Geräte nutzt, die genau befolgt werden müssen, um eine ausreichende experimentelle Genauigkeit zu erreichen, so dass jede Mehrdeutigkeit im schriftlichen Prozess durch visuelle Demonstration geklärt werden kann. Zu Beginn sammeln zwei Stücke von einem Millimeter dicken isolierenden Gummi auf 25 x 40 Millimeter Länge getrimmt, zwei Stücke eines sechs Millimeter dicken Gummis, die auch 25 x 40 Millimeter sind, eine vorbereitete Aluminium-Basisbefestigung Sondenbau, und ein Acrylöl-Reservoir, das in das Sichtfenster der Aluminium-Basisvorrichtung passt. Legen Sie die dünneren Gummistücke auf die Bühne des Mikroskops, so dass die lange Kante jedes Stückes tangential zur Bühnenöffnung ist.Positionieren Sie die Aluminium-Basishalterung auf den isolierenden Pads mit dem Sichtfenster der Leuchte zentriert über der Objektivlinse. Legen Sie ein dickeres Stück Gummi auf jedes widerstandsfähige Heizelement und verwenden Sie einen Mikroskop-Bühnenclip, um es an Ort und Stelle zu halten, um die Heizelemente vor Schäden durch die Bühnenclips zu schützen und um vor versehentlicher elektrischer Kurzarbeit zu isolieren. Biegen Sie vorsichtig das Messende eines Thermoelements, um einen 90-Grad-Winkel bei etwa vier Millimetern vom Ende zu erreichen.Setzen Sie die gebogene Spitze des Thermoelements in die linke untere Ecke der Aluminiumhalterung ein und befesteinzige Sie sie vorsichtig mit einer Verriegelungsschraube. Legen Sie das Acrylreservoir in den Brunnen der Aluminiumhalterung, bevor Sie dem Bohrkorb der Aluminiumhalterung Hexadecanöl hinzufügen, um das Risiko zu minimieren, Luftblasen zwischen dem Sichtfenster und dem Boden des Acrylbehälters einzufangen. Geben Sie etwa 1.000 Mikroliter Hexadecanöl in den Brunnen der Aluminiumhalterung, um eine maximale Oberfläche für die Wärmeübertragung zu bieten, ohne dass Öl über die Ränder der Leuchte auf die Mikroskopbühne oder objektive Linse austreten kann.Ca. 1.000 Mikroliter Hexadecanöl in das Acrylreservoir geben, ohne es zu überfüllen. Messen Sie die Nominelle Kapazität der Membran und senken Sie gleichzeitig die Temperatur des Ölbades von einem Sollwert, der die Bilayerbildung ermöglicht, thermotrope Phasenübergänge der Lipide in der Membran zu identifizieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Temperaturdiagramm auf der GUI, und löschen Sie die Anzeigedaten, um sicherzustellen, dass genügend Platz im Puffer für nachfolgende Aufnahmen zur Verfügung steht.Wenden Sie mit dem an den Patchklemmenverstärker angeschlossenen Wellengenerator eine dreieckige Spannungswellenform über die Tröpfchenschnittstelle Bilayer oder DIB-Elektroden an und zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion durch die Bilayer auf. Kühlen Sie die Doppelschicht, indem Sie die Solltemperatur in Fünf-Grad-Schritten reduzieren und bei der neuen Konstanttemperatur zwischen Temperaturänderungen mindestens fünf Minuten warten, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist. Nach dem Ölbad und dem Abkühlen der Bilayer auf die gewünschte Mindesttemperatur, klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf das Temperaturdiagramm in der GUI und exportieren Sie die Temperaturdaten im Vergleich zur Zeit in eine Tabellenkalkulationssoftware.Beenden Sie die aktuelle Aufzeichnung. Berechnen Sie aus dem gemessenen Strom die nominale Kapazität der quadratischen Wellenstromantwort im Vergleich zur Zeit während der Kühlperiode. Plotten Sie die nominale Kapazität versus Temperatur, um zu beobachten, wie sich die Membrankapazität veränderte, und lokalisieren Sie dann nicht-monotone Veränderungen der Kapazität im Vergleich zur Temperatur, um die Schmelztemperatur zu identifizieren.In ähnlicher Weise bewerten Sie die quasi statisch-spezifische Kapazität der Bilayer bei festen Temperaturen, indem Sie die Temperatur des Ölbades und des Doppelschichtbereichs sukzessive erhöhen. Ändern Sie die Solltemperatur in 10-Grad-Celsius-Schritten mit der GUI und ermöglichen Sie dem System, sich mit der neuen Temperatur auszurichten. Führen Sie zuvor beschriebene Schritte aus, um die Messung des kapazitiven Stroms und der Aufzeichnung zu initiieren.Ändern Sie den Bilayer-Bereich, indem Sie die Positionen der Elektroden mit den Mikromanipulatoren sorgfältig anpassen. Ermöglichen Sie es, dass der quadratische Wellenstrom eine stationäre Amplitude erreicht und Bilder des DIB sammelt, um die Berechnung der Membranfläche im Vergleich zur Zeit zu ermöglichen. Verwenden Sie eine am Mikroskop montierte Kamera, um die Bilayer aus der Blende zu fotografieren.Fügen Sie der aktuellen Aufnahmesoftware gleichzeitig ein digitales Tag hinzu, um den entsprechenden Zeitpunkt für die Bildsammlung zu markieren. Erhalten Sie insgesamt fünf DIB-Bilder und stationäre Bereiche des Bilayer-Stroms, setzen Sie dann die Temperatur zurück und wiederholen Sie die Bildgebung. Analysieren Sie die aktuellen Aufzeichnungen und DIB-Bilder an den markierten Zeitpunkten, die den stationären Bilayer-Bereichen entsprechen, extrahieren Sie die zweischichtige Kapazität und die Fläche für jede Temperatur.Plotten Sie Kapazität im Vergleich zu Fläche für jede Temperatur und berechnen Sie die Steigung der Regression erster Ordnung, die die spezifische Kapazität des Doppellayers bei jeder Temperatur darstellt. Zeichnen Sie dann Werte bestimmter Kapazität im Vergleich zu ihren jeweiligen Temperaturen. Untersuchen Sie die spezifischen Kapazitäts- und Temperaturdaten auf nicht-monotone Schwankungen, um Schmelztemperaturen zu identifizieren.Bewerten Sie die Dynamik der spannungsabhängigen Ionenkanalbildung, indem Sie einen DC-Spannungsschritteingang über die Bilayer generieren. Stellen Sie die Anfangsspannung auf den gewünschten Schrittwert in Millivolt und die Endspannung und Schrittgröße auf einen Wert höher als der gewünschte Schritt. Legen Sie die gewünschte Dauerzeit für die Schritteingabe in Sekunden fest, und wählen Sie dann die gewünschte Polarität für die Schritteingabe aus.Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die Befehlsspannung aus der Laboransicht oder dem Spannungsausgangsmodul an die Kopfstufe zu senden, schalten Sie die Spannung ein und zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion auf, die eine S-förmige Reaktion auf eine kritische Spannung hemmen sollte. Erhalten Sie separat dynamische Stromspannungsbeziehungen für eine Membran bei gewünschten Temperaturen, um spannungsabhängige Beziehungen wie Ionenkanalverhalten aufzuzeigen. Schalten Sie den Patchklemmenverstärker, um die vom Wellenformgenerator ausgehende Befehlsspannung an die Kopfstufe zu senden und Stromaufzeichnungen zu initiieren.Geben Sie am Wellenformgenerator eine kontinuierliche sinusförmige Wellenform mit einer gewünschten Amplitude, Einem Offset und einer Frequenz aus. Zeichnen Sie die induzierte Stromreaktion über einen oder mehrere Zyklen auf und wiederholen Sie sie nach Belieben für verschiedene Sinuswellenamplituden, Frequenzen und Temperaturen. Das Temperaturregelungssystem wurde verwendet, um die Temperaturabhängigkeit eines DIB zu zeigen, das aus dem Gesamtfettextrakt des Gehirns oder BTLE-Lipiden gebildet wird.Messungen von kapazitivem Strom und Temperatur im Vergleich zur Zeit werden während eines Heizzyklus von Raumtemperatur bis ca. 60 Grad Celsius angezeigt. Veränderungen der Nennkapazität gegenüber der Temperatur über einen kompletten Kühl-/Heizzyklus nach anfänglicher Bilayerbildung bei 60 Grad Celsius wurden dokumentiert. Quasistatische Messungen spezifischer Kapazität bei unterschiedlichen Temperaturen können verwendet werden, um lipidschmelzende Temperaturen zu identifizieren.Die Plotatitanz eines Bilayer-Gegen-Zweischichtbereichs ermöglicht eine lineare Regression, bei der die Neigung den Wert einer bestimmten Kapazität darstellt. Das DIB-Bild zeigt, dass die Membran, wenn die Temperatur unter der Schmelztemperatur liegt, einen hochklebenden Zustand annimmt, selbst unter Spannung von gestreckten Tröpfchen, die durch gut getrennte Elektroden verursacht werden. Die dargestellten Strom-Spannungs-Spuren wurden durch Anwendung sinusförmiger Membranspannungen ermittelt, die den induzierten Strom bei zwei verschiedenen Temperaturen messen.Die Pfeile und nachfolgenden Zahlen helfen bei der Visualisierung der aufeinanderfolgenden Viertel der sinusförmigen Spannung in Bezug auf die Zeit. Die gemessene Stromdichte für eine monazomycindotierte BTLE-Membran auf dem gleichen Spannungsniveau und zwei unterschiedlichen Temperaturen wird hier gezeigt. Es ist wichtig, das Hexadecanöl richtig in den Brunnen der Aluminiumhalterung zu geben.Wenn dies abl. oder nicht sorgfältig geschieht, bilden sich Luftblasen unter dem Acrylbrunnen, was die Bottom-up-Ansicht des DIB behindert. Der Benutzer muss auch daran denken, den Datenpuffer in der Temperaturregelungssoftware vor jeder Messung zu löschen, um eine vollständige Aufzeichnung zu gewährleisten. Dieses Verfahren ermöglicht die Charakterisierung biomimetischer Membranen über einen Temperaturbereich hinweg, der zur Untersuchung der Temperaturabhängigkeit von Membranstruktur und -transport erforderlich ist.Darüber hinaus könnte diese Fähigkeit genutzt werden, um nanoskalige Effekte anderer membranaktiver Arten, wie biologische Ionenkanäle und technisch hergestellte Nanomaterialien, aufzudecken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Forschung

Biotechnik

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Fluorescence Recovery nach der Zusammenführung ein Droplet, um die zweidimensionale Diffusion eines Phospholipidschicht Messen

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Herstellung und Charakterisierung von optischen Gewebe Phantome, die Makrostruktur enthalten

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Montage und Charakterisierung der biomolekularen Memristors bestehend aus Ionenkanal-dotierte Lipidmembranen

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...