Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
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वित्तीय सहायता राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रांट CBET-1752197 और वैज्ञानिक अनुसंधान अनुदान FA9550-19-1-0213 के वायु सेना कार्यालय द्वारा प्रदान की गई थी ।

1. गर्म स्थिरता की तैयारी
<ol><li>चौड़ाई और लंबाई में 25 मिमी x 40 मिमी करने के लिए छंटनी की गई 1 मिमी मोटी इंसुलेटिव रबर के 2 टुकड़े इकट्ठा करें, क्रमशः, एक 6 मिमी मोटी रबर के 2 टुकड़े जो 25 मिमी x 40 मिमी, एक तैयार एल्यूमी...

यहां वर्णित प्रोटोकॉल DIBs बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले तेल और बूंदों के तापमान को नियंत्रित करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली को कोडांतरण और संचालन के लिए निर्देश प्रदान करता है। यह विशेष रूप से डी?...

सेलुलर झिल्ली चुनिंदा पार पार होती बाधाएं होती हैं जिनमें हजारों लिपिड प्रकार1,प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट और स्टेरोल होते हैं जो सभी जीवित कोशिकाओं को समझाते और उपविभाजन करते हैं। यह समझना कि उनकी रचनाएं उनके कार्यों को कैसे प्रभावित करती हैं और यह खुलासा करती हैं कि प्राकृतिक और सिंथेटिक अणु कैसे बातचीत करते हैं, उनका पालन करते हैं, बाधित करते हैं, और स्थानांतरित सेलुलर झिल्ली, इसलिए, जीव विज्ञान, चिकित्सा, रसायन विज्ञान, भौतिकी और सामग्री इंजीनियरिंग में व्यापक प्रभावों के साथ अनुसंधान के महत्वपूर्ण क्षेत्र हैं।
ये खोज के लिए सीधे मॉडल झिल्ली कोडांतरण, हेरफेर, और अध्ययन के लिए सिद्ध तकनीकों से लाभ के लिए उद्देश्य-लिपिड bilayers सिंथेटिक या स्वाभाविक रूप से होने वाली लिपिड से इकट्ठे सहित-कि संरचना, संरचना, और उनके सेलुलर समकक्षों के परिवहन गुणों की नकल । हाल के वर्षों में, तेल में लिपिड-लेपित पानी की बूंदों के बीच एक प्लैनर लिपिड बाइलेयर के निर्माण के लिए ड्रॉपलेट इंटरफेस बाइलेयर (डीआईबी) विधि2,3,4 में महत्वपूर्ण ध्यान प्राप्त हुआ है5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20,21,22,23,और मॉडल झिल्ली गठन के लिए अन्य दृष्टिकोणों पर व्यावहारिक लाभ का प्रदर्शन किया है: डीआईबी विधि प्रदर्शन करने के लिए सरल है, कोई परिष्कृत निर्माण या तैयारी की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, झिल्ली का समर्थन करने के लिए एक सब्सट्रेट की "पेंटिंग"), लगातार बेहतर के साथ झिल्ली पैदा होती है दीर्घायु, मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी माप के लिए अनुमति देता है, और असममित पत्रकरचनाओं 3के साथ मॉडल झिल्ली के गठन को सरल बनाता है । क्योंकि बाईलेयर बूंदों के बीच अनायास रूपों और प्रत्येक बूंद स्थिति और श्रृंगार में सिलवाया जा सकता है, डीआईबी तकनीक ने सेल-प्रेरित सामग्री प्रणालियों को विकसित करने में भी काफी रुचि दिखाई है जो उत्तेजनाओं-उत्तरदायी झिल्ली18,24,25, 26,27,28,28के उपयोग पर निर्माण करतीहैं।29, संतुलित कंपार्टमेंटलाइजेशन और परिवहन14,30,31,और ऊतक जैसी सामग्री17,23,32,33,34,35, 36,36.
मॉडल झिल्ली पर प्रकाशित प्रयोगों के बहुमत, DIBs के साथ उन सहित, कमरे के तापमान (आर टी, ~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) और सिंथेटिक लिपिड (जैसे, DOPC, DPhPC, आदि) की एक मुट्ठी भर के साथ प्रदर्शन किया गया है । यह अभ्यास जैव भौतिक प्रश्नों के दायरे को सीमित करता है जिनका मॉडल झिल्ली में अध्ययन किया जा सकता है और अवलोकन के आधार पर, यह उन लिपिड के प्रकारों को भी प्रतिबंधित कर सकता है जिनका उपयोग DIBs को इकट्ठा करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, डीपीपीसी जैसे सिंथेटिक लिपिड, जिसमें पिघलने का तापमान 42 डिग्री सेल्सियस होता है, कसकर पैक किए गए मोनोलेयर को इकट्ठा नहीं करता है या आरटी37पर DIBs बनाते हैं। कमरे के तापमान पर DIB गठन भी प्राकृतिक अर्क के लिए मुश्किल साबित हो गया है, जैसे स्तनधारियों से उन (जैसे, मस्तिष्क कुल लिपिड निकालने, BTLE)३८ या बैक्टीरिया (जैसे, एस्चेरिचिया कोलाई कुल लिपिड निकालने, ETLE)३७,जो लिपिड के कई विभिंन प्रकार होते है और कोशिकाओं से निकलती है कि ऊंचा तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) पर रहते हैं । विविध रचनाओं के अध्ययन को सक्षम करना इस प्रकार जैविक रूप से प्रासंगिक स्थितियों में झिल्ली-मध्यस्थता प्रक्रियाओं को समझने के अवसर प्रदान करता है।
तेल के तापमान को बढ़ाने से दो उद्देश्यों की सेवा हो सकती है: यह मोनोलेयर असेंबली की गतिज को बढ़ाता है और यह तरल अव्यवस्थित चरण तक पहुंचने के लिए लिपिड को पिघलने वाले संक्रमण से गुजरना पड़ सकता है। दोनों परिणाम मोनोलेयर असेंबली39में सहायता करते हैं, जो एक डीआईबी के लिए पूर्व-अपेक्षित है। बिलेयर गठन के लिए हीटिंग के अलावा, गठन के बाद झिल्ली को ठंडा करने का उपयोग एकल लिपिड बिलेयर38में थर्मोट्रोपिक संक्रमण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्राकृतिक लिपिड मिश्रण (जैसे, बीएलईएल) शामिल हैं जो कैलोरीमेट्री का उपयोग करके पता लगाने में मुश्किल हो सकते हैं। लिपिड के थर्मोट्रोपिक संक्रमण का आकलन करने के अलावा, डिबी के तापमान को अलग करने के लिए झिल्ली संरचना38 में तापमान-प्रेरित परिवर्तनों का अध्ययन करने और यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि लिपिड संरचना और तरलता झिल्ली-सक्रिय प्रजातियों (जैसे, ताक-बनाने वाले पेप्टाइड्स और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन37)के गतिज को कैसे प्रभावित करती है, जिसमें स्तनधारी और जीवाणु मॉडल झिल्ली शामिल हैं।
इसके साथ ही, एक संशोधित डीआईबी तेल जलाशय को इकट्ठा करने और आरटी से अधिक तापमान पर मोनोलेयर असेंबली और बाइलेयर गठन को सक्षम करने के लिए फीडबैक-तापमान नियंत्रक को संचालित करने का विवरण समझाया जाएगा। पिछले प्रोटोकॉल40से प्रतिष्ठित, स्पष्ट विस्तार को तेल जलाशय में डीआईबी के असेंबली और लक्षण वर्णन के समानांतर तापमान को मापने और नियंत्रित करने के लिए आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन के एकीकरण के बारे में शामिल किया गया है। इस प्रकार प्रक्रिया एक उपयोगकर्ता को विभिन्न वैज्ञानिक संदर्भों में विभिन्न तापमानों में डीआईबी बनाने और अध्ययन करने के लिए इस विधि को लागू करने में सक्षम करेगी। इसके अलावा, प्रतिनिधि परिणाम झिल्ली संरचना और आयन परिवहन दोनों में औसत दर्जे के परिवर्तनों के प्रकारों के लिए विशिष्ट उदाहरण प्रदान करते हैं जो तापमान के विविध होने के रूप में हो सकते हैं। ये तकनीकें कई जैव भौतिक अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण अतिरिक्त हैं जिन्हें विभिन्न झिल्ली रचनाओं में झिल्ली-सक्रिय प्रजातियों के काइनेटिक्स का अध्ययन करने सहित डीआईबी में प्रभावी ढंग से डिजाइन और प्रदर्शन किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

लिपिड बिलेयर कोडांतरण के लिए ड्रॉपलेट इंटरफेस बाइलेयर (डीआईबी) विधि (यानी, तेल में लिपिड-लेपित जलीय बूंदों के बीच DIBs) अन्य तरीकों बनाम प्रमुख लाभ प्रदान करता है: DIBs स्थिर और अक्सर लंबे समय तक चलने वाले होते हैं, बिलेयर क्षेत्र को उलटफेर से ट्यून किया जा सकता है, पत्रक विषमता को बूंद रचनाओं के माध्यम से आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है, और कई बूंदों से सटे बिलेयर के ऊतकों की तरह नेटवर्क प्राप्त किया जा सकता है। DIBs बनाने के लिए बूंदों की सतहों पर उच्च घनत्व लिपिड मोनोलेयर में लिपिड की सहज असेंबली की आवश्यकता होती है। हालांकि यह आम सिंथेटिक लिपिड के लिए कमरे के तापमान पर आसानी से होता है, एक पर्याप्त मोनोलेयर या स्थिर बाइलेयर कमरे के तापमान के ऊपर पिघलने वाले बिंदुओं के साथ लिपिड के लिए समान स्थितियों पर बनाने में विफल रहता है, जिसमें कुछ सेलुलर लिपिड अर्क शामिल हैं। इस व्यवहार ने मॉडल झिल्ली अध्ययन में डीआईबी की रचनाओं और शायद जैविक प्रासंगिकता को सीमित कर दिया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को ध्यान से DIB बूंदों की मेजबानी तेल जलाशय गर्मी और लिपिड झिल्ली पर तापमान के प्रभाव की विशेषता के लिए प्रस्तुत किया जाता है । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि ऊंचा तापमान निर्धारित करने के लिए एक प्रतिक्रिया लूप द्वारा नियंत्रित थर्मल प्रवाहकीय एल्यूमीनियम स्थिरता और प्रतिरोधी हीटिंग तत्वों का उपयोग कैसे किया जाए, जो लिपिड प्रकारों के व्यापक सेट के लिए मोनोलेयर असेंबली और बाइलेयर गठन में सुधार करता है। झिल्ली की संरचनात्मक विशेषताओं के साथ-साथ बाइलेयर वाले लिपिड के थर्मोट्रोपिक चरण संक्रमण, डीआईबी की विद्युत क्षमता में परिवर्तन को मापकर मात्रा निर्धारित की जाती है। साथ में, यह प्रक्रिया विभिन्न तापमानों पर मॉडल झिल्ली में जैव भौतिक घटनाओं का मूल्यांकन करने में सहायता कर सकती है, जिसमें बहु-घटक लिपिड मिश्रण के लिए एक प्रभावी पिघलने का तापमान(टीएम)का निर्धारण शामिल है। इस प्रकार यह क्षमता मॉडल झिल्ली में प्राकृतिक चरण संक्रमणों की बारीकी से प्रतिकृति के लिए अनुमति देगी और झिल्ली घटकों की एक व्यापक कटी हुई घास से मॉडल झिल्ली के गठन और उपयोग को प्रोत्साहित करेगी, जिसमें वे शामिल हैं जो अपने सेलुलर समकक्षों की विषमता को बेहतर तरह से कैप्चर करते हैं।

चित्रा 1 से पता चलता है कि कैसे एल्यूमीनियम स्थिरता और एक्रेलिक तेल जलाशय DIB गठन के लिए माइक्रोस्कोप मंच पर तैयार कर रहे हैं । विधानसभा कदम 1.2-1.4 थर्मल अधिक कुशल हीटिंग के लिए मंच से स्थिरता को ब?...

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Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

यह प्रोटोकॉल एक प्रतिक्रिया तापमान नियंत्रित हीटिंग सिस्टम के उपयोग का विवरण लिपिड मोनोलेयर असेंबली और बूंद इंटरफ़ेस बाइलेयर गठन को बढ़ावा देने के लिए ऊंचा पिघलने वाले तापमान के साथ लिपिड के लिए, और झिल्ली में तापमान-चालित परिवर्तनों की विशेषता के लिए क्षमता माप।

तापमान नियंत्रित विधानसभा और एक बूंद इंटरफेस बिलेयर का लक्षण वर्णन

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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