Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
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O apoio financeiro foi fornecido pela National Science Foundation Grant CBET-1752197 e pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, Grant FA9550-19-1-0213.

1. Preparação aquecida da luminária
<ol><li>Reúna 2 peças de borracha isolante de 1 mm de espessura aparadas a 25 mm x 40 mm de largura e comprimento, respectivamente, 2 peças de borracha de 6 mm de espessura que também são de 25 mm x 40 mm, um conjunto de luminárias de alumínio preparadas e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio (ver Figuras S1, S2 e S3 para detalhes sobre a fabricação e uma visão explodida de montage...

O protocolo aqui descrito fornece instruções para a montagem e operação de um sistema experimental para controlar a temperatura do óleo e gotículas usadas para formar DIBs. É especialmente benéfico para permitir a formação de DIB usando lipídios que têm temperaturas de fusão acima de RT. Além disso, variando precisamente a temperatura do reservatório de óleo, a temperatura bicamada pode ser manipulada para estudar os efeitos das temperaturas elevadas em várias propriedades e características da membrana,...

As membranas celulares são barreiras seletivamente permeáveis compostas por milhares de lipídiostipos 1,proteínas, carboidratos e esteróis que encapsulam e subdividem todas as células vivas. Entender como suas composições afetam suas funções e revelar como moléculas naturais e sintéticas interagem, aderem, interrompem e translocam membranas celulares são, portanto, áreas importantes da pesquisa com implicações de grande alcance na biologia, medicina, química, física e engenharia de materiais.
Esses objetivos para a descoberta se beneficiam diretamente de técnicas comprovadas para montar, manipular e estudar membranas modelo — incluindo bicamadas lipídicas montadas a partir de lipídios sintéticos ou de ocorrência natural — que imitam as propriedades de composição, estrutura e transporte de suas contrapartes celulares. Nos últimos anos, o método bilayer de interface de gotícula (DIB)2,3,4 para a construção de um bicamado lipídeca planar entre gotículas de água revestidas de lipídios no óleo recebeu atenção significativa5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, e demonstrou vantagens práticas sobre outras abordagens para a formação de membrana modelo: o método DIB é simples de realizar, não requer fabricação ou preparação sofisticada (por exemplo, "pintura") de um substrato para suportar a membrana, consistentemente produz membranas com superior longevidade, permite medições de eletrofisiologia padrão, e simplifica a formação de membranas modelo com composições de folhetos assimétricos3. Como o bicamado se forma espontaneamente entre gotículas e cada gota pode ser adaptada em posição e maquiagem, a técnica DIB também atraiu considerável interesse no desenvolvimento de sistemas materiais inspirados em células que se baseiam no uso de membranas responsivas a estímulos18,24,25,26,27,28,2829, compartimentação e transporteequilibrados 14,30,31, e materiais semelhantes a tecidos17,23,32,33,34,35,36.
A maioria dos experimentos publicados em membranas de modelo, incluindo aqueles com DIBs, foram realizados à temperatura ambiente (RT, ~20-25 °C) e com um punhado de lipídios sintéticos (por exemplo, DOPC, DPhPC, etc.). Essa prática limita o escopo de questões biofísicas que podem ser estudadas em membranas modelo e, com base na observação, também pode restringir os tipos de lipídios que podem ser usados para montar DIBs. Por exemplo, um lipídio sintético como o DPPC, que tem uma temperatura de fusão de 42 °C, não monta monocamadas bem embaladas ou forma DIBs na RT37. A formação de DIB à temperatura ambiente também tem se mostrado difícil para extratos naturais, como os de mamíferos (por exemplo, extrato lipídico total cerebral, BTLE)38 ou bactérias (por exemplo, extrato lipídico total de Escherichia coli, ETLE)37, que contêm muitos tipos diferentes de lipídios e se originam de células que residem a temperaturas elevadas (37 °C). Viabilizar o estudo de diversas composições proporciona, assim, oportunidades de compreender processos mediados por membrana em condições biologicamente relevantes.
Elevar a temperatura do óleo pode servir a dois propósitos: aumenta a cinética da montagem de monocamadas e pode fazer com que os lipídios sejam submetidos a uma transição de fusão para chegar a uma fase desordenada líquida. Ambas as consequências auxiliam na montagem de monocamadas39, um pré-requisito para um DIB. Além do aquecimento para a formação de bicamadas, o resfriamento da membrana após a formação pode ser usado para identificar transições termotrópicas em bicamadas lipídicassimples 38, incluindo aquelas em misturas lipídicas naturais (por exemplo, BTLE) que podem ser difíceis de detectar usando a calorimetria. Além de avaliar transições termotrópicas de lipídios, precisamente variando a temperatura do DIB pode ser usado para estudar alterações induzidas pela temperatura na estrutura da membrana38 e examinar como a composição lipídica e a fluidez afetam a cinética de espécies ativas de membrana (por exemplo, peptídeos formadores de poros e proteínas transmembranas37),incluindo membranas de modelos mamíferos e bacterianos a uma temperatura fisiologicamente relevante (37 °C).
Aqui, uma descrição de como montar um reservatório de óleo DIB modificado e operar um controlador de temperatura de feedback para permitir a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas a temperaturas mais altas que a RT será explicada. Distinguido de um protocolo anterior40,é incluído detalhe explícito em relação à integração da instrumentação necessária para medir e controlar a temperatura paralelamente à montagem e caracterização do DIB no reservatório de petróleo. O procedimento permitirá, assim, que o usuário aplique este método para formar e estudar DIBs em uma variedade de temperaturas em uma variedade de contextos científicos. Além disso, os resultados representativos fornecem exemplos específicos para os tipos de alterações mensuráveis tanto na estrutura da membrana quanto no transporte de íons que podem ocorrer à medida que a temperatura é variada. Essas técnicas são importantes adições aos muitos estudos biofísicos que podem ser projetados e realizados efetivamente em DIBs, inclusive estudando a cinética de espécies membrana-ativas em diferentes composições de membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

O método de bicamadas de interface de gota (DIB) para a montagem de bicamadas lipídicas (ou seja, DIBs) entre gotículas aquosas revestidas de lipídios no óleo oferece benefícios importantes em relação a outros métodos: os DIBs são estáveis e, muitas vezes, a área bicamada de longa duração pode ser reversivelmente ajustada, a assimetria de folhetos é facilmente controlada através de composições de gotículas, e redes semelhantes a tecidos de bicamadas podem ser obtidas por muitas gotículas adjacentes. A formação de DIBs requer montagem espontânea de lipídios em monocamadas lipídicas de alta densidade nas superfícies das gotículas. Embora isso ocorra prontamente à temperatura ambiente para lipídios sintéticos comuns, uma monocamide ou bicamadas estáveis suficientes não se formam em condições semelhantes para lipídios com pontos de fusão acima da temperatura ambiente, incluindo alguns extratos lipídes celulares. Esse comportamento provavelmente limitou as composições — e talvez a relevância biológica — dos DIBs em estudos de membrana modelo. Para resolver esse problema, um protocolo experimental é apresentado para aquecer cuidadosamente o reservatório de óleo que hospeda gotículas DIB e caracterizar os efeitos da temperatura na membrana lipídica. Especificamente, este protocolo mostra como usar uma luminária de alumínio termicamente condutora e elementos de aquecimento resistivos controlados por um loop de feedback para prescrever temperaturas elevadas, o que melhora a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas para um conjunto mais amplo de tipos lipídes. Características estruturais da membrana, bem como as transições de fase termotrópica dos lipídios que compõem a bicamada, são quantificadas medindo as alterações na capacitância elétrica do DIB. Em conjunto, este procedimento pode auxiliar na avaliação de fenômenos biofísicos em membranas modelo sobre várias temperaturas, incluindo a determinação de uma temperatura de fusão eficaz (TM) para misturas lipídicas multicomponidais. Essa capacidade permitirá, assim, uma replicação mais próxima das transições de fases naturais nas membranas do modelo e incentivará a formação e o uso de membranas modelo a partir de uma faixa mais ampla de constituintes de membrana, incluindo aquelas que melhor captam a heterogeneidade de suas contrapartes celulares.

A Figura 1 mostra como a luminária de alumínio e o reservatório de óleo acrílico são preparados no estágio do microscópio para a formação de DIB. As etapas de montagem 1.2-1.4 servem para isolar termicamente a luminária do palco para um aquecimento mais eficiente. As etapas 1.5-1.7 mostram como fixar adequadamente o termopar à luminária e posicionar o reservatório de óleo, e as etapas 1.8 -1.9 mostram locais recomendados para a distribuição de óleo nessas peças.
<p cla...

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Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

Este protocolo detalha o uso de um sistema de aquecimento controlado pela temperatura para promover a montagem de monocamadas lipídicas e a formação de bicamadas de interface de gotícula para lipídios com temperaturas elevadas de fusão e medidas de capacitância para caracterizar mudanças orientadas pela temperatura na membrana.

Montagem controlada por temperatura e caracterização de um Bilayer de interface de gotícula

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Este protocolo permite que os pesquisadores aqueçam precisamente uma bicamada de interface de gotícula, ou DIB, membrana modelo, que permite estudar uma variedade de efeitos relacionados à temperatura que ocorrem em ambientes celulares. A vantagem central decorre da capacidade de medir localmente e controlar a temperatura do banho em um reservatório de baixo volume sem obstruir o acesso para as caracterizações elétricas ou ópticas do DIB. A capacidade de aquecer precisamente o banho de fluido desbloqueia a possibilidade de estudar as propriedades de transporte e sinalização em DIBs formadas a partir de uma variedade muito maior de constituintes de membrana, incluindo extratos celulares naturais.Trata-se de um protocolo de várias etapas que utiliza vários equipamentos que devem ser seguidos de perto para alcançar precisão experimental suficiente, assim qualquer ambiguidade no processo escrito pode ser esclarecida via demonstração visual. Para começar, junte duas peças de borracha isolante de 1 milímetro de espessura aparadas a 25 por 40 milímetros de comprimento, dois pedaços de uma borracha de seis milímetros de espessura que também são de 25 por 40 milímetros, um conjunto de luminária de alumínio preparado e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio. Coloque as peças de borracha mais finas sobre o palco do microscópio de tal forma que a borda longa de cada peça seja tangencial à abertura do palco.Posicione a luminária da base de alumínio em cima das almofadas isolantes com a janela de visualização da luminária centrada acima da lente objetiva. Coloque um pedaço de borracha mais grosso em cima de cada elemento de aquecimento resistivo, em seguida, use um clipe de estágio de microscópio para mantê-lo no lugar para proteger os elementos de aquecimento dos danos causados pelos clipes do palco e para isolar contra curto-circuito elétrico acidental. Dobre cuidadosamente a extremidade de medição de um termopar para alcançar um ângulo de 90 graus a cerca de quatro milímetros do final.Insira a ponta dobrada do termopar no canto inferior esquerdo da luminária de alumínio e fixe-a suavemente com um parafuso de travamento. Coloque o reservatório de acrílico no poço da luminária de alumínio antes de adicionar óleo de hexadecano ao poço da luminária de alumínio para minimizar o risco de aprisionar bolhas de ar entre a janela de visualização e o fundo do reservatório acrílico. Dispense cerca de 1.000 microlitros de óleo de hexadecano no poço da luminária de alumínio para fornecer uma área máxima de superfície para a transferência de calor ocorrer enquanto não permite que o óleo derrame sobre as bordas da luminária sobre o estágio do microscópio ou lente objetiva.Distribua cerca de 1.000 microliters de óleo hexadecano no reservatório acrílico sem enchá-lo. Meça a capacitância nominal da membrana enquanto reduz a temperatura do banho de óleo a partir de um ponto de partida que permite a formação de bicamadas para identificar transições de fase termotrópico dos lipídios na membrana. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de temperatura na GUI e limpe os dados de exibição para garantir que o espaço suficiente no buffer esteja disponível para gravações subsequentes.Usando o gerador de forma de onda conectado ao amplificador de grampo de remendo, aplique uma forma de onda de tensão triangular através do bicamador de interface de gotícula, ou DIB, eletrodos e regise a resposta de corrente induzida através da bicamadas. Esfrie a bicamada reduzindo a temperatura do ponto de set em incrementos de cinco graus, esperando um mínimo de cinco minutos na nova temperatura de estado estável entre as mudanças de temperatura até que a temperatura desejada seja alcançada. Após o banho de óleo e o resfriamento da bicamada até a temperatura mínima desejada, clique com o botão direito do mouse no gráfico de temperatura na GUI novamente e exporte os dados de temperatura versus tempo para um software de planilha.Pare a gravação atual. A partir da corrente medida, calcule a capacitância nominal da resposta corrente de onda quadrada versus o tempo durante o período de resfriamento. Plote a capacitância nominal versus a temperatura para observar como a capacitância da membrana mudou e, em seguida, localizar alterações não monotônicas na capacitância versus temperatura para identificar a temperatura de fusão.Da mesma forma, avalie a capacidade quase estática específica da bicamada a temperaturas fixas, aumentando sucessivamente a temperatura do banho de óleo e da área de bicamadas. Altere a temperatura do ponto de set em incrementos de 10 graus Celsius usando a GUI e permita que o sistema se equilibre à nova temperatura. Execute etapas descritas anteriormente para iniciar a medição da corrente capacitiva e da gravação.Altere a área da bicamadas ajustando cuidadosamente as posições dos eletrodos usando os micro manipuladores. Permita que a corrente de onda quadrada atinja uma amplitude de estado estável e colete imagens do DIB para permitir o cálculo da área da membrana versus o tempo. Use uma câmera montada no microscópio para imaginar o bicamado como visto da abertura.Adicione simultaneamente uma tag digital ao software de gravação atual para marcar o ponto de tempo correspondente para a coleta de imagens. Obtenha um total de cinco imagens DIB e regiões de estado estável de corrente bicamada, em seguida, reinicie a temperatura e repita a imagem. Analise as gravações atuais e as imagens DIB nos pontos de tempo marcados correspondentes às áreas de bicamadas de estado estável, extraia capacitância bicamada e área para cada temperatura.Plote capacitância versus área para cada temperatura e calcule a inclinação da regressão da primeira ordem, que representa a capacitância específica da bicamada a cada temperatura. Em seguida, plote valores de capacitância específica versus suas respectivas temperaturas. Examine os dados específicos de capacitância versus temperatura para variações não monótônicas para identificar temperaturas de fusão.Avalie a dinâmica da formação do canal de íons dependentes da tensão gerando uma entrada de passo de tensão DC através da bicamada. Ajuste a tensão inicial ao valor da etapa desejada em milívolts e a tensão final e o tamanho da etapa a um valor superior ao passo desejado. Defina o tempo de duração desejado para a entrada da etapa em segundos e escolha a polaridade desejada para a entrada de passo.Alterne o amplificador do grampo de remendo para enviar a tensão de comando originária da visualização de laboratório ou do módulo de saída de tensão para o estágio da cabeça, ligue a tensão e regisse a resposta de corrente induzida, o que deve inibir uma resposta em forma de S a uma tensão crítica. Obtenha separadamente relações dinâmicas de tensão de corrente para uma membrana a temperaturas desejadas para revelar relações dependentes de tensão, como comportamentos de canais de íons. Alterne o amplificador do grampo de remendo para enviar a tensão de comando originária do gerador de forma de onda para o estágio da cabeça e inicie gravações de corrente.No gerador de forma de onda, exaia uma forma de onda sinusoidal contínua com amplitude, deslocamento e frequência desejadas. Regissão a resposta corrente induzida em um ou vários ciclos e repita conforme desejado para diferentes amplitudes de ondas senoidais, frequências e temperaturas. O sistema de controle de temperatura foi usado para mostrar a dependência de temperatura de um DIB formado a partir de extrato lipídedo total cerebral, ou BTLE, lipídios.Medições de corrente capacitiva e temperatura versus tempo são mostradas durante um ciclo de aquecimento da temperatura ambiente a aproximadamente 60 graus Celsius. Foram documentadas alterações na capacitância nominal versus temperatura em um ciclo completo de resfriamento/aquecimento, após a formação inicial de bicamadas a 60 graus Celsius. Medições quase estáticas de capacitância específica em diferentes temperaturas podem ser usadas para identificar a temperatura de fusão lipídica.A capacidade de plotagem de uma área bicamada versus bicamada permite uma regressão linear, onde a inclinação representa o valor da capacitância específica. A imagem do DIB mostra que, quando a temperatura está abaixo da temperatura de fusão, a membrana adota um estado altamente adesivo, mesmo sob tensão de gotículas esticadas causadas por eletrodos bem separados. Os traços de corrente versus tensão mostrados foram obtidos aplicando tensões sinusoidais de membrana, medindo a corrente induzida a duas temperaturas diferentes.As setas e os números subsequentes ajudam a visualizar os sucessivos trimestres da tensão sinusoidal em relação ao tempo. A densidade de corrente medida para uma membrana BTLE dopada por monazomicina no mesmo nível de tensão e duas temperaturas diferentes é mostrada aqui. É crucial distribuir o óleo de hexadecano no poço da luminária de alumínio corretamente.Se isso for feito fora de sequência ou não com cuidado, as bolhas de ar se formarão sob o poço acrílico, o que obstruirá a visão inferior para cima do DIB. O usuário também deve se lembrar de limpar o buffer de dados no software de controle de temperatura antes de cada medição para garantir a gravação completa. Este procedimento permite caracterizar membranas biomiméticas em uma faixa de temperaturas, que é necessária para estudar a dependência de temperatura da estrutura e transporte da membrana.Além disso, essa capacidade poderia ser usada para revelar efeitos nanoescala de outras espécies ativas da membrana, como canais de íons biológicos e nanomateriais projetados.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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