Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer at JoVE.com

Финансовую поддержку оказали Национальный научный фонд Грант CBET-1752197 и Управление ввс по научным исследованиям Грант FA9550-19-1-0213.

1. Подготовка нагретого арматуры
<ol><li>Соберите 2 куска 1 мм толщиной изолятора резины обрезается до 25 мм х 40 мм в ширину и длину, соответственно, 2 части 6 мм толщиной резины, которые также 25 мм х 40 мм, подготовленный алюминиевый базовый прибор сборки, и акриловое масло резервуар, который по?...

В описанном в настоящем протоколе содержатся инструкции по сборке и эксплуатации экспериментальной системы контроля температуры масла и капель, используемых для формирования ДИБ. Это особенно полезно для включения образования DIB с использованием липидов, которые имеют температуру п?...

Клеточные мембраны избирательно проницаемые барьеры, состоящие изтысяч липидных типов 1,белков, углеводов и стерий, которые инкапсулируют и субдивидуируют все живые клетки. Понимание того, как их составы влияют на их функции и выявление того, как природные и синтетические молекулы взаимодействуют с, придерживаются, нарушают и транслокируют клеточные мембраны, являются, следовательно, важными областями исследований с широкими последствиями в биологии, медицине, химии, физике и инженерии материалов.
Эти цели для открытия непосредственно выгоду от проверенных методов для сборки, манипулирования и изучения модели мембран, в том числе липидных билейеров, собранных из синтетических или естественных липидов, которые имитируют состав, структуру и транспортные свойства своих клеточных аналогов. В последние годы, капельный интерфейс bilayer (DIB)метод 2,3,4 для построения планар липидного билейера между липидным покрытием капли воды в масле получилзначительное внимание 5,6,7,8,9,10,11 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, ипродемонстрировалпрактические преимущества по сравнению с другими подходами для формирования мембраны модели: метод DIB прост в работе, не требует сложной изготовления или подготовки (например, "Картина") субстрата для поддержки мембраны, последовательно дает мембраны с долговечность, позволяет проводить стандартные электрофизиологические измерения и упрощает формирование модельных мембран с асимметричными листовочными композициями3. Потому что билайер формируется спонтанно между каплями и каждой капли могут быть адаптированы в положении и макияж, Техника DIB также привлекла значительный интерес к разработке клеточных материальныхсистем,которые опираются на использование стимулов-реакционных мембран18,24,25,26,27,28,29, сбалансированнойразобщенностии транспортировки 14,30,31,итканевых материалов 17,23,32,33,34,35,36.
Большинство опубликованных экспериментов на модельных мембранах, в том числе с ДИБами, проводились при комнатной температуре (RT, 20-25 градусов по Цельсию) и с горсткой синтетических липидов (например, DOPC, DPhPC и т.д.). Эта практика ограничивает сферу биофизических вопросов, которые могут быть изучены в модельных мембранах, и, на основе наблюдения, она также может ограничить типы липидов, которые могут быть использованы для сборки DIBs. Например, синтетический липид, такой как DPPC, который имеет температуру плавления 42 градусов по Цельсию, не собирает плотно упакованные монослои или не формирует DIBs на RT37. Формирование DIB при комнатной температуре также оказалось трудным для натуральных экстрактов, таких как млекопитающие (например, общий липидный экстракт мозга, BTLE)38 или бактерии (например, общий липидный экстракт Escherichia coli, ETLE)37, которые содержат множество различных типов липидов и происходят из клеток, которые находятся при повышенных температурах (37 градусов по Цельсию). Таким образом, включение изучения различных композиций дает возможность понять мембранные процессы в биологически соответствующих условиях.
Повышение температуры масла может служить двум целям: это увеличивает кинетики сборки монослой и это может привести к липидов пройти плавления перехода для достижения жидкой неупорядоченой фазы. Оба последствия помощи в монослойнойсборки 39, предварительно необходимые для DIB. В дополнение к нагреванию для формирования билейера, охлаждение мембраны после образования может быть использовано для выявления термотропных переходов в одиночных липидныхбилейзеров 38, в том числе в естественных липидных смесей (например, BTLE), которые могут быть трудно обнаружить с помощью калорий. Помимо оценки термотропных переходов липидов, точное изменение температуры DIB может быть использовано для изучения температурных изменений вмембранной структуре 38 и изучения того, как липидный состав и текучесть влияют на кинетику мембранно-активных видов (например, порообразующих пептидов и трансмембранныхбелков 37),в том числе млекопитающих и бактериальных мембран модели при физиологически соответствующей температуре (37 С).
В этом случае будет объяснено описание того, как собрать модифицированный нефтяной резервуар DIB и работать контроллер обратной связи-температуры, позволяющий сборку монослой и образование двухслойных при температурах выше РТ. Отличается от предыдущегопротокола 40, явные детали включены в отношении интеграции приборов, необходимых для измерения и контроля температуры параллельно сборки и характеристики DIB в нефтяном резервуаре. Таким образом, эта процедура позволит пользователю применять этот метод для формирования и изучения DIB в различных температурах в различных научных контекстах. Кроме того, репрезентативные результаты дают конкретные примеры типов измеримых изменений как в структуре мембран, так и в ионные транспортные изменения, которые могут происходить по мере изменения температуры. Эти методы являются важным дополнением ко многим биофизическим исследованиям, которые могут быть разработаны и эффективно выполнены в DIBs, в том числе изучение кинетики мембранно-активных видов в различных мембранных композициях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

Метод капельного интерфейса bilayer (DIB) для сборки липидных двуслойных (т.е. DIBs) между липидными аквестными каплями в масле предлагает ключевые преимущества по сравнению с другими методами: DIBs стабильны и часто долговечны, область билейера может быть обратимо настроена, листовка асимметрия легко контролируется с помощью капельных композиций, и ткани, как сети Формирование DIB требует спонтанной сборки липидов в липидные монослой высокой плотности на поверхностях капель. Хотя это происходит легко при комнатной температуре для общих синтетических липидов, достаточный монослой или стабильный билейер не может сформировать в аналогичных условиях для липидов с точками плавления выше комнатной температуры, в том числе некоторые клеточные липидные экстракты. Такое поведение, вероятно, ограничило составы и, возможно, биологическую значимость DIB в модельных мембранных исследованиях. Для решения этой проблемы представлен экспериментальный протокол для тщательного нагрева нефтяного резервуара, в которого обухотятся капли DIB, и характеризует влияние температуры на липидную мембрану. В частности, этот протокол показывает, как использовать теплопроводящий алюминиевый светильник и резисторные нагревательные элементы, контролируемые циклом обратной связи, чтобы назначать повышенные температуры, что улучшает сборку монослой и образование двухслойных для более широкого набора липидных типов. Структурные характеристики мембраны, а также термотропические фазы переходов липидов, включающих билейер, количественно измеряются путем измерения изменений электрической емкости DIB. Вместе эта процедура может помочь в оценке биофизических явлений в модельных мембранах по различным температурам, включая определение эффективной температуры плавления(ТМ)для многокомпонентных липидных смесей. Таким образом, эта возможность позволит более тесно реплицировать естественные фазовые переходы в модельных мембранах и будет способствовать образованию и использованию модельных мембран из более широкой полосы мембранных компонентов, включая те, которые лучше фиксируют неоднородность их клеточных аналогов.

На рисунке 1 показано, как на стадии микроскопа готовятся алюминиевые светильники и акриловое масло. Сборка шаги 1.2-1.4 служить для термически изолировать приспособление от сцены для более эффективного отопления. Шаги 1.5-1.7 показывают, как правильно прикрепить термокупл к...

Watch this Scientific Journal Video about Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer at JoVE.com

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

В этом протоколе подробно используется система отопления, контролируемая температурой обратной связи, для содействия сборке липидных монослой и формированию бислойного интерфейса капель для липидов с повышенными температурами плавления, а также измерения емкости для характеристики изменений, обусловленных температурой в мембране.

Температура контролируемой сборки и характеристики droplet интерфейс Bilayer

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Этот протокол позволяет исследователям точно нагревать билайер интерфейса капель, или DIB, модель мембраны, которая позволяет изучать различные связанные с температурой эффекты, которые происходят в клеточной среде. Основное преимущество связано с способностью локально измерять и контролировать температуру ванны в малооборье водохранилище, не препятствуя доступу к электрическим или оптическим характеристикам DIB. Способность точно нагревать жидкостную ванну открывает возможность изучения транспортных и сигнальных свойств в ДИБ, образованных из гораздо более широкого спектра мембранных компонентов, включая натуральные клеточные экстракты.Это многоступенчатый протокол, использующий несколько оборудования, за которым необходимо внимательно следить для достижения достаточной экспериментальной точности, поэтому любая двусмысленность в письменном процессе может быть прояснена с помощью визуальной демонстрации. Для начала соберите два куска одномиллиметровой толщиной изолятора, обрезаемого до 25 на 40 миллиметров в длину, два куска резины толщиной шесть миллиметров, которые также 25 на 40 миллиметров, подготовленную сборку алюминиевой основы и акриловое масляное резервуар, который помещается в смотровое окно алюминиевого основания. Поместите тонкие резиновые куски на сцену микроскопа так, что длинный край каждого куска является касательным к открытию сцены.Распоить алюминиевый базовый прибор поверх изоляционных прокладок со смотровым окном прибора, расположенным выше объектива. Поместите более толстый кусок резины поверх каждого резистивного нагревательного элемента, а затем используйте зажим для сцены микроскопа, чтобы держать его на месте, чтобы защитить нагревательные элементы от повреждений, вызванных сценическими зажимами и изолировать от случайного электрического замыкания. Тщательно согните конец измерения термокоупла, чтобы достичь 90-градусного угла на уровне около четырех миллиметров от конца.Вставьте изогнутый кончик термокрейла в левый нижний угол алюминиевого светильника и аккуратно закрепите его запирая винтом. Поместите акриловый резервуар в колодец алюминиевого прибора до добавления гексадеканового масла в колодец алюминиевого прибора, чтобы свести к минимуму риск захвата пузырьков воздуха между смотровым окном и дном акрилового резервуара. Раздай около 1000 микролитров гексадеканового масла в колодец алюминиевого прибора, чтобы обеспечить максимальную площадь поверхности для передачи тепла, не позволяя нефти разливаться по краям прибора на стадии микроскопа или объектива.Выдай около 1000 микролитров гексадеканового масла в акриловый резервуар, не переполнив его. Измерьте номинальную емкость мембраны при одновременном снижении температуры масляной ванны с установленной точки, которая позволяет двухслойное образование определить термотропные фазы переходов липидов в мембране. Нажмите правой кнопкой мыши на графике температуры в графическом интерфейсе и очистите данные дисплея, чтобы обеспечить достаточное пространство в буфере для последующих записей.Используя генератор волновой формы, подключенный к усилителю зажима патча, нанесите треугольную волновуюформу напряжения через билайер интерфейса капли, или DIB, электроды и записывают индуцированную реакцию тока через билайер. Охладить билейер, снизив температуру установленного уровня на пять градусов, ожидая минимум пять минут при новой температуре стабильного состояния между изменениями температуры до достижения желаемой температуры. После масляной ванны и охлаждения бислой до нужной минимальной температуры, право нажмите график температуры в GUI снова и экспортировать данные о температуре по сравнению со временем в электронную таблицу программного обеспечения.Остановите текущую запись. Из измеренного тока вычислите номинальную емкость квадратной волны текущей реакции по сравнению со временем в период охлаждения. Участок номинальной емкости по сравнению с температурой, чтобы наблюдать, как мембранная способность изменилась, а затем найти не монотонные изменения в емкости по сравнению с температурой для определения температуры плавления.Аналогичным образом, оценить квази статической специфической емкости билейера при фиксированных температурах путем последовательного увеличения температуры масляной ванны и площади билейера. Измените температуру установленного пункта на 10 градусов по Цельсию с помощью графического интерфейса и позвольте системе уравночные доработать новую температуру. Выполните ранее описанные шаги по инициированию измерения емкостного тока и записи.Измените область билейера, тщательно регулируя положение электродов с помощью микроманипуляторов. Разрешить для квадратного волнового тока, чтобы достичь стабильного состояния амплитуды и собирать изображения DIB, чтобы позволить расчет области мембраны по сравнению со временем. Используйте камеру, установленную на микроскоп, чтобы изображение бислойщика, как видно из диафрагмы.Одновременно добавьте цифровой тег в текущее программное обеспечение для записи, чтобы отметить соответствующую точку времени для сбора изображений. Получить в общей сложности пять DIB изображений и устойчивых состояний регионов билейного тока, а затем сбросить температуру и повторить изображение. Проанализируйте текущие записи и изображения DIB в отмеченных точках времени, соответствующих устойчивым областям двухслойного состояния, емкости и площади экстракта двухслойных 3000 для каждой температуры.Емкость участка по сравнению с областью для каждой температуры и вычислить наклон регрессии первого порядка, которая представляет собой специфическую емкость билейера при каждой температуре. Затем построения значений конкретной емкости по сравнению с их соответствующими температурами. Изучите конкретные данные о емкости по сравнению с температурой для не монотонных вариаций для определения температуры плавления.Оцените динамику формирования ионных каналов, зависящих от напряжения, генерируя ввод шага dc через билейер. Установите начальное напряжение до желаемого значения шага в милливольтах и окончательного напряжения и размера шага до значения выше желаемого шага. Установите желаемое время длительности для ввода шага в считанные секунды, а затем выберите желаемую полярность для ввода шага.Включите усилитель зажима патча, чтобы отправить командное напряжение, возникают из лабораторного представления или модуля вывода напряжения на головную сцену, включите напряжение и замитвайте индуцированную реакцию тока, которая должна препятствовать S-образной реакции на критическое напряжение. Отдельно получить динамические отношения текущего напряжения для мембраны при желаемых температурах, чтобы выявить напряжение-зависимых отношений, таких как поведение ионных каналов. Переключите усилитель зажима патча, чтобы отправить командное напряжение, возникают из генератора волновой формы, на головную сцену и инициировать текущие записи.На генераторе волновой формы выводится непрерывная синусоидальная волновая форма с желаемой амплитудой, смещением и частотой. Завехать индуцированную текущую реакцию в течение одного или нескольких циклов и повторить по желанию для различных амплитуды синусной волны, частоты и температуры. Система контроля температуры была использована для демонстрации температурной зависимости DIB формируется из мозга общего липидного экстракта, или BTLE, липиды.Измерения емкостного тока и температуры по сравнению со временем показаны во время отопительного цикла от комнатной температуры до примерно 60 градусов по Цельсию. Были зафиксированы изменения номинальной емкости по сравнению с температурой в течение одного полного цикла охлаждения/нагрева, после первоначального образования двухслойного на уровне 60 градусов по Цельсию. Квази-статические измерения специфической емкости при различных температурах могут быть использованы для определения температуры плавления липидов.Построение емкости области бислойца по сравнению с областью билейера позволяет осуществлять линейную регрессию, когда наклон представляет значение конкретной емкости. Изображение DIB показывает, что, когда температура ниже температуры плавления, мембрана принимает высоко клейкое состояние, даже под напряжением от растянутых капель, вызванных хорошо разделенными электродами. Показанные следы тока и напряжения были получены путем применения напряжения синуоидной мембраны, измерения индуцированного тока при двух различных температурах.Стрелки и последующие числа помогают визуализировать последовательные четверти синусоидального напряжения по отношению к времени. Измеренная плотность тока для моназомицин-допинг BTLE мембраны на том же уровне напряжения и двух различных температур показано здесь. Очень важно правильно распределить гексадекановое масло в колодец алюминиевого прибора.Если это делается из последовательности или не тщательно, пузырьки воздуха образуются под акриловой хорошо, что будет препятствовать снизу вверх зрения DIB. Пользователь должен также помнить, чтобы очистить буфер данных в программном обеспечении контроля температуры до каждого измерения, чтобы обеспечить полную запись. Эта процедура позволяет охарактеризовать биомиметические мембраны по широкому диапазону температур, что необходимо для изучения температурной зависимости мембранной структуры и транспорта.Кроме того, эта возможность может быть использована дляявить наномасштабное воздействие других мембранных активных видов, таких как биологические ионные каналы и инженерные наноматериалы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Синтез, монтаж, и характеристика монослоя охраняемые пленок золота наночастицы для Белки электрохимии монослоя

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

Флуоресценции Восстановление после Слияние капли измерить двумерной диффузии фосфолипидов монослоя

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Автоматизированная двухслойной липидной мембраной, Образование Использование тонкой пленки полидиметилсилоксана

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Лигандом Нано-кластер Массивы в поддерживаемому липидный бислой

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

Изготовление и характеристика фантомы оптических ткани, содержащие макроструктуры

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

Ассамблея и характеристика биомолекулярных Memristors, состоящий из легированных ионного канала липидные мембраны

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...