Name: temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00
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El apoyo financiero fue proporcionado por la Subvención de la Fundación Nacional de Ciencias CBET-1752197 y la Beca de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea FA9550-19-1-0213.

1. Preparación del accesorio calentado
<ol><li>Reúna 2 piezas de caucho aislante de 1 mm de espesor recortadas a 25 mm x 40 mm de ancho y largo, respectivamente, 2 piezas de una goma de 6 mm de espesor que también son de 25 mm x 40 mm, un conjunto de accesorio de base de aluminio preparado y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio (consulte las figuras S1, S2 y S3 para obtener detalles sobre la fabricación y una vista explotada del...

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para ensamblar y operar un sistema experimental para controlar la temperatura del aceite y las gotas utilizadas para formar DIBs. Es especialmente beneficioso para permitir la formación de DIB utilizando lípidos que tienen temperaturas de fusión por encima de RT. Por otra parte, variando con precisión la temperatura del depósito de aceite, la temperatura de la bicapa puede ser manipulada para estudiar los efectos de las temperaturas elevadas sobre diversas propie...

Las membranas celulares son barreras selectivamente permeables compuestas por miles de lípidos tipo1,proteínas, carbohidratos y esteroles que encapsulan y subdividen todas las células vivas. Comprender cómo sus composiciones afectan sus funciones y revelar cómo las moléculas naturales y sintéticas interactúan, se adhieren, interrumpen y translocan las membranas celulares son, por lo tanto, áreas importantes de investigación con implicaciones de amplio alcance en biología, medicina, química, física e ingeniería de materiales.
Estos objetivos para el descubrimiento se benefician directamente de las técnicas probadas para ensamblar, manipular y estudiar las membranas modelo, incluidas las bicapas lipídicas ensambladas a partir de lípidos sintéticos o naturales, que imitan la composición, la estructura y las propiedades de transporte de sus contrapartes celulares. En los últimos años, el método2,3,4 de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para construir una bicapa lipídica plana entre gotas de agua recubiertas de lípidos en aceite ha recibido una atención significativa5,6,7,8,9,10, 11,12,13, 14,15, 16,17, 18,19,20,21,22,23,y ha demostrado ventajas prácticas sobre otros enfoques para la formación de membranas modelo: el método DIB es fácil de realizar, no requiere fabricación o preparación sofisticada (por ejemplo, "pintura") de un sustrato para soportar la membrana, produce consistentemente membranas con membranas superiores longevidad, permite mediciones electrofisiología estándar, y simplifica la formación de membranas modelo con composiciones asimétricas de foliolos3. Debido a que la bicapa se forma espontáneamente entre las gotitas y cada gotita se puede adaptar en posición y composición, la técnica DIB también ha atraído un interés considerable en el desarrollo de sistemas de materiales inspirados en las células que se basan en el uso de membranas sensibles a losestímulos18,24,25, 26,27, 28,29,compartimentación y transporteequilibrados 14,30, 31,y materiales similares a los tejidos17,23,32,33,34,35,36.
La mayoría de los experimentos publicados en membranas modelo, incluidas aquellas con DIBs, se han realizado a temperatura ambiente (RT, ~ 20-25 ° C) y con un puñado de lípidos sintéticos (por ejemplo, DOPC, DPhPC, etc.). Esta práctica limita el alcance de las preguntas biofísicas que se pueden estudiar en membranas modelo y, basándose en la observación, también puede restringir los tipos de lípidos que se pueden utilizar para ensamblar DIBs. Por ejemplo, un lípido sintético como dppc, que tiene una temperatura de fusión de 42 °C, no ensambla monocapas apretadas ni forma DIBs aRT 37. La formación de DIB a temperatura ambiente también ha resultado difícil para los extractos naturales, como los de mamíferos (por ejemplo, extracto lipídico total cerebral, BTLE)38 o bacterias (por ejemplo, extracto lipídico total de Escherichia coli, ETLE)37,que contienen muchos tipos diferentes de lípidos y se originan en células que residen a temperaturas elevadas (37 °C). Por lo tanto, permitir el estudio de diversas composiciones brinda oportunidades para comprender los procesos mediados por membranas en condiciones biológicamente relevantes.
Elevar la temperatura del aceite puede servir para dos propósitos: aumenta la cinética del ensamblaje de monocapas y puede hacer que los lípidos se sometan a una transición de fusión para alcanzar una fase desordenada líquida. Ambas consecuencias ayudan en el montaje monocapa39, un requisito previo para un DIB. Además del calentamiento para la formación de bicapas, el enfriamiento de la membrana después de la formación se puede utilizar para identificar transiciones dermatotrópicas en bicapas lipídicas individuales38,incluidas las de mezclas lipídicas naturales (por ejemplo, BTLE) que pueden ser difíciles de detectar mediante calorimetría. Además de evaluar las transiciones termotrópicas de los lípidos, la variación precisa de la temperatura del DIB se puede utilizar para estudiar los cambios inducidos por la temperatura en la estructura de la membrana38 y examinar cómo la composición lipídica y la fluidez afectan a la cinética de las especies activas en la membrana (por ejemplo, péptidos formadores de poros y proteínas transmembrana37),incluidas las membranas modelo de mamíferos y bacterias a una temperatura fisiológicamente relevante (37 °C).
Aquí, se explicará una descripción de cómo ensamblar un depósito de aceite DIB modificado y operar un controlador de temperatura de retroalimentación para permitir el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas a temperaturas superiores a RT. A diferencia de un protocolo anterior40,se incluye detalle explícito respecto a la integración de la instrumentación necesaria para medir y controlar la temperatura en paralelo al montaje y caracterización del DIB en el depósito de aceite. Por lo tanto, el procedimiento permitirá a un usuario aplicar este método para formar y estudiar DIBs en un rango de temperaturas en una variedad de contextos científicos. Además, los resultados representativos proporcionan ejemplos específicos para los tipos de cambios medibles tanto en la estructura de la membrana como en el transporte de iones que pueden ocurrir a medida que se varía la temperatura. Estas técnicas son adiciones importantes a los muchos estudios biofísicos que se pueden diseñar y realizar con eficacia en DIBs, incluyendo el estudio de la cinética de especies membrana-activas en diversas composiciones de la membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td >Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >3-(N-morpholino) propanesulfonic acid&#160;</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td >Buffering agent for lipid solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acrylic substrate</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_2</td>
			<td >~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aluminum fixture</td>
			<td >Fabricated in house</td>
			<td >HTD_STG_1</td>
			<td >Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Total Lipid Extract</td>
			<td >Avanti</td>
			<td>131101C-100mg</td>
			<td >25 mg/mL porcine lipid extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compact DAQ Chassis (cDAQ)</td>
			<td>National Instruments&#160;</td>
			<td>cDAQ-9174&#160;</td>
			<td >Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data Acquisition System (DAQ)</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>Digidata 1440A&#160;</td>
			<td >High resolution analog to digital converter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fixed gain amplifier/power supply</td>
			<td >Hewlitt Packard</td>
			<td >HP 6826A</td>
			<td >Amplifies DC voltage output from the voltage output module</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Cover Slip</td>
			<td >Corning</td>
			<td>CLS284525</td>
			<td >Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating element (x2)</td>
			<td >Omega</td>
			<td >KHLV-101/5</td>
			<td >25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M3 Stainless Steel Screw</td>
			<td >McMaster Carr</td>
			<td >90116A150</td>
			<td >Secures thermocouple to aluminum fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Patch clamp amplifier</td>
			<td >Molecular Devices&#160;</td>
			<td>AxoPatch 200B&#160;</td>
			<td >Measures current and outputs voltage to the headstage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Personal computer</td>
			<td >Any</td>
			<td></td>
			<td >Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td >Electrolyte solution of dissociated ions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Temperature input module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9211</td>
			<td >Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermocouple</td>
			<td >Omega</td>
			<td>JMTSS-020U-6&#160;</td>
			<td >U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV Curable Adhesive</td>
			<td >Loctite</td>
			<td>19739</td>
			<td >Secures glass coverslip to aluminum base fixture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Voltage output module</td>
			<td >National Instruments&#160;</td>
			<td >NI 9263</td>
			<td >Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waveform generator</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>33210A&#160;</td>
			<td >Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temperature-controlled assembly and characterization of a droplet interface bilayer

El método de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para ensamblar bicapas lipídicas (es decir, DIB) entre gotitas acuosas recubiertas de lípidos en aceite ofrece beneficios clave en comparación con otros métodos: los DIB son estables y a menudo duraderos, el área de la bicapa se puede ajustar reversiblemente, la asimetría de las valvas se controla fácilmente a través de composiciones de gotitas, y las redes de bicapas similares a tejidos se pueden obtener al contiguas muchas gotitas. La formación de DIBs requiere el ensamblaje espontáneo de lípidos en monocapas lipídicas de alta densidad en las superficies de las gotitas. Mientras que esto ocurre fácilmente a temperatura ambiente para los lípidos sintéticos comunes, una monocapa suficiente o bicapa estable no puede formarse en condiciones similares para los lípidos con puntos de fusión por encima de la temperatura ambiente, incluyendo algunos extractos celulares del lípido. Este comportamiento probablemente ha limitado las composiciones y quizás la relevancia biológica de los DIB en los estudios de membranas modelo. Para abordar este problema, se presenta un protocolo experimental para calentar cuidadosamente el depósito de aceite que alberga gotas dib y caracterizar los efectos de la temperatura sobre la membrana lipídica. Específicamente, este protocolo muestra cómo utilizar un accesorio de aluminio térmicamente conductor y elementos de calentamiento resistivos controlados por un bucle de retroalimentación para prescribir temperaturas elevadas, lo que mejora el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas para un conjunto más amplio de tipos de lípidos. Las características estructurales de la membrana, así como las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos que componen la bicapa, se cuantifican midiendo los cambios en la capacitancia eléctrica del DIB. En conjunto, este procedimiento puede ayudar en la evaluación de fenómenos biofísicos en membranas modelo a lo largo de varias temperaturas, incluida la determinación de una temperatura de fusión efectiva(TM)para mezclas de lípidos multicomponente. Por lo tanto, esta capacidad permitirá una replicación más cercana de las transiciones de fase naturales en las membranas modelo y fomentará la formación y el uso de membranas modelo de una franja más amplia de componentes de la membrana, incluidos aquellos que capturan mejor la heterogeneidad de sus contrapartes celulares.

La Figura 1 muestra cómo el accesorio de aluminio y el depósito de aceite acrílico se preparan en la etapa de microscopio para la formación de DIB. Los pasos de montaje 1.2-1.4 sirven para aislar térmicamente el accesorio del escenario para una calefacción más eficiente. Los pasos 1.5-1.7 muestran cómo conectar correctamente el termopar al accesorio y colocar el depósito de aceite, y los pasos 1.8-1.9 muestran las ubicaciones recomendadas para dispensar aceite en estos pedazos.
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Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Este protocolo permite a los investigadores calentar con precisión una bicapa de interfaz de gotas, o DIB, modelo de membrana, lo que permite estudiar una variedad de efectos relacionados con la temperatura que ocurren en entornos celulares. La ventaja principal se deriva de la capacidad de medir y controlar localmente la temperatura del baño en un depósito de bajo volumen sin obstruir el acceso para las caracterizaciones eléctricas u ópticas del DIB. La capacidad de calentar con precisión el baño de fluidos abre la posibilidad de estudiar las propiedades de transporte y señalización en dibs formados a partir de una variedad mucho más amplia de componentes de membrana, incluyendo extractos celulares naturales.Este es un protocolo de varios pasos que aprovecha múltiples equipos que deben seguirse de cerca para lograr suficiente precisión experimental, por lo que cualquier ambigüedad en el proceso escrito se puede aclarar a través de la demostración visual. Para comenzar, reúna dos piezas de caucho aislante de un milímetro de espesor recortadas a 25 por 40 milímetros de longitud, dos piezas de una goma de seis milímetros de espesor que también son de 25 por 40 milímetros, un conjunto de accesorios de base de aluminio preparados y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio. Coloque las piezas de goma más delgadas en la etapa del microscopio de tal manera que el borde largo de cada pieza sea tangencial a la abertura de la etapa.Coloque el accesorio de base de aluminio en la parte superior de las almohadillas aislantes con la ventana de visualización del accesorio centrada sobre la lente objetivo. Coloque una pieza de goma más gruesa en la parte superior de cada elemento de calentamiento resistivo, luego use un clip de etapa de microscopio para mantenerlo en su lugar para proteger los elementos de calefacción de los daños causados por los clips de la etapa y para aislar contra el cortocircuito eléctrico accidental. Doble cuidadosamente el extremo de medición de un termopar para lograr un ángulo de 90 grados a unos cuatro milímetros del extremo.Inserte la punta doblada del termopar en la esquina inferior izquierda del accesorio de aluminio y alíquelo suavemente con un tornillo de bloqueo. Coloque el depósito de acrílico en el pozo del accesorio de aluminio antes de agregar aceite de hexadecano al pozo del accesorio de aluminio para minimizar el riesgo de atrapar burbujas de aire entre la ventana de visualización y la parte inferior del depósito de acrílico. Dispense alrededor de 1, 000 microlitros de aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio para proporcionar un área de superficie máxima para que se produzca la transferencia de calor, sin permitir que el aceite se derrame sobre los bordes del accesorio en la etapa del microscopio o la lente objetiva.Dispense alrededor de 1,000 microlitros de aceite de hexadecano en el depósito de acrílico sin llenarlo en exceso. Mida la capacitancia nominal de la membrana mientras reduce la temperatura del baño de aceite desde un punto de ajuste que permita la formación de bicapas para identificar las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos en la membrana. Haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura de la GUI y borre los datos de visualización para asegurarse de que hay suficiente espacio disponible en el búfer para grabaciones posteriores.Utilizando el generador de forma de onda conectado al amplificador de abrazadera de parche, aplique una forma de onda de voltaje triangular a través de los electrodos de la interfaz de gota, o DIB, y registre la respuesta de corriente inducida a través de la bicapa. Enfríe la bicapa reduciendo la temperatura del punto de ajuste en incrementos de cinco grados, esperando un mínimo de cinco minutos a la nueva temperatura de estado estacionario entre los cambios de temperatura hasta que se logre la temperatura deseada. Después del baño de aceite y enfriar la bicapa a la temperatura mínima deseada, haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura en la GUI nuevamente y exporte los datos de temperatura versus tiempo a un software de hoja de cálculo.Detenga la grabación actual. A partir de la corriente medida, calcule la capacitancia nominal de la respuesta de la corriente de onda cuadrada en comparación con el tiempo durante el período de enfriamiento. Trace la capacitancia nominal versus la temperatura para observar cómo cambió la capacitancia de la membrana, luego localice los cambios no monótonos en la capacitancia versus la temperatura para identificar la temperatura de fusión.Del mismo modo, evalúe la capacitancia cuasi estática específica de la bicapa a temperaturas fijas incrementando sucesivamente la temperatura del baño de aceite y el área de la bicapa. Cambie la temperatura del punto de ajuste en incrementos de 10 grados Celsius utilizando la GUI y permita que el sistema se equilibre con la nueva temperatura. Realice los pasos previamente descritos para iniciar la medida de la corriente capacitiva y de la grabación.Cambie el área de la bicapa ajustando cuidadosamente las posiciones de los electrodos utilizando los micro manipuladores. Permita que la corriente de onda cuadrada alcance una amplitud de estado estacionario y recopile imágenes del DIB para permitir el cálculo del área de la membrana frente al tiempo. Utilice una cámara montada en el microscopio para obtener imágenes de la bicapa como se ve desde la apertura.Agregue simultáneamente una etiqueta digital al software de grabación actual para marcar el punto de tiempo correspondiente para la recopilación de imágenes. Obtenga un total de cinco imágenes DIB y regiones de estado estacionario de corriente bicapa, luego restablezca la temperatura y repita la imagen. Analice las grabaciones actuales y las imágenes DIB en los puntos de tiempo etiquetados correspondientes a las áreas bicapa de estado estacionario, extraiga la capacitancia bicapa y el área para cada temperatura.Trace la capacitancia versus el área para cada temperatura y calcule la pendiente de la regresión de primer orden, que representa la capacitancia específica de la bicapa en cada temperatura. A continuación, trace los valores de capacitancia específica frente a sus respectivas temperaturas. Examine los datos de capacitancia específica frente a los datos de temperatura en busca de variaciones no monotónicas para identificar las temperaturas de fusión.Evalúe la dinámica de la formación de canales iónicos dependientes del voltaje generando una entrada de paso de voltaje de CC a través de la bicapa. Establezca el voltaje inicial en el valor de paso deseado en milivoltios y el voltaje final y el tamaño del paso en un valor superior al paso deseado. Establezca un tiempo de duración deseado para la entrada de paso en segundos y, a continuación, elija la polaridad deseada para la entrada de paso.Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde la vista de laboratorio o el módulo de salida de voltaje a la etapa de la cabeza, encienda el voltaje y registre la respuesta de corriente inducida, que debería inhibir una respuesta en forma de S a un voltaje crítico. Obtenga por separado relaciones dinámicas de voltaje de corriente para una membrana a las temperaturas deseadas para revelar relaciones dependientes de voltaje, como los comportamientos del canal iónico. Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde el generador de forma de onda a la etapa de la cabeza e inicie las grabaciones de corriente.En el generador de forma de onda, genere una forma de onda sinusoidal continua con una amplitud, desplazamiento y frecuencia deseados. Registre la respuesta de corriente inducida a través de uno o varios ciclos y repita como desee para diferentes amplitudes de onda sinusoidal, frecuencias y temperaturas. El sistema de control de temperatura se utilizó para mostrar la dependencia de la temperatura de un DIB formado a partir de extracto de lípidos totales del cerebro, o BTLE, lípidos.Las mediciones de la corriente capacitiva y la temperatura frente al tiempo se muestran durante un ciclo de calentamiento desde la temperatura ambiente hasta aproximadamente 60 grados Centígrados. Se documentaron cambios en la capacitancia nominal versus la temperatura a lo largo de un ciclo completo de enfriamiento/calentamiento, después de la formación inicial de bicapa a 60 grados Celsius. Las mediciones cuasiestáticas de capacitancia específica a diferentes temperaturas se pueden utilizar para identificar la temperatura de fusión de lípidos.Trazar la capacitancia de un área de bicapa versus bicapa permite una regresión lineal, donde la pendiente representa el valor de capacitancia específica. La imagen DIB muestra que, cuando la temperatura está por debajo de la temperatura de fusión, la membrana adopta un estado altamente adhesivo, incluso bajo la tensión de gotitas estiradas causadas por electrodos bien separados. Las trazas de corriente versus voltaje mostradas se obtuvieron mediante la aplicación de tensiones de membrana sinusoidales, midiendo la corriente inducida a dos temperaturas diferentes.Las flechas y los números subsiguientes ayudan a visualizar los cuartos sucesivos del voltaje sinusoidal con respecto al tiempo. La densidad de corriente medida para una membrana BTLE dopada con monazomicina al mismo nivel de voltaje y dos temperaturas diferentes se muestra aquí. Es crucial dispensar el aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio correctamente.Si esto se hace fuera de secuencia o no con cuidado, se formarán burbujas de aire debajo del pozo de acrílico, lo que obstruirá la vista de abajo hacia arriba del DIB. El usuario también debe recordar borrar el búfer de datos en el software de control de temperatura antes de cada medición para garantizar un registro completo. Este procedimiento permite caracterizar las membranas biomiméticas a través de un rango de temperaturas, que es necesario para estudiar la dependencia de la temperatura de la estructura de la membrana y el transporte.Además, esta capacidad podría utilizarse para revelar los efectos a nanoescala de otras especies activas en la membrana, como los canales iónicos biológicos y los nanomateriales de ingeniería.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Síntesis, de la Asamblea, y caracterización de una sola capa de nanopartículas de oro protegidas Films de Electroquímica de proteínas monocapa

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