Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten (RTI2018-098777-B-I00), de FEDER-fondsen en de Generalitat van Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido is de ontvanger van een PhD contract (FI) van de Generalitat de Catalunya.

1. Extractie van de totale niet-covalente lipiden uit mycobacteriën (Figuur 1)
<ol><li>Kras 0,2 g mycobacteriën uit een vast medium en voeg toe aan een glazen buis met een polytetrafluorethleen (PTFE) schroefdoppen. Voeg een oplossing toe bestaande uit 5 ml chloroform en 10 ml methanol (chloroform:methanol, 1:2). OPMERKING: Wanneer organische oplosmiddelen worden gebruikt, mag alleen de glasontvanger worden gebruikt. Plastic containers zijn niet toegestaan. Bovendien zijn PTFE liner s...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. A., Gillois, M., Lan&#233;elle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphthienoyl+trehalose,+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus.">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li><li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids.">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li><li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354.">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li><li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

Een eenvoudig protocol dat wordt beschouwd als de gouden standaardmethode voor de extractie van niet-covalent gekoppelde lipideverbindingen uit de mycobacteriële celwand wordt gepresenteerd. Verdere visualisatie door een- en tweedimensionale TLC's uit de geëxtraheerde lipiden van vier verschillende mycobacteriën wordt getoond.
Twee opeenvolgende gecombineerde mengsels van chloroform en methanol om het lipidegehalte van mycobacteriële cellen terug te winnen, is het meest gebruikte oplosmidd...

Mycobacterium is een geslacht dat pathogene en niet-pathogene soorten omvat, gekenmerkt door een zeer hydrofobe en ondoordringbare celwand gevormd door hun eigenaardige lipiden. In het bijzonder bevat de mycobacteriële celwand mycolzuren, die α-alkyl- en β-hydroxy-vetzuren zijn, waarbij de α-tak constant is in alle mycolzuren (behalve de lengte) en de β-keten, de meromycoladeketen genoemd, een lange alifatische keten is die verschillende functionele chemische groepen kan bevatten die samen met de literatuur worden beschreven (α-, α'-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy- en ω-1-methoxy-mycolaten), waardoor zeven soorten mycolzuren (I-VII) worden geproduceerd1. Bovendien zijn andere lipiden met onbetwistbaar belang ook aanwezig in de celwand van mycobacteriënsoorten. Pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose2 produceren specifieke lipide-gebaseerde virulentiefactoren zoals phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolglycollipide (PGL), di-, tri- en penta-acyltrehalosen (DAT, TAT en PAT), of sulfolipiden, onder anderen3. Hun aanwezigheid op het mycobacteriële oppervlak is in verband gebracht met het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te wijzigen en daarom de evolutie en persistentie van de mycobacterium in de gastheer4. De aanwezigheid van triacylglycerolen (TAG) is bijvoorbeeld geassocieerd met het hypervirulente fenotype van lineage 2-Beijing sublijn van M. tuberculosis, mogelijk vanwege het vermogen om de immuunrespons van de gastheer te verzwakken5,6. Andere relevante lipiden zijn lipooligosacchariden (LOSs) die aanwezig zijn in tuberculeuze en niet-tuberculeuze mycobacteriën. In het geval van Mycobacterium marinum, de aanwezigheid van LOSs in de celwand is gerelateerd aan glijdende beweeglijkheid en het vermogen om biofilms te vormen en interfereert met herkenning door macrofaagpatroonherkenningsreceptoren, waardoor de opname en eliminatie van de bacteriën door gastheerfagocyten wordt beïnvloed7,8. Bovendien maakt de afwezigheid of aanwezigheid van sommige lipiden het mogelijk om leden van dezelfde soort in te delen in verschillende morfotypen met virulente of verzachtende profielen bij interactie met gastheercellen. Bijvoorbeeld de afwezigheid van glycopeptidolipiden (GPL) in het ruwe morfotype van Mycobacterium abscessus is in verband gebracht met het vermogen om intrafagosomale verzuring en bijgevolg celapoptose te induceren9, in tegenstelling tot het gladde morfotype dat GPL's in hun oppervlak bezit. Bovendien is het lipidegehalte van de mycobacteriële celwand gerelateerd aan het vermogen om de immuunrespons in de gastheer te wijzigen. Dit is relevant in de context van het gebruik van sommige mycobacteriën om een beschermend immuunprofiel tegen verschillende pathologieën te activeren10,11,12,13. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat Mycolicibacterium vaccae, een saprofytische mycobacterie, die zich momenteel in fase III klinische studies bevindt als immunotherapeutisch vaccin voor tuberculose, vertoont twee koloniale morfotypen. Terwijl het gladde fenotype, dat een polyester in het oppervlak bevat, een Th2-respons veroorzaakt, kan het ruwe fenotype zonder polyester een Th1-profiel induceren wanneer het interageert met immuuncellen van de gastheer14. Het repertoire van lipiden aanwezig in de mycobacteriële cel hangt niet alleen af van mycobacteriënsoorten, maar ook van de omstandigheden van mycobacteriële culturen: incubatietijd15,16 of samenstelling van het kweekmedium17,18. In feite beïnvloeden veranderingen in de samenstelling van het kweekmedium de antitumor- en immunostimulerende activiteit van M. bovis BCG en Mycolicibacterium brumae in vitro17. Bovendien wordt het beschermende immuunprofiel veroorzaakt door M. bovis BCG tegen M. tuberculosis uitdaging in muizenmodellen hangt ook af van de cultuurmedia waarin M. bovis BCG groeit17. Deze kunnen dan worden gerelateerd aan de lipidesamenstelling van de mycobacteriën in elke kweekconditie. Om al deze redenen is de studie van het lipidengehalte van mycobacteriën relevant. Een visuele procedure om de lipidesamenstelling van de mycobacteriële celwand te extraheren en te analyseren, wordt gepresenteerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

Mycobacteriënsoorten kunnen van elkaar verschillen in de groeisnelheid, aanwezigheid van pigmentatie, de koloniemorfologie weergegeven op vaste media, evenals andere fenotypische kenmerken. Ze hebben echter allemaal het meest relevante karakter van mycobacteriën gemeen: de unieke en zeer hydrofobe celwand. Mycobacteriën soorten bevatten een membraan-covalent gekoppeld complex dat arabinogalactan, peptidoglycan en lange ketens van mycolische zuren omvat met soorten die verschillen tussen mycobacteriën soorten. Bovendien kunnen mycobacteriën ook lipiden produceren die zich bevinden, niet-covalent gekoppeld, op hun celoppervlakken, zoals phthiocerol dimycocerosaten (PDIM), fenolglycoliden (PGL), glycopeptidolipiden (GPL), acyltrehalosen (AT) of fosfatidil-inositol mannosides (PIM), onder anderen. Sommigen van hen worden beschouwd als virulentiefactoren in pathogene mycobacteriën, of kritische antigene lipiden in gastheer-mycobacteriën interactie. Om deze redenen is er een aanzienlijke interesse in de studie van mycobacteriële lipiden vanwege hun toepassing op verschillende gebieden, van het begrijpen van hun rol in de pathogeniciteit van mycobacteriën-infecties, tot een mogelijke implicatie als immunomodulerende middelen voor de behandeling van infectieziekten en andere pathologieën zoals kanker. Hier wordt een eenvoudige benadering gepresenteerd om het totale lipidengehalte en de mycolzuursamenstelling van mycobacteriëncellen gekweekt in een vast medium met behulp van mengsels van organische oplosmiddelen te extraheren en te analyseren. Zodra de lipide-extracten zijn verkregen, wordt dunnelaagchromatografie (TLC) uitgevoerd om de geëxtraheerde verbindingen te controleren. Het voorbeeldexperiment wordt uitgevoerd met vier verschillende mycobacteriën: de in het milieu snelgroeiende Mycolicibacterium brumae en Mycolicibacterium fortuitum, de verzwakte langzaam groeiende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) en de opportunistische pathogeen snelgroeiende Mycobacterium abccessus, wat aantoont dat methoden die in het huidige protocol worden getoond, kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan mycobacteriën.

Met het doel om een breed scala aan lipiden te laten zien die aanwezig zijn in verschillende mycobacteriënsoorten, werd M. bovis BCG geselecteerd omdat het ruwe en langzaam groeiende mycobacteriën zijn. De ruwe en snelgroeiende M. fortuitum en M. brumae werden toegevoegd aan de procedure en ten slotte werd ook het gladde morfotype van M. abcesus opgenomen. Deze vier soorten stellen ons in staat om een breed spectrum van van mycobacteriën afgeleide lipiden te visualiseren, zoals acyl...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.

Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacteriën Lipiden zijn een belangrijk kenmerk van het geslacht en zijn van cruciaal belang in gastheer Mycobacteriën interacties. Snelheid en veelzijdigheid zijn de belangrijkste voordelen van deze procedure. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van lipiden en de pathogeniciteit van mycobacteriën en hun immunostimulerende effect te begrijpen.Voeg voor de niet-covalente gekoppelde lipidenextractie 15 milliliter van één tot twee chloroform toe aan methanoloplossing aan een glazen buis met een PTFE-voeringschroefdop onder een laminaire stroomkap. Krab vervolgens 200 milligram mycobacteriën uit een vast medium en voeg de mycobacteriën toe aan de glazen buis. Incubeer de buis een nacht met constant roeren.Filter de volgende dag de organische oplosmiddelen door een glazen trechter bekleed met filtreerpapier in een glazen buis. Na gebruik van stikstofgasflux, om de vloeibare fase in de buis te verdampen, vult u de buis met stikstofgas en slaat u de buis op bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 15 milliliter van een twee tot één chloroform toe aan methanoloplossing aan het cellulaire vuil en incubeer de buis een nacht met constant roeren.Laat het mengsel de volgende ochtend een uur rusten voordat u een Pasteur-pipet gebruikt om de organische oplosmiddelen in een met filterpapier beklede glazen trechter in dezelfde glazen opvangbuis over te brengen. Verdamp vervolgens de vloeibare fase zoals gedemonstreerd, voordat u de buis bijvult met stikstofgas voor opslag van vier graden Celsius. Voeg voor mycolzuurextractie twee tot vijf milliliter van een roeroplossing en 200 milligram mycobacteriënbiomassa toe aan een hermetische glazen buis met een PTFE-voeringschroefdop en meng de inhoud door vortexing.Incubeer het mengsel 's nachts in een droog bad bij 80 graden Celsius. De volgende dag, wanneer de buis op kamertemperatuur is afgekoeld, voegt u twee milliliter N-hexaan toe en mengt u de inhoud gedurende 30 seconden door vortexing. Laat de buis bezinken totdat er twee heldere fasen verschijnen en breng de bovenste N-hexaanfase over naar een nieuwe buis.Meng twee extra milliliter N-hexaan met de buisinhoud en verzamel de bovenste laag opnieuw. Verdamp vervolgens de buisinhoud door middel van een stikstofstroom en sla het met stikstof bedekte monster op bij vier graden Celsius, zoals aangetoond. Om de monsters door TLC te analyseren, bedekt u een wand van de TLC-kamer met een stuk filterpapier, voegt u vaseline toe aan de hoeken van de kamer om de kamer af te sluiten, om het oplosmiddelmengsel over het filterpapier te laten gaan en het resterende volume van het oplosmiddel toe te voegen aan de bodem van de TLC-kamer.Sluit de TLC-kamer gedurende ten minste 20 minuten tot verzadigd. Los ondertussen de lipiden in de glazen buis op in 200 tot 1000 microliter chloroform en gebruik een capillaire glazen buis om 10 microliter van de lipide chloroform-suspensie rechtstreeks op de TLC-plaat aan te brengen. Nadat u het monster vijf minuten hebt laten drogen, plaatst u de plaat in de verzadigde TLC-kamer en laat u de mobiele fase door de TLC lopen.Wanneer het oplosmiddel een centimeter van het bovenste uiteinde van de plaat bereikt, plaatst u de plaat onder laminaire flux totdat het silica volledig droog is. Spuit vervolgens de gedroogde plaat met 15 tot 20 milliliter 10% molair data fosforzuurhydraat in ethanol tot de plaat felgeel is en verwarm de plaat gedurende twee tot vijf minuten op 120 graden Celsius. In deze representatieve analyse werd het mycolzuur geëxtraheerd uit verschillende mycobacteriënsoorten geanalyseerd door middel van eendimensionale TLC met behulp van twee verschillende elutiesystemen en tweedimensionale TLC.Twee soorten methylatieprocedures werden ook uitgevoerd om de aanwezigheid van type vijf mycolzuur te bevestigen. In beide elutiesystemen bevonden de mycolzuren zich ongeveer in het midden van de plaat, hoewel de vlek die overeenkomt met type vijf mycolzuur pas na verzeping werd waargenomen. Tweedimensionale TLC maakt ook de identificatie van individuele mycolische zuurtypen mogelijk.Mycobacterium brumae drukt bijvoorbeeld alleen type één mycolzuren uit, mycobacterium bovis BCG drukt type één en vier uit, mycobacterium fortuitum drukt type één en vijf uit en mycobacterium abcessus drukt type één en twee mycolzuurprofielen uit. De totale lipide-extracten van verschillende mycobacteriënsoorten werden geanalyseerd in functie van hun polariteit en grootte. Het laat zien dat de meeste A polaire lipiden, zoals PDIMs, aanwezig zijn in mycobacterium bovis BCG, maar niet in mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae en het gladde morfotype van M abcessus.Fenolglycollipiden zijn alleen aanwezig in mycobacterium bovis BCG, terwijl GlycoPeptidoLipiden alleen worden waargenomen in monsters van mycobacterium abcessus. Net als bij mycolzuren kunnen acylglycerolen en PDIMs, PIMs, ook gemakkelijk worden gevisualiseerd door middel van eendimensionale TLC- of 2D TLC-analyse. Twee soorten vlekken werden gebruikt om PIMs in eendimensionale TLC te onthullen.Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van dit protocol is om tijdens de procedure geen plastic instrumenten te gebruiken.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Geoptimaliseerde Interferon-gamma ELISpot Assay maatregel T cel antwoorden in het Model van de cavia na vaccinatie

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...