Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
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Diese Forschung wurde vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (RTI2018-098777-B-I00), den FEDER Funds und der Generalitat of Catalunya (2017SGR-229) finanziert. Sandra Guallar-Garrido ist Trägerin eines PhD-Vertrags (FI) der Generalitat de Catalunya.

1. Extraktion der gesamten nicht-kovalenten Lipide aus Mykobakterien (Abbildung 1)
<ol><li>0,2 g Mykobakterien aus einem festen Medium zerkratzen und mit einem Polytetrafluorethlen (PTFE)-Liner-Schraubverschluss in ein Glasrohr geben. Fügen Sie eine Lösung hinzu, die aus 5 ml Chloroform und 10 ml Methanol (Chloroform: Methanol, 1: 2) besteht. HINWEIS: Wenn organische Lösungsmittel verwendet werden, sollte nur Glasempfänger verwendet werden. Kunststoffbehälter sind nicht erlaubt. Da...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. 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E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

Ein einfaches Protokoll, das als Goldstandardmethode für die Extraktion von nichtkovalent verknüpften Lipidverbindungen aus der mykobakteriellen Zellwand gilt, wird vorgestellt. Weitere Visualisierungen durch ein- und zweidimensionale TLCs aus den extrahierten Lipiden von vier verschiedenen Mykobakterien werden gezeigt.
Zwei aufeinander folgende kombinierte Mischungen von Chloroform und Methanol zur Wiederherstellung des Lipidgehalts von Mykobakterienzellen ist die am weitesten verbreitete L...

Mycobacterium ist eine Gattung, die pathogene und nicht-pathogene Arten umfasst, die sich durch eine hochhydrophobe und undurchlässige Zellwand auszeichnen, die durch ihre eigenartigen Lipide gebildet wird. Insbesondere enthält die mykobakterielle Zellwand Mykolsäuren, α-Alkyl- und β-Hydroxyfettsäuren sind, bei denen der α-Zweig in allen Mykolsäuren (mit Ausnahme der Länge) konstant ist und die β-Kette, die Meromykolatkette genannt, eine lange aliphatische Kette ist, die verschiedene funktionelle chemische Gruppen enthalten kann, die zusammen mit der Literatur beschrieben werden (α-, α'-, Methoxy-, κ-, Epoxid-, Carboxy- und ω-1-Methoxy-Mykolaten), die daher sieben Arten von Mykolsäuren (I-VII) produzieren1. Darüber hinaus sind auch andere Lipide von unbestreitbarer Bedeutung in der Zellwand von Mykobakterienarten vorhanden. Pathogene Arten wie Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose2 produzieren spezifische lipidbasierte Virulenzfaktoren wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIMs), phenolisches Glykolipid (PGL), Di-, Tri- und Penta-Acyltrehalose (DAT, TAT und PAT) oder Sulfolipide, unter anderem3. Ihre Anwesenheit auf der mykobakteriellen Oberfläche wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, die Immunantwort des Wirts und damit die Evolution und Persistenz des Mykobakteriums im Wirt zu modifizieren4. Zum Beispiel wurde das Vorhandensein von Triacylglycerinen (TAG) mit dem hypervirulenten Phänotyp der Lineage 2-Beijing-Unterlinie von M. tuberculosis, möglicherweise aufgrund seiner Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts abzuschwächen5,6. Andere relevante Lipide sind Lipooligosaccharide (LOS), die in tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien vorkommen. Im Falle von Mycobacterium marinumhängt das Vorhandensein von LOSs in seiner Zellwand mit der gleitenden Motilität und der Fähigkeit, Biofilme zu bilden, zusammen und stört die Erkennung durch Makrophagenmustererkennungsrezeptoren, was die Aufnahme und Ausscheidung der Bakterien durch Wirtspagoozyten beeinflusst7,8. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen oder Vorhandensein einiger Lipide die Klassifizierung von Mitgliedern derselben Spezies in verschiedene Morphotypen mit virulenten oder dämpfenden Profilen, wenn sie mit Wirtszellen interagieren. Zum Beispiel das Fehlen von Glykopeptidolipiden (GPL) im groben Morphotyp von Mycobacterium abscessus wurde mit der Fähigkeit in Verbindung gebracht, eine intraphagosomale Übersäuerung und folglich Zellapoptose zu induzieren9, im Gegensatz zum glatten Morphotyp, der GPLs in seiner Oberfläche besitzt. Darüber hinaus hängt der Lipidgehalt der mykobakteriellen Zellwand mit der Fähigkeit zusammen, die Immunantwort im Wirt zu modifizieren. Dies ist relevant im Zusammenhang mit der Verwendung einiger Mykobakterien, um ein schützendes Immunprofil gegen verschiedene Pathologien auszulösen10,11,12,13. Es wurde beispielsweise nachgewiesen, dass Mycolicibacterium vaccae, ein saprophytisches Mykobakterium, das sich derzeit in klinischen Phase-III-Studien als immuntherapeutischer Impfstoff gegen Tuberkulose befindet, weisen zwei koloniale Morphotypen auf. Während der glatte Phänotyp, der ein Polyester in seiner Oberfläche enthält, eine Th2-Reaktion auslöst, kann der raue Phänotyp ohne Polyester ein Th1-Profil induzieren, wenn er mit Immunzellen des Wirts interagiert.14. Das Repertoire der in der mykobakteriellen Zelle vorhandenen Lipide hängt nicht nur von mykobakterienarten ab, sondern auch von den Bedingungen der mykobakteriellen Kulturen: Zeitpunkt der Inkubation15,16 oder Zusammensetzung des Kulturmediums17,18. Tatsächlich beeinflussen Veränderungen in der Zusammensetzung des Kulturmediums die Antitumor- und immunstimulierende Aktivität von M. bovis BCG und Mycolicibacterium brumae in vitro17. Darüber hinaus wird das schützende Immunprofil ausgelöst durch M. bovis BCG gegen M. tuberculosis Die Herausforderung in Mäusemodellen hängt auch von den Nährmedien ab, in denen M. bovis BCG wächst17. Diese könnten dann mit der Lipidzusammensetzung der Mykobakterien in jedem Kulturzustand zusammenhängen. Aus all diesen Gründen ist die Untersuchung des Lipidgehalts von Mykobakterien relevant. Ein visuelles Verfahren zur Extraktion und Analyse der Lipidzusammensetzung der mykobakteriellen Zellwand wird vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

Mykobakterienarten können sich in der Wachstumsrate, dem Vorhandensein von Pigmentierung, der koloniemorphologischen Auf festen Medien sowie anderen phänotypischen Merkmalen voneinander unterscheiden. Sie alle haben jedoch den relevantesten Charakter von Mykobakterien gemeinsam: ihre einzigartige und hochhydrophobe Zellwand. Mykobakterien-Arten enthalten einen membrankovalenten Komplex, der Arabinogalactan, Peptidoglycan und lange Ketten von Mykolsäuren mit Typen umfasst, die sich zwischen mykobakterienarten unterscheiden. Darüber hinaus können Mykobakterien auch Lipide produzieren, die sich nicht kovalent auf ihren Zelloberflächen befinden, wie Phthiocerol-Dimycocerosate (PDIM), phenolische Glykolipide (PGL), Glykopeptidolipide (GPL), Acyltrehalose (AT) oder Phosphatidil-Inositol-Mannosiside (PIM). Einige von ihnen gelten als Virulenzfaktoren in pathogenen Mykobakterien oder kritische antigene Lipide in der Wirt-Mykobakterien-Interaktion. Aus diesen Gründen besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung von mykobakteriellen Lipiden aufgrund ihrer Anwendung in verschiedenen Bereichen, vom Verständnis ihrer Rolle bei der Pathogenität von Mykobakterieninfektionen bis hin zu einer möglichen Implikation als immunmodulatorische Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten und anderen Pathologien wie Krebs. Hier wird ein einfacher Ansatz zur Extraktion und Analyse des Gesamtlipidgehalts und der Mykolsäurezusammensetzung von Mykobakterienzellen vorgestellt, die in einem festen Medium unter Verwendung von Mischungen organischer Lösungsmittel gezüchtet wurden. Sobald die Lipidextrakte erhalten sind, wird eine Dünnschichtchromatographie (TLC) durchgeführt, um die extrahierten Verbindungen zu überwachen. Das Beispielexperiment wird mit vier verschiedenen Mykobakterien durchgeführt: dem schnell wachsenden Mycolicibacterium brumae und Mycolicibacterium fortuitum, dem abgeschwächten langsam wachsenden Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) und dem opportunistischen Erreger Mycobacterium abscessus, was zeigt, dass die im vorliegenden Protokoll gezeigten Methoden bei einer Vielzahl von Mykobakterien eingesetzt werden können.

Mit dem Ziel, eine breite Palette von Lipiden in verschiedenen Mykobakterienarten zu zeigen, wurde M. bovis BCG ausgewählt, da es sich um raue und langsam wachsende Mykobakterien handelt. Die rauen und schnell wachsenden M. fortuitum und M. brumae wurden in das Verfahren aufgenommen und schließlich wurde auch der glatte Morphotyp von M. abscessus einbezogen. Diese vier Arten ermöglichen es uns, ein breites Spektrum von mykobakterienbasierten Lipiden wie Acyltrehalose (AT), GPLs, PDI...

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Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.

Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mykobakterien Lipide sind ein wichtiges Merkmal der Gattung und entscheidend für die Interaktionen der Wirte Mykobakterien. Geschwindigkeit und Vielseitigkeit sind die Hauptvorteile dieses Verfahrens. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Lipiden und die Pathogenität von Mykobakterien und ihre immunstimulierende Wirkung zu verstehen.Für die Extraktion nicht-kovalenter verknüpfter Lipide werden 15 Milliliter ein bis zwei Chloroform zu Methanollösung in ein Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss unter einer laminaren Strömungshaube gegeben. Dann kratzen Sie 200 Milligramm Mykobakterien aus einem festen Medium und fügen Sie die Mykobakterien in die Glasröhre hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren.Am nächsten Tag filtern Sie die organischen Lösungsmittel durch einen mit Filterpapier ausgekleideten Glastrichter in ein Glasrohr. Nach der Verwendung von Stickstoffgasfluss, um die flüssige Phase im Rohr zu verdampfen, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas, um das Rohr bei vier Grad Celsius zu speichern. Dann fügen Sie 15 Milliliter eines Zwei-zu-Eins-Chloroforms zu Methanollösung zu den Zelltrümmern hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht unter ständigem Rühren.Lassen Sie die Mischung am nächsten Morgen eine Stunde ruhen, bevor Sie mit einer Pasteur-Pipette die organischen Lösungsmittel in einen mit Filterpapier ausgekleideten Glastrichter in dasselbe Glassammelrohr überführen. Anschließend verdampfen Sie die flüssige Phase wie gezeigt, bevor Sie das Rohr für eine Lagerung von vier Grad Celsius mit Stickstoffgas auffüllen. Für die Mykolsäureextraktion zwei bis fünf Milliliter einer Rührlösung und 200 Milligramm Mykobakterien-Biomasse in ein hermetisches Glasrohr mit einem PTFE-Liner-Schraubverschluss geben und den Inhalt durch Wirbeln mischen.Inkubieren Sie die Mischung in einem trockenen Bad bei 80 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag, wenn das Rohr Raumtemperatur abgekühlt hat, fügen Sie zwei Milliliter N-Hexan hinzu und mischen Sie den Inhalt für 30 Sekunden durch Wirbeln. Lassen Sie das Rohr sich absetzen, bis zwei klare Phasen auftreten, und übertragen Sie die obere N-Hexanphase auf ein neues Rohr.Mischen Sie zwei zusätzliche Milliliter N-Hexan mit dem Röhrcheninhalt und sammeln Sie die obere Schicht wieder auf. Dann verdampfen Sie den Rohrinhalt durch Stickstofffluss und lagern Sie die mit Stickstoff bedeckte Probe bei vier Grad Celsius, wie gezeigt. Um die Proben mit TLC zu analysieren, bedecken Sie eine Wand der TLC-Kammer mit einem Stück Filterpapier, fügen Sie Vaseline auf die Kammerecken hinzu, um die Kammer zu versiegeln, um die Lösungsmittelmischung über das Filterpapier zu geben und das verbleibende Volumen des Lösungsmittels auf den Boden der TLC-Kammer zu geben.Schließen Sie die TLC-Kammer für mindestens 20 Minuten bis gesättigt. In der Zwischenzeit die Lipide im Glasrohr in 200 bis 1000 Mikroliter Chloroform auflösen und mit einem Kapillarglasrohr 10 Mikroliter der Lipidchloroformsuspension direkt auf die TLC-Platte auftragen. Nachdem Sie die Probe fünf Minuten trocknen lassen, legen Sie die Platte in die gesättigte TLC-Kammer ein und lassen Sie die mobile Phase durch den TLC laufen.Wenn das Lösungsmittel einen Zentimeter vom oberen Ende der Platte entfernt ist, legen Sie die Platte unter laminares Flussmittel, bis die Kieselsäure vollständig trocken ist. Dann besprühen Sie die getrocknete Platte mit 15 bis 20 Millilitern 10% molarer Datenphosphorsäurehydrat in Ethanol, bis die Platte hellgelb ist, und erhitzen Sie die Platte für zwei bis fünf Minuten bei 120 Grad Celsius. In dieser repräsentativen Analyse wurde die aus verschiedenen Mykobakterienarten extrahierte Mykolsäure durch eindimensionale TLC mit zwei verschiedenen Elutionssystemen und zweidimensionalem TLC analysiert.Zwei Arten von Methylierungsverfahren wurden ebenfalls durchgeführt, um das Vorhandensein von Typ-Fünf-Mykolsäure zu bestätigen. In beiden Elutionssystemen befanden sich die Mykolsäuren ungefähr in der Mitte der Platte, obwohl der Punkt, der der Mykolsäure typ fünf entspricht, erst nach der Verseifung beobachtet wurde. Zweidimensionales TLC ermöglicht auch die Identifizierung einzelner Mykolsäuretypen.Zum Beispiel exprimiert Mycobacterium brumae nur Mykolsäuren vom Typ eins, Mycobacterium bovis BCG exprimiert Typ eins und vier, Mycobacterium fortuitum exprimiert Typ eins und fünf und Mycobacterium abcessus exprimiert Typ eins und zwei Mykolsäureprofile. Die Gesamtlipidextrakte verschiedener Mykobakterienarten wurden in Abhängigkeit von ihrer Polarität und Größe analysiert. Es zeigt sich, dass die meisten A-polaren Lipide, wie PDIMs, in Mycobacterium bovis BCG vorhanden sind, aber nicht in Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium brumae und dem glatten Morphotyp von M abzessus.Phenolische Glykolipide sind nur in Mycobacterium bovis BCG vorhanden, während Glykopeptidolipide nur in Proben von Mycobacterium abcessus beobachtet werden. Ähnlich wie Mykolsäuren können auch Acylglycerole und PDIMs, PIMs, durch eindimensionale TLC- oder 2D-TLC-Analyse leicht visualisiert werden. Zwei Arten von Flecken wurden verwendet, um PIMs in eindimensionalem TLC aufzudecken.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Protokoll erinnern sollten, ist, während des gesamten Verfahrens keine Kunststoffinstrumente zu verwenden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...