Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי (RTI2018-098777-B-I00), קרנות FEDER, ואת הגנרליטאט של קטלוניה (2017SGR-229). סנדרה גולאר-גארידו היא זוכת חוזה לדוקטורט (FI) מהגנרליטאט דה קטלוניה.

1. הפקת השומנים הלא-קוולנטיים הכוללים ממיקובקטריה (איור 1)
<ol><li>יש לגרד 0.2 גרם של מיקובקטריה ממדיה מוצקה ולהוסיף לצינור זכוכית עם כובעי בורג פוליטרפלואורואתלין (PTFE). הוסף פתרון המורכב מ-5 מ"ל של כלורופורם ו-10 מ"ל של מתנול (כלורופורם:מתנול, א' 2). הערה: כאשר נעשה שימוש בממסים אור?...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. A., Gillois, M., Lan&#233;elle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphthienoyl+trehalose,+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus.">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li><li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids.">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li><li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354.">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li><li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

פרוטוקול פשוט נחשב כשיטה תקן הזהב להפקת תרכובות שומנים שאינן מקושרות ללא קולן מקיר התא mycobacterial מוצג. הדמיה נוספת על ידי TLCs אחד דו מימדי מן השומנים שחולצו של ארבעה mycobacteria שונים מוצג.
שתי תערובות משולבות רצופות של כלורופורם ומתנול כדי לשחזר את התוכן השומנים של תאים mycobacterial הוא...

Mycobacterium הוא סוג הכולל מינים פתוגניים ולא פתוגניים, המאופיינת בקיר תא הידרופובי וחצוף מאוד שנוצר על ידי השומנים המוזרים שלהם. באופן ספציפי, דופן התא mycobacterial מכיל חומצות מיקוליות, אשר α-אלקיל וחומצות שומן הידרוקסיות β, שבהן הענף α קבוע בכל החומצות המיקוליות (למעט האורך) ושרשרת β, הנקראת שרשרת מרומיקולאט, היא שרשרת אליפטית ארוכה שעשויה להכיל קבוצות כימיות פונקציונליות שונות המתוארות יחד עם הספרות (α, α'-, מתוקסי-, κ-, אפוקסי-, קרבוקסי-, ו ω-1-מתוקסי- mycolates), ולכן לייצר שבעה סוגים של חומצות מיקוליות (I-VII)1. יתר על כן, שומנים אחרים עם חשיבות מוטלת בספק נמצאים גם בקיר התא של מינים mycobacteria. מינים פתוגניים כגון Mycobacterium tuberculosis, הסוכן הסיבתי של שחפת2 לייצר גורמי וירוליאנס ספציפיים מבוססי שומנים כגון פטיוצול דימיקוצריסטים (PDIMs), גליקוליפידים פנוליים (PGL), די,, תלת-, ופנטה-אציטרהאלוז (DAT, TAT ו- PAT), או סולגוליפידים, בין היתר3. נוכחותם על פני השטח המיקובקטריאליים נקשרה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארחת ולכן, האבולוציה וההתמדה של המיקובקטריום בתוך הפונדקאי4. לדוגמה, נוכחות של triacylglycerols (TAG) קושרה פנוטיפ היפר-ויראלי של שושלת שושלת 2-בייג'ינג של M. tuberculosis, אולי בשל יכולתו להנחית את התגובה החיסונית המארחת5,6. שומנים רלוונטיים אחרים הם lipooligosaccharides (LOSs) נוכח מיקובקטריה שחפת ולאtuberculous. במקרה של Mycobacterium marinumנוכחותו של LOSs בקיר התא שלה קשורה תנועתיות הזזה ואת היכולת ליצור biofilms ומפריעה לזיהוי על ידי קולטני זיהוי דפוס מקרופאגים, המשפיעים על ספיגה וחיסול של החיידקים על ידי פאגוציטים מארחים7,8. בנוסף, היעדר או נוכחות של שומנים מסוימים מאפשרת לחברים מאותו המין להיות מסווגים למורפוטיפים שונים עם פרופילים אלימים או מוחלשים בעת אינטראקציה עם תאים מארחים. לדוגמה, היעדר גליקופפטידוליפידים (GPL) במורפוטיפ המחוספס של Mycobacterium abscessus נקשר ליכולת לגרום להחמצה תוך-פאגוזומלית, וכתוצאה מכך אפופטוזיס של תאים9שלא כמו מורפוטיפ חלק בעל GPLs על פני השטח שלהם., יתר על כן, התוכן השומנים של דופן התא mycobacterial קשורה ליכולת לשנות את התגובה החיסונית המארח. זה רלוונטי בהקשר של שימוש במיקובקטריה כלשהי כדי לעורר פרופיל חיסוני מגן מפני פתולוגיות שונות10,11,12,13. זה הוכח, למשל, כי Mycolicibacterium vaccaeמיקובקטריום ספרופיטי, הנמצא כעת בניסויים קליניים בשלב III כחיסון אימונותרפי לשחפת, מציג שני מורפוטיפים קולוניאליים., בעוד פנוטיפ חלק, המכיל פוליאסטר על פני השטח שלה, מפעיל תגובת Th2, פנוטיפ מחוספס נטול פוליאסטר יכול לגרום פרופיל Th1 כאשר הוא אינטראקציה עם תאים חיסוניים מארחים14. הרפרטואר של שומנים הנמצאים בתא mycobacterial לא רק תלוי מינים mycobacteria, אלא גם על התנאים של תרביות mycobacterial: זמן הדגירה15,16 או הרכב המדיום התרבותי17,18. למעשה, שינויים בהרכב המדיום התרבותי משפיעים על הפעילות האנטי-אטומית והאימונוסטימולטורית של M. bovis BCG ו Mycolicibacterium brumae in vitro17. יתר על כן, הפרופיל החיסוני המגן מופעל על ידי M. bovis BCG נגד M. tuberculosis האתגר במודלים של עכברים תלוי גם בתקשורת התרבותית שבה M. bovis BCG גדל17. אלה יכולים להיות קשורים להרכב השומנים של mycobacteria בכל מצב תרבית. מכל הסיבות הללו, המחקר של תוכן השומנים של mycobacteria רלוונטי. הליך חזותי כדי לחלץ ולנתח את הרכב השומנים של דופן התא mycobacterial מוצג.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

מינים Mycobacteria יכול להיות שונה זה מזה בקצב הצמיחה, נוכחות של פיגמנטציה, מורפולוגיה המושבה המוצגת על מדיה מוצקה, כמו גם מאפיינים פנוטיפיים אחרים. עם זאת, לכולם יש במשותף את האופי הרלוונטי ביותר של mycobacteria: דופן התא הייחודי והידרופובי מאוד שלה. מינים של מיקובקטריה מכילים קומפלקס מקושר-קוולנטי הכולל ערבינוגלקטן, פפטידוגליקן ושרשראות ארוכות של חומצות מיקוליות עם סוגים שונים בין מיני מיקובקטריה. בנוסף, mycobacteria יכול גם לייצר שומנים הממוקמים, שאינם קוולנטיים מקושרים, על משטחי התא שלהם, כגון פטיוצול dimycocerosates (PDIM), גליקולפידים פנוליים (PGL), גליקופפטידוליפידים (GPL), אציטרהאלוז (AT), או פוספטידיל-אינוזיטול mannosides (PIM), בין היתר. חלקם נחשבים גורמי ארס במיקובקטריה פתוגנית, או שומנים אנטיגניים קריטיים באינטראקציה בין מארח-מיקובקטריה. מסיבות אלה, יש עניין משמעותי בחקר השומנים mycobacterial בשל היישום שלהם במספר תחומים, מהבנת תפקידם בפתוגניות של זיהומים mycobacteria, למשמעות אפשרית כמו סוכנים אימונומודולטוריים לטיפול במחלות זיהומיות ופתולוגיות אחרות כגון סרטן. כאן, גישה פשוטה כדי לחלץ ולנתח את התוכן השומנים הכולל ואת הרכב חומצה mycolic של תאי mycobacteria גדל במדיום מוצק באמצעות תערובות של ממיסים אורגניים מוצג. לאחר תמציות השומנים מתקבלים, כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) מבוצעת כדי לפקח על תרכובות שחולצו. הניסוי לדוגמה מבוצע עם ארבעה מיקוביבקטריה שונים: Mycolicibacterium brumae ו- Mycolicibacterium fortuitum, Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) הגדלים במהירות: מיקובקטריום מורסה הגדל במהירות על ידי מיקוליצ'יבקטריום, המוכיח כי שיטות המוצגות בפרוטוקול הנוכחי יכולות לשמש למגוון רחב של מיקובקטריה.

במטרה להראות מגוון רחב של שומנים הנמצאים במינים שונים של מיקובקטריה, M. bovis BCG נבחר מכיוון שהוא מיקובקטריה מחוספסת וצמיחה איטית. בהליך נוספו בהליך גם המונופוטיפ החלק של מורסה. ארבעת המינים הללו מאפשרים לנו לדמיין ספקטרום רחב של שומנים שמקורם במיקובקטריה כגון אצילטרולו?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

פרוטוקול מוצג כדי לחלץ את התוכן השומנים הכולל של דופן התא של מגוון רחב של mycobacteria. יתר על כן, מיצוי ופרוטוקולים אנליטיים של סוגים שונים של חומצות מיקוליות מוצגים. פרוטוקול כרומטוגרפי בשכבה דקה לניטור תרכובות מיקובקטיות אלה מסופק גם כן.

ניתוח הרכב השומנים של מיקובקטריה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

ליפידים Mycobacteria הם מאפיין חשוב של הסוג והם קריטיים באינטראקציות Mycobacteria המארח. מהירות ורב-תכליתיות הם היתרונות העיקריים של הליך זה. שיטה זו יכולה לשמש כדי להבין את התפקיד של שומנים ואת הפתוגניות של mycobacteria ואת האפקט immunostimulatory שלהם.עבור מיצוי שומנים מקושרים שאינם קוולנטיים, להוסיף 15 מיליליטר של כלורופורם אחד עד שניים לפתרון מתנול צינור זכוכית עם כובע בורג אניה PTFE מתחת למכסה המנוע זרימה למינאר. לאחר מכן, לגרד 200 מיליגרם של mycobacteria מדיום מוצק, ולהוסיף את mycobacteria לצינור הזכוכית. לדגור על הצינור לילה עם ערבוב מתמיד.למחרת, לסנן את הממסים האורגניים דרך משפך זכוכית מרופד בנייר מסנן לתוך צינור זכוכית. לאחר שימוש בשטף גז חנקן, כדי לאדות את השלב הנוזלי בצינור, למלא את הצינור עם גז חנקן, כדי לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של שניים לאחד כלורופורם לפתרון מתנול לפסולת הסלולר ולדגירה על הצינור לילה עם ערבוב מתמיד.למחרת בבוקר, לאפשר את התערובת לנוח במשך שעה אחת, לפני השימוש פיפטה פסטר להעביר את הממסים האורגניים לתוך משפך זכוכית מרופד נייר מסנן לתוך אותו צינור איסוף זכוכית. לאחר מכן, לאדות את השלב הנוזלי כפי שהוכח, לפני מילוי הצינור עם גז חנקן עבור ארבע מעלות צלזיוס אחסון. להפקת חומצה מיקולית, הוסיפו שניים עד חמישה מיליליטרים של תמיסה מעוררת ו-200 מיליגרם של ביומסה של מיקובקטריה לצינור זכוכית הרמטי עם מכסה בורג PTFE, וערבבו את התוכן על ידי מערבולת.לדגור על התערובת בתוך אמבטיה יבשה ב 80 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, כאשר הצינור יש טמפרטורת החדר מקורר, להוסיף שני מיליליטר של N hexane, ולערבב את התוכן במשך 30 שניות על ידי מערבולת. אפשר לצינור להתיישב עד ששני שלבים ברורים יופיעו והעבירו את שלב ה- N הקסאן העליון לצינור חדש.מערבבים שני מיליליטרים נוספים של הקסאן N עם תוכן הצינור ולאסוף את השכבה העליונה שוב. לאחר מכן, לאדות את תוכן הצינור על ידי זרימת חנקן ולאחסן את המדגם מכוסה חנקן בארבע מעלות צלזיוס כפי שהודגם. כדי לנתח את הדגימות על ידי TLC לכסות קיר אחד של תא TLC עם פיסת נייר מסנן, להוסיף וזלין בפינות התא כדי לאטום את התא, כדי יכול תערובת ממס על נייר המסנן ולהוסיף את הנפח הנותר של הממס לתחתית תא TLC.סגור את תא TLC למשך 20 דקות לפחות לרוויה. בינתיים, להמיס את השומנים בצינור הזכוכית ב 200 עד 1000 microliters של כלורופורם ולהשתמש צינור זכוכית נימי כדי להחיל 10 microliters של השעיית כלורופורם השומנים ישירות על צלחת TLC. לאחר מתן אפשרות לדגימה להתייבש במשך חמש דקות, הכנס את הצלחת לתא TLC הרווי ואפשר לשלב הנייד לרוץ דרך TLC.כאשר הממס מגיע סנטימטר אחד מהקצה העליון של הצלחת, מניחים את הצלחת מתחת לשטף למינאר עד שהסיליקה יבשה לחלוטין. לאחר מכן, לרסס את הצלחת היבשה עם 15 עד 20 מיליליטר של 10% נתונים טוחנים חומצה זרחתית לחות באתנול עד הצלחת הוא צהוב בהיר, ולחמם את הצלחת במשך שתיים עד חמש דקות ב 120 מעלות צלזיוס. בניתוח מייצג זה, החומצה המיקולית המופקת ממיני מיקובקטריה שונים, נותחה באמצעות TLC חד ממדי באמצעות שתי מערכות אלוציה שונות ו- TLC דו ממדי.שני סוגים של הליכי מתילציה בוצעו גם כדי לאשר את נוכחותה של חומצה מיקולית מסוג חמש. בשתי מערכות ההבחנה, החומצות המיקוליות היו ממוקמות בערך באמצע הצלחת, אם כי, הנקודה המתאימה לחומצה מיקולית מסוג חמש, נצפתה רק לאחר הספוניפיקציה. TLC דו מימדי מאפשר גם זיהוי של סוגי חומצה מיקולית בודדים.לדוגמה, mycobacterium brumae מבטא רק סוג אחד חומצות מיקוליות, mycobacterium bovis BCG מבטא סוג אחד וארבע, מזל mycobacterium מבטא סוג אחד וחמש, ו mycobacterium abcessus מבטא סוג אחד ושני פרופילי חומצה מיקולית. סך תמציות השומנים ממיני מיקובקטריה שונים נותחו בתפקוד הקוטביות והגודל שלהם. הוא מגלה כי רוב שומנים קוטביים, כגון PDIMs, נמצאים במיקובקטריום bovis BCG, אך לא במוצקי מיקוביצריום, מיקובקטריום בומה והמורפוטיפ החלק של M abcessus.GlycoLipids פנולי נמצאים רק mycobacterium bovis BCG, בעוד GlycoPeptidoLipids נצפים רק בדגימות מ mycobacterium abcessus. בדומה לחומצות מיקוליות, אציליצרילס ו- PDIMs, PIMs, ניתן גם לדמיין בקלות באמצעות ניתוח TLC חד ממדי או 2D TLC. שני סוגים של כתמים שימשו כדי לחשוף PIMs ב- TLC חד ממדי.הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא לא להשתמש בכל מכשירים מפלסטיק לאורך כל ההליך.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...