Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av det spanske vitenskaps-, innovasjons- og universitetsdepartementet (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Funds og Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido er mottaker av en ph.d.-kontrakt (FI) fra Generalitat de Catalunya.

1. Ekstraksjon av de totale ikke-kovalente lipidene fra mykobakterier (figur 1)
<ol><li>Ripe 0,2 g mykobakterier fra et solidt medium og legg til et glassrør med en polytetrafluorethlene (PTFE) foringsskruehett. Tilsett en løsning som består av 5 ml kloroform og 10 ml metanol (kloroform:metanol, 1:2). MERK: Når organiske løsemidler brukes, skal kun glassmottaker brukes. Ingen plastbeholdere er tillatt. Videre er PTFE foringsskruehetter for flasker nødvendig. FORSIKTIG: Klorofor...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. A., Gillois, M., Lan&#233;elle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphthienoyl+trehalose,+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus.">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li><li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids.">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li><li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354.">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li><li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

En enkel protokoll betraktet som gullstandardmetoden for utvinning av ikke-sammenhengende lipidforbindelser fra mykobakteriell cellevegg presenteres. Videre visualisering av en- og todimensjonale TLD-er fra de ekstraherte lipidene til fire forskjellige mykobakterier vises.
To påfølgende kombinerte blandinger av kloroform og metanol for å gjenopprette lipidisk innhold av mykobakterielle celler er den mest brukte løsningsmiddelblandingen23,<sup class="xref"...

Mycobacterium er et slekt som består av patogene og ikke-patogene arter, preget av å ha en svært hydrofob og ugjennomtrengelig cellevegg dannet av deres særegne lipider. Spesielt inneholder den mykobakterielle celleveggen mykolsyrer, som er α-alkyl og β-hydroksy fettsyrer, der α-grenen er konstant i alle mykolsyrer (unntatt lengden) og β-kjeden, kalt meromycolate kjeden, er en lang alifatisk kjede som kan inneholde forskjellige funksjonelle kjemiske grupper beskrevet sammen med litteraturen (α-, α'-, metoksy-, metoksy-, κ-, epoksy-, karboksy- og ω-1-metoksy-mykolater), og produserer derfor syv typer mykolsyrer (I-VII)1. Videre er andre lipider med utvilsomt betydning også til stede i celleveggen til mykobakterier. Patogene arter som Mycobacterium tuberculosis, årsaksmiddelet til tuberkulose2 produsere spesifikke lipidbaserte virulensfaktorer som phthiocerol dimycocerosates (PDIMs), fenolisk glykolipid (PGL), di-, tri- og penta-acyltrehaloser (DAT, TAT og PAT), eller sulfolipider, blant andre3. Deres tilstedeværelse på den mykobakterielle overflaten har vært forbundet med evnen til å endre vertens immunrespons og derfor utviklingen og utholdenheten til mykobakterien inne i verten.4. For eksempel har tilstedeværelsen av triacylglyseroler (TAG) vært forbundet med den hypervirulente fenotypen av lineage 2-Beijing underlinje av M. tuberculosis, muligens på grunn av sin evne til å dempe vertens immunrespons5,6. Andre relevante lipider er lipooligosakkarider (LOS) tilstede i tuberkuløs og ikketuberculous mykobakterier. Når det gjelder Mycobacterium marinum, tilstedeværelsen av LOSs i celleveggen er relatert til glidende motilitet og evnen til å danne biofilmer og forstyrrer anerkjennelse av makrofag mønstergjenkjenningsreseptorer, som påvirker opptak og eliminering av bakteriene av vertsfosytter.7,8. I tillegg tillater fraværet eller tilstedeværelsen av noen lipider medlemmer av samme art å bli klassifisert i forskjellige morfotyper med virulente eller dempe profiler når de samhandler med vertsceller. For eksempel er fraværet av glykopeptidolipider (GPL) i den grove morfotypen av Mycobacterium abscessus har vært assosiert med evnen til å indusere intrafaggosomal forsuring, og følgelig celleapoptose9, i motsetning til den glatte morfotypen som har GPLer i overflaten. Videre er lipidinnholdet i den mykobakterielle celleveggen relatert til evnen til å endre immunresponsen hos verten. Dette er relevant i sammenheng med bruk av noen mykobakterier for å utløse en beskyttende immunprofil mot forskjellige patologier.10,11,12,13. Det har for eksempel blitt demonstrert at Mycolicibacterium vaccae, en saprofytisk mykobakteri, som for tiden er i kliniske fase III-studier som en immunterapeutisk vaksine mot tuberkulose, viser to koloniale morfotyper. Mens den glatte fenotypen, som inneholder en polyester i overflaten, utløser en Th2-respons, kan den grove fenotypen uten polyester indusere en Th1-profil når den samhandler med vertsimmunceller.14. Repertoaret av lipider tilstede i mykobakterielle cellen avhenger ikke bare av mykobakterier, men også på forholdene til mykobakterielle kulturer: inkubasjonstidspunkt15,16 eller sammensetningen av kulturmediet17,18. Faktisk påvirker endringer i kulturmediumsammensetningen antitumor- og immunostimulatorisk aktivitet av M. bovis BCG og Mycolicibacterium brumae in vitro17. Dessuten utløses den beskyttende immunprofilen av M. bovis BCG mot M. tuberculosis utfordringen i musmodeller avhenger også av kulturmediene der M. bovis BCG vokser17. Disse kan da være relatert til lipidsammensetningen av mykobakterien i hver kulturtilstand. Av alle disse grunnene er studiet av lipidinnholdet i mykobakterier relevant. En visuell prosedyre for å trekke ut og analysere lipidsammensetningen til den mykobakterielle celleveggen presenteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

Mycobacteria arter kan avvike fra hverandre i veksthastigheten, tilstedeværelse av pigmentering, kolonimorfologien som vises på faste medier, samt andre fenotypiske egenskaper. Imidlertid har de alle til felles den mest relevante karakteren av mykobakterier: dens unike og svært hydrofobe cellevegg. Mycobacteria arter inneholder et membran-kovalent knyttet kompleks som inkluderer arabinogalactan, peptidoglykan, og lange kjeder av mykolsyrer med typer som varierer mellom mykobakterier arter. I tillegg kan mykobakterier også produsere lipider som er plassert, ikke-kovalente, på celleoverflatene, for eksempel feniocerol dimykocerosater (PDIM), fenoliske glykolipider (PGL), glykopeptidolipider (GPL), akryltrehaloser (AT) eller fosfatidil-inositol mannosider (PIM), blant andre. Noen av dem betraktes som virulensfaktorer i patogen mykobakterier, eller kritiske antigene lipider i host-mykobakterier interaksjon. Av disse grunnene er det en betydelig interesse for studiet av mykobakterielle lipider på grunn av deres anvendelse på flere felt, fra å forstå deres rolle i patogeniteten av mykobakterier infeksjoner, til en mulig implikasjon som immunmodulerende midler for behandling av smittsomme sykdommer og andre patologier som kreft. Her presenteres en enkel tilnærming for å trekke ut og analysere det totale lipidinnholdet og myksyresammensetningen av mykobakterierceller som vokser i et fast medium ved hjelp av blandinger av organiske løsningsmidler. Når lipidekstraktene er oppnådd, utføres tynnlagskromatografi (TLC) for å overvåke de ekstraherte forbindelsene. Eksempeleksperimentet utføres med fire forskjellige mykobakterier: den miljømessige raskt voksende Mycolicibacterium brumae og Mycolicibacterium fortuitum, den svekkede langsomt voksende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), og det opportunistiske patogenet raskt voksende Mycobacterium abscessus, som viser at metoder vist i den nåværende protokollen kan brukes til et bredt spekter av mykobakterier.

Med sikte på å vise et bredt spekter av lipider tilstede i forskjellige mykobakterier, ble M. bovis BCG valgt som det er grov og langsomt voksende mykobakterier. Den grove og raskt voksende M. fortuitum og M. brumae ble tilsatt i prosedyren, og til slutt ble den glatte morfotypen til M. abscessus også inkludert. Disse fire artene tillater oss å visualisere et bredt spekter av mykobakterier-avledede lipider som acyltrehaloses (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM og TMM. Videre har alle f...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

En protokoll presenteres for å trekke ut det totale lipidinnholdet i celleveggen til et bredt spekter av mykobakterier. Videre vises ekstraksjons- og analytiske protokoller av de forskjellige typer mykolsyrer. En tynnlags kromatografisk protokoll for å overvåke disse mykobakterielle forbindelsene er også gitt.

Analyse av Lipidsammensetningen av mykobakterier ved tynn lagkromatografi

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacteria Lipids er en viktig egenskap ved slekten og er kritisk i vert Mycobacteria interaksjoner. Hastighet og allsidighet er de viktigste fordelene ved denne prosedyren. Denne metoden kan brukes til å forstå lipidenes rolle og patogeniteten til mykobakterier og deres immunostimulatoriske effekt.For ikke-kovalente koblede lipider ekstraksjon, tilsett 15 milliliter av en til to kloroform til metanoloppløsning til et glassrør med en PTFE liner skruehett under en laminær strømningshette. Deretter riper du 200 milligram mykobakterier fra et solidt medium, og legger mykobakterien til glassrøret. Inkuber røret over natten med konstant omrøring.Neste dag filtrerer du de organiske løsningsmidlene gjennom en glasstrakt foret med filterpapir i et glassrør. Etter å ha brukt nitrogengassfluks, for å fordampe væskefasen i røret, fyll røret med nitrogengass, for å lagre røret ved fire grader Celsius. Tilsett deretter 15 milliliter av en to til en kloroform til metanoloppløsning til cellulært rusk og inkuber røret over natten med konstant omrøring.Neste morgen, la blandingen hvile i en time, før du bruker en Pasteur pipette for å overføre de organiske løsningsmidlene til en filterpapirforet glasstrakt til samme glassoppsamlingsrør. Deretter fordamper du væskefasen som demonstrert, før du fyller på røret med nitrogengass for fire grader Celsius-lagring. For mykolsyreutvinning, tilsett to til fem milliliter av en røreløsning og 200 milligram mykobakterierbiomasse til et hermetisk glassrør med en PTFE liner skruehett, og bland innholdet ved virvel.Inkuber blandingen inne i et tørt bad ved 80 grader Celsius over natten. Neste dag, når røret har avkjølt romtemperatur, tilsett to milliliter N heksan, og bland innholdet i 30 sekunder ved virveling. La røret slå seg ned til to klare faser vises og overfør den øvre N-sekskantfasen til et nytt rør.Bland to ekstra milliliter N-heksan med rørinnholdet og samle det øvre laget igjen. Deretter fordamper du rørinnholdet ved nitrogenstrøm og lagrer prøven dekket av nitrogen ved fire grader Celsius som demonstrert. For å analysere prøvene ved TLC dekke en vegg av TLC-kammeret med et stykke filterpapir, legg vaselin på kammerhjørnene for å forsegle kammeret, for å kunne løsningsmiddelblandingen over filterpapiret og legge til det gjenværende volumet av løsningsmidlet til bunnen av TLC-kammeret.Lukk TLC-kammeret i minst 20 minutter for å mette. I mellomtiden oppløser lipidene i glassrøret i 200 til 1000 mikroliter kloroform og bruk et kapillærglassrør for å påføre 10 mikroliter lipidklorformfjæring direkte på TLC-platen. Etter å ha latt prøven tørke i fem minutter, sett platen inn i det mettede TLC-kammeret og la den mobile fasen gå gjennom TLC.Når løsningsmidlet når en centimeter fra den øvre enden av platen, plasser platen under laminær flux til silikaen er helt tørr. Spray deretter den tørkede platen med 15 til 20 milliliter 10% molar datafosforsyrehydrat i etanol til platen er lyse gul, og varm platen i to til fem minutter ved 120 grader Celsius. I denne representative analysen ble myksyren ekstrahert fra ulike mykobakterier, analysert gjennom endimensjonal TLC ved hjelp av to forskjellige elutionsystemer og todimensjonale TLC.To typer metyleringsprosedyrer ble også utført for å bekrefte tilstedeværelsen av type fem myksyre. I begge elutionsystemene var mykolsyrene plassert omtrent midt på platen, men stedet som tilsvarer type fem mykolsyre, ble observert bare etter saponering. Todimensjonal TLC tillater også identifisering av individuelle mykolsyretyper.For eksempel uttrykker mykobakterier brumae bare type en mykolsyre, mycobacterium bovis BCG uttrykker type en og fire, mycobacterium fortuitum uttrykker type en og fem, og mycobacterium abcessus uttrykker type en og to mykolicsyreprofiler. De totale lipidekstraktene fra ulike mykobakterier ble analysert i funksjon av deres polaritet og størrelse. Det avslører at de fleste A polar lipider, som PDIMs, er til stede i mycobacterium bovis BCG, men ikke i mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae og den glatte morphotype av M abcessus.Fenoliske glykolipider er bare tilstede i mykobakterier bovis BCG, mens GlycoPeptidoLipids bare observeres i prøver fra mykobakterier abcessus. I likhet med myksyrer kan Acylglyserols og PDIMer, PIMer, også enkelt visualiseres gjennom endimensjonal TLC- eller 2D TLC-analyse. To typer flekker ble brukt til å avsløre PIMer i endimensjonal TLC.Det viktigste å huske når du prøver denne protokollen er å ikke bruke noen plastinstrumenter gjennom hele prosedyren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

En mikroskopisk fenotypisk analyse for kvantifisering av intracellulær mykobakterier tilpasset høygjennomstrømning / screening av høyt innhold

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse av epitelisk skade produsert av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infeksjon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Rapid Analyse av kromosomavvik i Mouse B-lymfocytter ved PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisering av Charcoal Agar Resazurin analyse for Semi-kvantitativ, Medium-throughput telling av mykobakterier

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Parafin innebygging og tynn snitting av mikrobielle kolonien biofilm for mikroskopisk analyse

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimalisert Interferon-gamma ELISpot analysen mål T celle tiltak i Guinea Gris modellen etter vaksinering

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Analyse av lipid dråpe innhold i fisjon og spirende gjær bruker automatisert image processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer produsert av Iron-Limited mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...