Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Ministério da Ciência, Inovação e Universidades da Espanha (RTI2018-098777-B-I00), pelos Feder Funds e pela Generalitat da Catalunha (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido é beneficiária de um contrato de doutorado (FI) da Generalitat de Catalunya.

1. Extração do total de lipídios não covalentes da micobactéria (Figura 1)
<ol><li>Arranhe 0,2 g de micobactérias de uma mídia sólida e adicione a um tubo de vidro com tampas de parafuso de revestimento politetrafluoroethlene (PTFE). Adicione uma solução composta por 5 mL de clorofórmio e 10 mL de metanol (clorofórmio:metanol, 1:2). NOTA: Quando forem utilizados solventes orgânicos, apenas o recipiente de vidro deve ser utilizado. Não são permitidos recipientes plásticos...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. A., Gillois, M., Lan&#233;elle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphthienoyl+trehalose,+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus.">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li><li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids.">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li><li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354.">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li><li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

Um protocolo simples considerado como o método padrão-ouro para a extração de compostos lipídicos não covalentes ligados da parede celular micobacteriana é apresentado. Uma visualização adicional por TLCs unidimensionais dos lipídios extraídos de quatro micobactérias diferentes é mostrada.
Duas misturas combinadas consecutivas de clorofórmio e metanol para recuperar o teor lipídico das células micobacterianas é a mistura de solvente mais utilizada23<sup...

Mycobacterium é um gênero que compreende espécies patogênicas e não patogênicas, caracterizada por ter uma parede celular altamente hidrofóbica e impermeável formada por seus lipídios peculiares. Especificamente, a parede celular micobacteriana contém ácidos micólicos, que são α-alquila e β-hidroxis, nos quais o α-ramo é constante em todos os ácidos micólicos (exceto pelo comprimento) e a cadeia de β, chamada cadeia meromycolate, é uma longa cadeia alifática que pode conter diferentes grupos químicos funcionais descritos junto com a literatura (α-, α'-, metoxical Κ-, epóxi-, carboxy-, e ω-1-metoxi-mycolates), produzindo assim sete tipos de ácidos míclicos (I-VII)1. Além disso, outros lipídios com importância inquestionável também estão presentes na parede celular das espécies de micobactérias. Espécies patogênicas como Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose2 produzir fatores específicos de virulência à base de lipídios, como dimicocerosates de fleuorol (PDIMs), glicolipídio fenólico (PGL), di-, tri-, e penta-acyltrehaloses (DAT, TAT e PAT), ou sulfolipídios, entre outros3. Sua presença na superfície micobacteriana tem sido associada com a capacidade de modificar a resposta imune do hospedeiro e, portanto, a evolução e persistência do micobacterium dentro do hospedeiro4. Por exemplo, a presença de triacylglycerols (TAG) tem sido associada ao fenótipo hipervirulento da subadequação lineage 2-Pequim de M. tuberculosis, possivelmente devido à sua capacidade de atenuar a resposta imune hospedeiro5,6. Outros lipídios relevantes são lipooligosaccarídeos (LOSs) presentes em micobactérias tuberculosas e não intuberréuas. No caso de Mycobacterium marinum, a presença de LOSs em sua parede celular está relacionada à motilidade deslizante e à capacidade de formar biofilmes e interfere no reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões de macrófago, afetando a absorção e eliminação das bactérias por fagocitos hospedeiros7,8. Além disso, a ausência ou presença de alguns lipídios permite que membros da mesma espécie sejam classificados em diferentes morótipos com perfis virulentos ou atenuados ao interagir com células hospedeiras. Por exemplo, a ausência de glycopeptidolipids (GPL) no morfótipo áspero de Mycobacterium abscessus tem sido associado com a capacidade de induzir acidificação intrafarosômica e, consequentemente, apoptose celular9, ao contrário do morótipo liso que possui GPLs em sua superfície. Além disso, o conteúdo lipídico da parede celular micobacteriana está relacionado com a capacidade de modificar a resposta imune no hospedeiro. Isso é relevante no contexto do uso de algumas micobactérias para desencadear um perfil imunológico protetor contra diferentes patologias10,11,12,13. Foi demonstrado, por exemplo, que Mycolicibacterium vaccae, um micobacterium saprofítico, que atualmente está em ensaios clínicos de fase III como vacina imunoterapêutica para tuberculose, apresentam dois morfotipos coloniais. Enquanto o fenótipo liso, que contém um poliéster em sua superfície, desencadeia uma resposta Th2, o fenótipo áspero desprovido do poliéster pode induzir um perfil Th1 quando interage com células imunes hospedeiras14. O repertório de lipídios presentes na célula micobacteriana não depende apenas das espécies de micobactérias, mas também das condições das culturas micobacterianas: tempo de incubação15,16 ou composição do meio de cultura17,18. De fato, mudanças na composição média da cultura afetam a atividade antitumoral e imunoestimulatória de M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Além disso, o perfil imunológico protetor desencadeado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis desafio em modelos de camundongos também depende da mídia cultural em que M. bovis BCG cresce17. Estes poderiam então estar relacionados com a composição lipídica das micobactérias em cada condição cultural. Por todas essas razões, o estudo do conteúdo lipídico das micobactérias é relevante. Um procedimento visual para extrair e analisar a composição lipídica da parede celular micobacteriana é apresentado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

As espécies de micobactérias podem diferir umas das outras na taxa de crescimento, presença de pigmentação, morfologia da colônia exibida em mídia sólida, bem como outras características fenotípicas. No entanto, todos eles têm em comum o caráter mais relevante das micobactérias: sua parede celular única e altamente hidrofóbica. As espécies de micobactérias contêm um complexo ligado à membrana-covalente que inclui arabinogalactan, peptidoglycan e longas cadeias de ácidos micólicos com tipos que diferem entre espécies de micobactérias. Além disso, as micobactérias também podem produzir lipídios localizados, não covalentemente ligados, em suas superfícies celulares, como dimicocerosates de fleiocerol (PDIM), glicólipídios fenólicos (PGL), glicopeptidolipids (GPL), acitretros (AT) ou mannoídeos fosfatidil-inositol (PIM), entre outros. Alguns deles são considerados fatores de virulência em micobactérias patogênicas, ou lipídios antigênicos críticos na interação hospedeira-micobactéria. Por essas razões, há um interesse significativo no estudo dos lipídios micobacterianos devido à sua aplicação em diversas áreas, desde a compreensão de seu papel na patogenicidade das infecções por micobactérias, até uma possível implicação como agentes imunomodulatórios para o tratamento de doenças infecciosas e outras patologias como o câncer. Aqui, é apresentada uma abordagem simples para extrair e analisar o teor total lipídico e a composição de ácido mcólico das células de micobactéria cultivadas em meio sólido usando misturas de solventes orgânicos. Uma vez que os extratos lipíduos são obtidos, a cromatografia de camada fina (TLC) é realizada para monitorar os compostos extraídos. O experimento de exemplo é realizado com quatro micobactérias diferentes: o mycolicibacterium brumae e Mycolicibacterium fortuitum, o atenuado Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), e o patógeno oportunista de rápido crescimento Mycobacterium abscessus, demonstrando que métodos mostrados no presente protocolo podem ser usados para uma ampla gama de mycobacteria.

Com o objetivo de mostrar uma ampla gama de lipídios presentes em diferentes espécies de micobactérias, M. bovis BCG foi selecionado por ser micobactérias ásperas e de crescimento lento. O áspero e rápido crescimento M. fortuitum e M. brumae foram adicionados no procedimento e, finalmente, o morfotipo liso de M. abscesso também foi incluído. Essas quatro espécies nos permitem visualizar um amplo espectro de lipídios derivados de micobactérias, como acitrehaloses (AT), GPLs,...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Um protocolo é apresentado para extrair o conteúdo lipídico total da parede celular de uma ampla gama de micobactérias. Além disso, são mostrados protocolos de extração e analíticas dos diferentes tipos de ácidos micólicos. Um protocolo cromatográfico de camada fina para monitorar esses compostos micobacterianos também é fornecido.

Análise da Composição Lipídica de Mycobacteria por Cromatografia de Camada Fina

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mycobacteria Lipids são uma característica importante do gênero e são críticos nas interações mycobacteria hospedada. Velocidade e versatilidade são as principais vantagens deste procedimento. Este método pode ser usado para entender o papel dos lipídios e a patogenicidade das micobactérias e seu efeito imunoestimulatório.Para a extração de lipídios não covalentes ligados, adicione 15 mililitros de um a dois clorofórmio à solução de metanol a um tubo de vidro com uma tampa de parafuso de forro PTFE sob um capô de fluxo laminar. Em seguida, arranhe 200 miligramas de micobactérias de um meio sólido, e adicione as micobactérias ao tubo de vidro. Incubar o tubo durante a noite com agitação constante.No dia seguinte, filtre os solventes orgânicos através de um funil de vidro forrado com papel filtro em um tubo de vidro. Depois de usar o fluxo de gás nitrogênio, para evaporar a fase líquida no tubo, encha o tubo com gás nitrogênio, para armazenar o tubo a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione 15 mililitros de um clorofórmio de dois a um à solução de metanol aos detritos celulares e incubar o tubo durante a noite com agitação constante.Na manhã seguinte, deixe a mistura descansar por uma hora, antes de usar uma pipeta Pasteur para transferir os solventes orgânicos para um funil de vidro forrado de papel filtro para o mesmo tubo de coleta de vidro. Em seguida, evaporar a fase líquida como demonstrado, antes de reabastecer o tubo com gás nitrogênio por quatro graus Celsius de armazenamento. Para extração de ácido mecólico, adicione dois a cinco mililitros de uma solução de agitação e 200 miligramas de biomassa de micobactéria a um tubo de vidro hermético com uma tampa de parafuso de liner PTFE, e misture o conteúdo por vórtice.Incubar a mistura dentro de um banho seco a 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, quando o tubo tiver resfriado a temperatura ambiente, adicione dois mililitros de hexano N, e misture o conteúdo por 30 segundos por vórtice. Deixe o tubo se instalar até que duas fases claras apareçam e transfira a fase superior de hexano N para um novo tubo.Misture dois mililitros adicionais de hexano N com o conteúdo do tubo e colete novamente a camada superior. Em seguida, evaporar o conteúdo do tubo por fluxo de nitrogênio e armazenar a amostra coberta de nitrogênio a quatro graus Celsius, como demonstrado. Para analisar as amostras por TLC cubra uma parede da câmara TLC com um pedaço de papel filtro, adicione vaselina nos cantos da câmara para selar a câmara, para que a mistura de solvente sobre o papel filtro e adicione o volume restante do solvente ao fundo da câmara TLC.Feche a câmara TLC por pelo menos 20 minutos para saturar. Enquanto isso, dissolva os lipídios no tubo de vidro em 200 a 1000 microliters de clorofórmio e use um tubo de vidro capilar para aplicar 10 microlitadores da suspensão do clorofórmio lipídemo diretamente na placa TLC. Depois de permitir que a amostra seque por cinco minutos, insira a placa na câmara TLC saturada e permita que a fase móvel passe pelo TLC.Quando o solvente atingir um centímetro da extremidade superior da placa, coloque a placa sob fluxo laminar até que a sílica esteja completamente seca. Em seguida, borrife a placa seca com 15 a 20 mililitros de 10% molar dados ácido fosfórico hidratar no etanol até que a placa esteja amarela brilhante, e aqueça a placa por dois a cinco minutos a 120 graus Celsius. Nesta análise representativa, o ácido micocólico extraído de várias espécies de micobactérias, foram analisados através de TLC unidimensional utilizando dois sistemas de elução diferentes e TLC bidimensional.Também foram realizados dois tipos de procedimentos de metilação para confirmar a presença de ácido micoclic tipo cinco. Em ambos os sistemas de elução, os ácidos mecólicos foram localizados aproximadamente no meio da placa, embora, a mancha correspondente ao ácido micocólico tipo cinco, só tenha sido observada após a saponificação. TLC bidimensional também permite a identificação de tipos individuais de ácidos míclicos.Por exemplo, mycobacterium brumae expressa apenas ácidos myclic tipo um, mycobacterium bovis BCG expressa tipo um e quatro, mycobacterium fortuitum expressa tipo um e cinco, e mycobacterium abcessus expressa perfis de ácidos mcólicos tipo um e dois. Os extratos lipídes totais de várias espécies de micobactérias foram analisados em função de sua polaridade e tamanho. Ele revela que a maioria dos lipídios polares, como os PDIMs, estão presentes na mycobacterium bovis BCG, mas não no mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae e no morfotipo liso de M abcessus.GlycoLipids fenólicos estão presentes apenas na mycobacterium bovis BCG, enquanto os GlycoPeptidoLipids são observados apenas em amostras de mycobacterium abcessus. Semelhante aos ácidos micólicos, Acilglicerols e PDIMs, PIMs, também podem ser facilmente visualizados através de uma análise TLC unidimensional ou TLC 2D. Dois tipos de manchas foram utilizadas para revelar PIMs em TLC unidimensional.A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este protocolo é não usar nenhum instrumento plástico durante todo o procedimento.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Imunologia e Infecção

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Análise de conteúdo de gotas lipídicas em leveduras de fissão e brotamento usando processamento automatizado de imagens

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...