Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
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Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-098777-B-I00), los Fondos FEDER y la Generalitat de Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido es beneficiaria de un contrato de doctorado (FI) de la Generalitat de Catalunya.

1. Extracción del total de lípidos no ligados a covalentes de micobacterias (Figura 1)
<ol><li>Rasque 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y agréguelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir una solución compuesta por 5 ml de cloroformo y 10 ml de metanol (cloroformo:metanol, 1:2). NOTA: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, solo se debe usar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

Se presenta un protocolo simple considerado como el método estándar de oro para la extracción de compuestos lipídicos no unidos covalentemente de la pared celular micobacteriana. Se muestra una visualización adicional por TMIC unidimensionales y bidimensionales de los lípidos extraídos de cuatro micobacterias diferentes.
Dos mezclas combinadas consecutivas de cloroformo y metanol para recuperar el contenido lipídico de las células micobacterianas es la mezcla de disolventes más utili...

Mycobacterium es un género que comprende especies patógenas y no patógenas, caracterizadas por tener una pared celular altamente hidrofóbica e impermeable formada por sus peculiares lípidos. Específicamente, la pared celular micobacteriana contiene ácidos micólicos, que son ácidos grasos α-alquilo y β-hidroxi, en los que la rama α es constante en todos los ácidos micólicos (excepto en la longitud) y la cadena β, llamada cadena de meromycolate, es una cadena alifática larga que puede contener diferentes grupos químicos funcionales descritos junto con la literatura (α-, α'-, metoxi-, metoxi-, κ-, epoxi-, carboxi-, y ω-1-metoxi-micolatos), produciendo así siete tipos de ácidos micólicos (I-VII)1. Además, otros lípidos con una importancia incuestionable también están presentes en la pared celular de las especies de micobacterias. Especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis2 producen factores de virulencia específicos basados en lípidos como dilipocerol dimycocerosatos (PDIMs), glicolípidos fenólicos (PGL), di-, tri-, y penta-aciltrehalosas (DAT, TAT y PAT), o sulfolípidos, entre otros.3. Su presencia en la superficie micobacteriana se ha asociado con la capacidad de modificar la respuesta inmune del huésped y por tanto, la evolución y persistencia de la micobacteria dentro del huésped.4. Por ejemplo, la presencia de triacilgliceroles (TAG) se ha asociado con el fenotipo hipervirulento del linaje 2-Beijing sublinaje de M. tuberculosis, posiblemente debido a su capacidad para atenuar la respuesta inmune del huésped5,6. Otros lípidos relevantes son los lipooligosacáridos (LOS) presentes en micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. En el caso de Mycobacterium marinum, la presencia de LOSs en su pared celular está relacionada con la motilidad deslizante y la capacidad de formar biopelículas e interfiere con el reconocimiento por parte de los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos, afectando la absorción y eliminación de las bacterias por los fagocitos del huésped.7,8. Además, la ausencia o presencia de algunos lípidos permite clasificar a los miembros de una misma especie en diferentes morfotipos con perfiles virulentos o atenuantes al interactuar con las células huésped. Por ejemplo, la ausencia de glicopeptidolípidos (GPL) en el morfotipo rugoso de Mycobacterium abscessus se ha asociado con la capacidad de inducir acidificación intrafagosómica y, en consecuencia, apoptosis celular9, a diferencia del morfotipo liso que posee G L GPL en su superficie. Además, el contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana está relacionado con la capacidad de modificar la respuesta inmune en el huésped. Esto es relevante en el contexto del uso de algunas micobacterias para desencadenar un perfil inmune protector contra diferentes patologías.10,11,12,13. Se ha demostrado, por ejemplo, que Mycolicibacterium vaccae, una micobacteria saprófita, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase III como vacuna inmunoterapéutica para la tuberculosis, muestra dos morfotipos coloniales. Mientras que el fenotipo liso, que contiene un poliéster en su superficie, desencadena una respuesta Th2, el fenotipo rugoso desprovisto del poliéster puede inducir un perfil Th1 cuando interactúa con las células inmunes del huésped.14. El repertorio de lípidos presentes en la célula micobacteriana no solo depende de las especies de micobacterias, sino también de las condiciones de los cultivos de micobacterias: tiempo de incubación.15,16 o composición del medio de cultivo17,18. De hecho, los cambios en la composición del medio de cultivo afectan a la actividad antitumoral e inmunoestimuladora de M. bovis BCG y Mycolicibacterium brumae in vitro17. Además, el perfil inmune protector desencadenado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis El desafío en modelos de ratones también depende de los medios de cultivo en los que M. bovis BCG crece17. Estos podrían estar relacionados con la composición lipídica de las micobacterias en cada condición de cultivo. Por todas estas razones, el estudio del contenido lipídico de las micobacterias es relevante. Se presenta un procedimiento visual para extraer y analizar la composición lipídica de la pared celular micobacteriana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

Las especies de micobacterias pueden diferir entre sí en la tasa de crecimiento, la presencia de pigmentación, la morfología de la colonia mostrada en los medios sólidos, así como otras características fenotípicas. Sin embargo, todas tienen en común el carácter más relevante de las micobacterias: su pared celular única y altamente hidrofóbica. Las especies de micobacterias contienen un complejo unido a la membrana covalente que incluye arabinogalactano, peptidoglicano y cadenas largas de ácidos micólicos con tipos que difieren entre las especies de micobacterias. Además, las micobacterias también pueden producir lípidos que se localizan, no unidos covalentemente, en sus superficies celulares, como los dicicocerosatos de fteocerol (PDIM), los glicolípidos fenólicos (PGL), los glicopptidolípidos (GPL), las aciltrehalosas (AT) o los narizidos de fosfatidil-inositol (PIM), entre otros. Algunos de ellos se consideran factores de virulencia en micobacterias patógenas, o lípidos antigénicos críticos en la interacción huésped-micobacterias. Por estas razones, existe un interés significativo en el estudio de los lípidos micobacterianos debido a su aplicación en varios campos, desde la comprensión de su papel en la patogenicidad de las infecciones por micobacterias, hasta una posible implicación como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades infecciosas y otras patologías como el cáncer. Aquí, se presenta un enfoque simple para extraer y analizar el contenido total de lípidos y la composición de ácido micólico de las células de micobacterias cultivadas en un medio sólido utilizando mezclas de solventes orgánicos. Una vez obtenidos los extractos lipídicos, se realiza cromatografía de capa fina (TLC) para monitorizar los compuestos extraídos. El experimento de ejemplo se realiza con cuatro micobacterias diferentes: mycolicibacterium brumae y Mycolicibacterium fortuitum de rápido crecimiento ambiental, el bacilo atenuado de crecimiento lento Mycobacterium bovis Calmette-Guérin (BCG) y el patógeno oportunista de rápido crecimiento Mycobacterium abscessus, lo que demuestra que los métodos mostrados en el presente protocolo se pueden utilizar para una amplia gama de micobacterias.

Con el objetivo de mostrar una amplia gama de lípidos presentes en diferentes especies de micobacterias, se seleccionó M. bovis BCG por tratarse de micobacterias rugosas y de crecimiento lento. En el procedimiento se añadieron M. fortuitum y M. brumae rugosas y de rápido crecimiento y, finalmente, también se incluyó el morfotipo liso de M. abscessus. Estas cuatro especies nos permiten visualizar un amplio espectro de lípidos derivados de micobacterias como aciltrehalosas (AT), ...

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Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Micobacterias Los lípidos son una característica importante del género y son críticos en las interacciones de las micobacterias huéspedes. Rapidez y versatilidad son las principales ventajas de este procedimiento. Este método se puede utilizar para comprender el papel de los lípidos y la patogenicidad de las micobacterias y su efecto inmunoestimulante.Para la extracción de lípidos ligados no covalentes, agregue 15 mililitros de una a dos soluciones de cloroformo a metanol a un tubo de vidrio con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE debajo de una campana de flujo laminar. Luego, rasque 200 miligramos de micobacterias de un medio sólido y agregue las micobacterias al tubo de vidrio. Incubar el tubo durante la noche con agitación constante.Al día siguiente, filtre los disolventes orgánicos a través de un embudo de vidrio forrado con papel de filtro en un tubo de vidrio. Después de usar el flujo de gas nitrógeno, para evaporar la fase líquida en el tubo, llene el tubo con gas nitrógeno, para almacenar el tubo a cuatro grados centígrados. Luego, agregue 15 mililitros de una solución de cloroformo de dos a uno a metanol a los desechos celulares e incube el tubo durante la noche con agitación constante.A la mañana siguiente, deje reposar la mezcla durante una hora, antes de usar una pipeta Pasteur para transferir los disolventes orgánicos a un embudo de vidrio forrado de papel de filtro en el mismo tubo de recolección de vidrio. Luego, evapore la fase líquida como se ha demostrado, antes de rellenar el tubo con gas nitrógeno durante cuatro grados centígrados de almacenamiento. Para la extracción de ácido micólico, agregue de dos a cinco mililitros de una solución agitadora y 200 miligramos de biomasa de micobacterias a un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE, y mezcle el contenido mediante vórtice.Incubar la mezcla dentro de un baño seco a 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuando el tubo se haya enfriado a temperatura ambiente, agregue dos mililitros de N hexano y mezcle el contenido durante 30 segundos mediante vórtice. Deje que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras y transfiera la fase superior de hexano N a un nuevo tubo.Mezcle dos mililitros adicionales de N hexano con el contenido del tubo y recoja la capa superior nuevamente. Luego, evapore el contenido del tubo por el flujo de nitrógeno y almacene la muestra cubierta de nitrógeno a cuatro grados centígrados como se ha demostrado. Para analizar las muestras de TLC, cubra una pared de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro, agregue vaselina en las esquinas de la cámara para sellar la cámara, para entablar la mezcla de solvente sobre el papel de filtro y agregar el volumen restante del solvente a la parte inferior de la cámara TLC.Cierre la cámara TLC durante al menos 20 minutos para que se sature. Mientras tanto, disuelva los lípidos en el tubo de vidrio en 200 a 1000 microlitros de cloroformo y use un tubo de vidrio capilar para aplicar 10 microlitros de la suspensión de cloroformo lipídico directamente sobre la placa TLC. Después de dejar que la muestra se seque durante cinco minutos, inserte la placa en la cámara TLC saturada y permita que la fase móvil pase a través del TLC.Cuando el disolvente alcance un centímetro del extremo superior de la placa, coloque la placa debajo del flujo laminar hasta que la sílice esté completamente seca. Luego, rocíe la placa seca con 15 a 20 mililitros de hidrato de ácido fosfórico de datos molares al 10% en etanol hasta que la placa esté de color amarillo brillante, y caliente la placa durante dos a cinco minutos a 120 grados centígrados. En este análisis representativo, el ácido micólico extraído de diversas especies de micobacterias, se analizó a través de TLC unidimensional utilizando dos sistemas de elución diferentes y TLC bidimensional.También se realizaron dos tipos de procedimientos de metilación para confirmar la presencia de ácido micólico tipo cinco. En ambos sistemas de elución, los ácidos micólicos se localizaron aproximadamente en el centro de la placa, aunque, la mancha correspondiente al ácido micólico tipo cinco, se observó solo después de la saponificación. El TLC bidimensional también permite la identificación de tipos individuales de ácido micólico.Por ejemplo, mycobacterium brumae expresa solo ácidos micólicos tipo uno, mycobacterium bovis BCG expresa tipos uno y cuatro, mycobacterium fortuitum expresa tipos uno y cinco, y mycobacterium abcessus expresa perfiles de ácido micólico tipo uno y dos. Los extractos lipídicos totales de varias especies de micobacterias se analizaron en función de su polaridad y tamaño. Revela que la mayoría de los lípidos polares A, como los PDIM, están presentes en mycobacterium bovis BCG, pero no en mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae y el morfotipo liso de M abcessus.Los glicolípidos fenólicos están presentes solo en mycobacterium bovis BCG, mientras que los lipídidos de GlycoPeptido se observan solo en muestras de mycobacterium abcessus. Al igual que los ácidos micólicos, los acilgliceroles y PDIMs, PIMs, también se pueden visualizar fácilmente a través del análisis unidimensional TLC o 2D TLC. Se utilizaron dos tipos de manchas para revelar PIMs en TLC unidimensional.Lo más importante que debe recordar al intentar este protocolo es no usar ningún instrumento de plástico durante todo el procedimiento.

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Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Análisis del daño epitelial Producido por<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infección

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Análisis rápido de aberraciones cromosómicas en linfocitos B de ratón por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...