Name: analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Bu araştırma İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı (RTI2018-098777-B-I00), FEDER Fonları ve Catalunya Generalitat (2017SGR-229) tarafından finanse edildi. Sandra Guallar-Garrido, Generalitat de Catalunya'dan bir doktora sözleşmesinin (FI) sahibidir.

1. Toplam kovalent bağlantılı olmayan lipitlerin mikobakterilerden çıkarılması (Şekil 1)
<ol><li>Katı bir ortamdan 0,2 g mikobakteri çizin ve politetrafloroetilen (PTFE) astar vidalı kapaklı bir cam tüpe ekleyin. 5 mL kloroform ve 10 mL metanolden oluşan bir çözelti ekleyin (kloroform:metanol, 1:2). NOT: Organik çözücüler kullanıldığında sadece cam alıcı kullanılmalıdır. Plastik kaplara izin verilmez. Ayrıca, şişeler için PTFE astar vidalı kapaklara iht...

<ol>
	<li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains;+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids.">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li><li>Global Health Organization World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(2018)+Global+tuberculosis+report.">(2018) Global tuberculosis report.</a> WHO. , (2019).</li><li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids.">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li><li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity.">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).</li><li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated.">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li><li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+virulence+factors:+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins.">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).</li><li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages.">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum.">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li><li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages.">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).</li><li>Guallar-Garrido, S., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+(BCG)+therapy+for+bladder+cancer:+An+update.">Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li><li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment.">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro,+ex+vivo,+and+in+vivo.">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li><li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment.">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232 (2016).</li><li>Rodr&#237;guez-G&#252;ell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production.">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li><li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection.">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth.">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li><li>Guallar-Garrido, S., Campo-P&#233;rez, V., S&#225;nchez-Chardi, A., Luquin, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect.">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).</li><li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG.">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li><li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., P&#233;rez-Trujillo, M., Juli&#225;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography.">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li><li>Minnikin, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mycobacteria+mycolic+acids.">Analysis of mycobacteria mycolic acids.</a> Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).</li><li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria.">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li><li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria.">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li><li>Mu&#241;oz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li><li>Daff&#233;, M., Lacave, C., Lan&#233;elle, M. A., Gillois, M., Lan&#233;elle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphthienoyl+trehalose,+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus.">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li><li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids.">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li><li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier.">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li><li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354.">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li><li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria.">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases &amp; Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li><li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management.">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , (2020).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li><li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain.">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li><li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li><li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria.">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li><li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms.">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li><li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells.">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li><li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+polyphleates,+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus,+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology,+which+have+been+associated+with+virulence.">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li><li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species.">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS.">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).</li><li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+"Mtb+LipidDB".">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li><li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics.">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li><li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+(TLC-FID)+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species.">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).</li></ol>

Mikobakteri hücre duvarından yaygın olarak bağlı olmayan lipit bileşiklerinin çıkarılması için altın standart yöntem olarak kabul edilen basit bir protokol sunulmuştur. Dört farklı mikobakterinin çıkarılan lipitlerinden bir ve iki boyutlu TLC'ler tarafından daha fazla görselleştirme gösterilmiştir.
Mikobakteri hücrelerinin lipidik içeriğini kurtarmak için art arda iki kombine kloroform ve metanol karışımı en yaygın kullanılan çözücü karışımıdır<sup cl...

Mycobacterium patojenik ve patojenik olmayan türlerden oluşan bir cinstir, kendine özgü lipitleri tarafından oluşturulan son derece hidrofobik ve geçirimsiz bir hücre duvarına sahip olması ile karakterizedir. Özellikle, mikobakteri hücre duvarı mikolik asitler içerir, tüm mikolik asitlerde (uzunluk hariç) α dalının sabit olduğu α-alkil ve β-hidroksi yağ asitleri olan ve meromycolate zinciri olarak adlandırılan β zinciri, literatürle birlikte tanımlanan farklı fonksiyonel kimyasal grupları içerebilen uzun bir alifatik zincirdir (α, α', metoksi-, φ-, epoksi-, karboksi-ve ω-1-metoksi- mikolatlar), bu nedenle yedi tür mikolik asit üretir (I-VII)1. Ayrıca, mikobakteri türlerinin hücre duvarında tartışmasız öneme sahip diğer lipitler de mevcuttur. Patojenik türler gibi Mycobacterium tuberculosis, tüberkülozun etken maddesi2 phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipid (PGL), di,tri-ve penta-acyltrehaloses (DAT, TAT ve PAT) veya sulfolipids gibi spesifik lipid bazlı virülans faktörleri üretir3. Mikobakteri yüzeyindeki varlıkları, konak immün yanıtı değiştirme yeteneği ve bu nedenle konakçı içindeki mikobakterinin evrimi ve kalıcılığı ile ilişkilendirilmiştir.4. Örneğin, triacylglycerols (TAG) varlığı Lineage 2-Pekin alt soy hipervirulent fenotip ile ilişkilendirilmiştir M. tuberculosis, muhtemelen konak bağışıklık tepkisini zayıflatıcı kapasitesi nedeniyle5,6. Diğer ilgili lipitler tüberküloz ve nontuberculous mikobakterilerde bulunan lipooligosaccharides (LOSs) 'dir. Durumunda Mycobacterium marinum, HÜCRE DUVARINDA LOSS'un varlığı sürgü hareketliliği ve biyofilm oluşturma yeteneği ile ilgilidir ve makrofaj örüntü tanıma reseptörleri tarafından tanınmasına müdahale eder, konak fagositler tarafından bakterilerin alımını ve yok olmasını etkiler7,8. Ek olarak, bazı lipitlerin yokluğu veya varlığı, aynı türün üyelerinin konak hücrelerle etkileşime girerken virülan veya zayıf profillere sahip farklı morfotipler halinde sınıflandırılmasına izin verir. Örneğin, kaba morfotipinde glikopeptidolipidlerin (GPL) bulunmaması Mycobacterium abscessus intrafagozomal asitleşmeye ve dolayısıyla hücre apoptozuna neden olma yeteneği ile ilişkilendirilmiştir.9, yüzeylerinde GPL'lere sahip pürüzsüz morfotipin aksine. Ayrıca, mikobakteri hücre duvarının lipit içeriği konakçıda immün yanıtı değiştirme yeteneği ile ilgilidir. Bu, farklı patolojilere karşı koruyucu bir bağışıklık profilini tetiklemek için bazı mikobakterilerin kullanılması bağlamında geçerlidir.10,11,12,13. Örneğin, Mycolicibacterium vaccae, şu anda tüberküloz için immünoterapik bir aşı olarak faz III klinik çalışmalarda bulunan bir saprofitik mikobakteri, iki kolonyal morfotip gösterir. Yüzeyinde bir polyester içeren pürüzsüz fenotip bir Th2 yanıtını tetiklerken, polyesterden yoksun kaba fenotip, konak bağışıklık hücreleriyle etkileşime girdiğinde bir Th1 profiline neden olabilir.14. Mikobakteri hücresinde bulunan lipitlerin repertuarı sadece mikobakteri türlerine değil, aynı zamanda mikobakteri kültürlerinin koşullarına da bağlıdır: kuluçka zamanı15,16 veya kültür ortamının bileşimi17,18. Aslında, kültür orta bileşimindeki değişiklikler antitümör ve immünostimülatör aktivitesini etkiler. M. bovis BCG ve Mycolicibacterium brumae in vitro17. Ayrıca, tarafından tetiklenen koruyucu bağışıklık profili M. bovis BCG karşı M. tuberculosis fare modellerinde meydan okuma, aynı zamanda M. bovis BCG büyüyor17. Bunlar daha sonra her kültür durumunda mikobakterilerin lipid bileşimi ile ilgili olabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı, mikobakterilerin lipit içeriğinin incelenmesi önemlidir. Mikobakteri hücre duvarının lipit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için görsel bir prosedür sunulmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE&#174; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>400971N</td>
			<td>CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8014610010</td>
			<td>Anthrone for synthesis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>426113</td>
			<td>CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary glass tube</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR708709</td>
			<td>BRAND&#174;&#160;disposable BLAUBRAND&#174;&#160;micropipettes, intraMark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412653</td>
			<td>CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry block heater</td>
			<td>J.P. Selecta</td>
			<td>7471200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicloromethane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412622</td>
			<td>CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412672</td>
			<td>CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>1313181211</td>
			<td>CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol Absolute</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>4146072</td>
			<td>CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>DURA.2133148 1217/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tube</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>VFOC.45066A-16125</td>
			<td>Glass tube with PTFE recovered cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>412722</td>
			<td>CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdatophosphoric acid hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51429-74-4</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1942-100ML</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-hexane</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>446903</td>
			<td>CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-nitroso-n-methylurea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4766</td>
			<td>CAUTION</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>DDBiolab</td>
			<td>995018</td>
			<td>NB-205L benchtop shaking incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum ether (60-80&#186;C)</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>427003</td>
			<td>CAUTION. Petroleum ether 60 - 80&#176;C RPE - For analysis 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprayer</td>
			<td>VidraFOC</td>
			<td>712/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulphate anhydrous</td>
			<td>Merck</td>
			<td>238597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 95-97%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1007311000</td>
			<td>CAUTION. Sulfuric acid 95-97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z204226-1EA</td>
			<td>Rectangular TLC developing tanks, complete L &#215; H &#215; W 22 cm &#215; 22 cm &#215; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1057210001</td>
			<td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Plate Heater</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>223306</td>
			<td>CAMAG TLC Plat Heater III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>488551</td>
			<td>CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10132562</td>
			<td>IKA&#160;Agitador IKA v&#243;rtex 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>102269427</td>
			<td>CAUTION.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the lipid composition of mycobacteria by thin layer chromatography

Mikobakteri türleri büyüme hızında, pigmentasyon varlığında, katı medyada görüntülenen koloni morfolojisinde ve diğer fenotipik özelliklerde birbirinden farklı olabilir. Bununla birlikte, hepsi mikobakterilerin en alakalı karakterine sahiptir: benzersiz ve son derece hidrofobik hücre duvarı. Mikobakteri türleri, mikobakteri türleri arasında farklılık gösteren türlere sahip arabinogalactan, peptidoglikan ve uzun mikolik asit zincirlerini içeren membran-kovalent bağlantılı bir kompleks içerir. Ek olarak, mikobakteriler ayrıca bulunan lipitleri de üretebilir, phthiocerol dimycocerosates (PDIM), fenolik glikolipidler (PGL), glikoptidolipidler (GPL), acyltrehaloses (AT) veya fosfatidil-inositol mannosides (PIM) gibi hücre yüzeylerinde, yaygın olarak bağlı değildir. Bazıları patojenik mikobakterilerde virülans faktörleri veya konak-mikobakteri etkileşiminde kritik antijenik lipitler olarak kabul edilir. Bu nedenlerle mikobakteriyel lipitlerin mikobakteri enfeksiyonlarının patojenikliğindeki rollerini anlamalarından, bulaşıcı hastalıkların ve kanser gibi diğer patolojilerin tedavisinde immünomodülatör ajanlar olarak olası bir imaya kadar çeşitli alanlarda uygulanması nedeniyle incelenmesine önemli bir ilgi vardır. Burada, organik çözücülerin karışımları kullanılarak katı bir ortamda yetiştirilen mikobakteri hücrelerinin toplam lipit içeriğini ve mikolik asit bileşimini çıkarmak ve analiz etmek için basit bir yaklaşım sunulmaktadır. Lipit özleri elde edildikten sonra, çıkarılan bileşikleri izlemek için ince tabaka kromatografisi (TLC) yapılır. Örnek deney dört farklı mikobakteri ile gerçekleştirilir: çevresel hızlı büyüyen Mycolicibacterium brumae ve Mycolicibacterium fortuitum, zayıflamış yavaş büyüyen Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) ve fırsatçı patojen hızlı büyüyen Mycobacterium apsesi, mevcut protokolde gösterilen yöntemlerin çok çeşitli mikobakteriler için kullanılabileceğini göstermiştir.

Farklı mikobakteri türlerinde bulunan çok çeşitli lipitleri göstermek amacıyla, Pürüzlü ve yavaş büyüyen mikobakteriler olduğu için M. bovis BCG seçildi. Prosedüre kaba ve hızlı büyüyen M. fortuitum ve M. brumae eklendi ve son olarak M. apsesinin pürüzsüz morfotipine de yer verildi. Bu dört tür, akiltrehalozlar (AT), GPL'ler, PDIM, PGL, PIM, TDM ve TMM gibi mikobakterilerden türetilmiş geniş bir lipit spektrumunu görselleştirmemize izin verir. Ayrıca, d?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography at JoVE.com

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Çok çeşitli mikobakterilerin hücre duvarının toplam lipit içeriğini çıkarmak için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, farklı mikolik asit türlerinin ekstraksiyon ve analitik protokolleri gösterilmiştir. Bu mikobakteriyel bileşikleri izlemek için ince katmanlı bir kromatografik protokol de sağlanmaktadır.

İnce Tabaka Kromatografisi ile Mikobakterilerin Lipid Bileşiminin Analizi

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Mikobakteri Lipitleri cinsin önemli bir özelliğidir ve konak Mycobacteria etkileşimlerinde kritik öneme sahiptir. Hız ve çok yönlülük bu prosedürün başlıca avantajlarıdır. Bu yöntem lipitlerin rolünü ve mikobakterilerin patojenikliğini ve immünostimülatör etkilerini anlamak için kullanılabilir.Kovalent olmayan bağlı lipitlerin çıkarılması için, laminer akış başlığı altında PTFE astar vidalı kapaklı bir cam tüpe metanol çözeltisine bir ila iki kloroformdan 15 mililitre ekleyin. Ardından, katı bir ortamdan 200 miligram mikobakteri çizin ve mikobakterileri cam tüpe ekleyin. Tüpü sürekli karıştırarak bir gecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, organik çözücüleri filtre kağıdı ile kaplı bir cam huniden cam bir tüpe filtreleyin. Azot gazı akısını kullandıktan sonra, tüpteki sıvı fazı buharlaştırmak için, tüpü dört santigrat derecede saklamak için tüpü azot gazı ile doldurun. Daha sonra, hücresel döküntüye metanol çözeltisine iki ila bir kloroformdan 15 mililitre ekleyin ve tüpü sürekli karıştırarak bir gecede kuluçkaya bırakın.Ertesi sabah, organik çözücüleri aynı cam toplama tüpüne bir filtre kağıdı astarlı cam hunisine aktarmak için pasteur pipet kullanmadan önce karışımın bir saat dinlenmesine izin verin. Daha sonra, tüpü dört santigrat derece depolama için azot gazı ile doldurmadan önce, gösterildiği gibi sıvı fazı buharlaştırın. Mikolik asit ekstraksiyonu için, PTFE astar vidalı kapaklı bir hermetik cam tüpe iki ila beş mililitre tirifying çözeltisi ve 200 miligram mikobakteri biyokütlesi ekleyin ve içeriği girdapla karıştırmak için.Karışımı bir gecede 80 santigrat derecede kuru bir banyonun içinde kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, tüp oda sıcaklığını soğutduğunda, iki mililitre N heksan ekleyin ve içeriği girdaplayarak 30 saniye karıştırın. tüpün iki net faz görünene kadar oturmasına izin verin ve üst N heksam fazını yeni bir tüpe aktarın.Tüp içeriğiyle iki mililitre daha N heksan karıştırın ve üst tabakayı tekrar toplayın. Daha sonra, azot akışı ile tüp içeriğini buharlaştırın ve azotla kaplı numuneyi gösterildiği gibi dört santigrat derecede saklayın. TlC ile numuneleri analiz etmek için, TLC odasının bir duvarını bir filtre kağıdı ile kaplayın, hazneyi kapatmak için oda köşelerine Vazelin ekleyin, çözücü karışımını filtre kağıdının üzerine getirin ve çözücünün kalan hacmini TLC odasının altına ekleyin.Doygunluğa sahip olmak için TLC haznesini en az 20 dakika kapatın. Bu arada, cam tüpteki lipitleri 200 ila 1000 mikrolitre kloroformda çözün ve lipid kloroform süspansiyonun 10 mikrolitresini doğrudan TLC plakasına uygulamak için kılcal cam bir tüp kullanın. Numunenin beş dakika kurumasına izin verdikten sonra, plakayı doymuş TLC haznesine yerleştirin ve mobil fazın TLC'den geçmesine izin verin.Çözücü plakanın üst ucundan bir santimetreye ulaştığında, plakayı silika tamamen kuruyana kadar laminar akı altına yerleştirin. Daha sonra, kurutulmuş plakayı 15 ila 20 mililitre% 10 molar veri fosforik asit hidrat ile plaka parlak sarı olana kadar etanolde püskürtün ve plakayı 120 santigrat derecede iki ila beş dakika ısıtın. Bu temsili analizde, çeşitli mikobakteri türlerinden çıkarılan mikolik asit, iki farklı elüasyon sistemi ve iki boyutlu TLC kullanılarak tek boyutlu TLC ile analiz edilmiştir.Tip beş mikolik asit varlığını doğrulamak için iki tip metilasyon işlemi de yapıldı. Her iki elüsyon sisteminde de mikolik asitler plakanın yaklaşık ortasında yer almasına rağmen, tip beş mikolik aside karşılık gelen nokta sadece saponifikasyondan sonra gözlenmiştir. İki boyutlu TLC ayrıca bireysel mikolik asit türlerinin tanımlanmasını sağlar.Örneğin, mikobakterileryum brumae sadece tip bir mikolik asitleri, mikobakteri bovis BCG tip bir ve dörtü, mycobacterium fortuitum tip bir ve beşi ve mikobakteriyum abcessus tip bir ve iki mikolik asit profillerini ifade eder. Çeşitli mikobakteri türlerinden elde edilen toplam lipid özleri polariteleri ve büyüklükleri açısından analiz edildi. PDIM'ler gibi çoğu A polar lipitinin mikobakteri bovis BCG'de bulunduğunu, ancak mikobakteriyum fortuitum, mikobakteri brumae ve M abcessus'un pürüzsüz morfotipinde bulunmadığını ortaya koymaktadır.Fenolik GlikoLipidler sadece mikobakteri bovis BCG'de bulunurken, GlycoPeptidoLipids sadece mikobakteri abcessus örneklerinde görülür. Mikolik asitlere benzer şekilde, Acylglycerols ve PDIM'ler, PIM'ler, tek boyutlu TLC veya 2D TLC analizi ile de kolayca görselleştirilebilir. PiM'leri tek boyutlu TLC'de ortaya çıkarmak için iki tür leke kullanıldı.Bu protokolü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, prosedür boyunca herhangi bir plastik alet kullanmamaktır.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...