Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

نشكر مؤسسة شامباليمود، كونجنتو (LISBOA-01-0145-FEDER-022170، بتمويل مشترك من FCT/Lisboa2020) للتمويل. زمالات FCT لنائب الرئيس (SFRH/BD/118252/2016)، MML (PD/BD/138203/2018). جميع أعضاء مختبر فيور لإجراء مناقشات حاسمة؛ ب. كوستا وسي ريبيلو دي ألميدا لتبادل البيانات؛ وأعضاء مختبرنا C. ريبيلو دي ألميدا، م. باروسو و ل. لييت لمشاركتهم في الفيديو. نود أن نشكر مرفق CF Fish Facility (C. Certal و J. Monteiro وآخرون) وفريق شامباليمود للاتصالات والأحداث والتوعية على وجه الخصوص ألكسندر أزينهيرا على صناعة الأفلام الرائعة وكاتارينا راموس وتيريزا فرنانديز على مساعدتهما.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

حمار وحشي (دانيو ريو) هو الظهور ككائن حي نموذج الفقاريات قوية لدراسة التنمية والمرض. حمار وحشي أسهم الوراثية المحفوظة للغاية (~ 70٪ علم الأوهام الوراثية و ~ 84٪ الجينات المرتبطة بالأمراض) والميزات الأساسية مورفولوجية الجهاز مع البشر1,2. هذا الحفظ يسمح باستخدام حمار وحشي لنموذج العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك السرطان3،4.
التعامل مع وصيانة حمار وحشي هو أسهل بكثير وأكثر فعالية من حيث التكلفة من الفئران نظرا لصغر حجمها، والخصوبة عالية على مدار السنة والإخصاب الخارجي3،5. لا تتطلب أجنة حمار وحشي تغذية حية خلال أول 5-7 أيام من حياتها وقد استخدمت كنموذج فعال للتنمية والعدوى والسرطان1و4و6و7. تفقس أجنة حمار وحشي في 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) وهي سباحة حرة مع تشكيل جميع الأعضاء ، والقلب النابض ونظام الدورة الدموية الوظيفية ، والكبد ، والدماغ ، ونخاع الكلى ، وما إلى ذلك1،3. أيضا ، في هذه المرحلة من التطور فقط المناعة الفطرية هي في اللعب ، والمناعة التكيفية لا تزال تتطور ، مما يسمح بالحرمان الفعال العام للخلايا البشرية دون الحاجة إلى استخدام المسوخ المنافض مناعة7،8. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن ليس كل الخلايا البشرية تغرن على قدمالمساواة 9 وأنه، على سبيل المثال، لخلايا سرطان الدم تبين أن الخلايا الفرجية (العدلات وال الضامة) تحتاج إلى أن تستنفد من أجل الحرمان الفعال10.
تسمح قابلية المسالك الوراثية لسمك الحمار الوحشي والشفافية البصرية في مراحله الجنينية المبكرة بالتصوير داخل الخلية الواحدة بدقة عالية وبالتالي ، لإنشاء أحدث تقنيات التصوير في مجالات متنوعة من البيولوجيا. وعلاوة على ذلك، في سياق السرطان، وهذه الميزات مفيدة للدراسات في الوقت الحقيقي من المراحل الأولى من التفاعلات بين الورم المضيف، مثل دراسة الأوعية والإمكانات النقيلي، فضلا عن التفاعلات مع الجهاز المناعي الفطري8،9،11،12،13.
على الرغم من أن في المقايسة xenograft قصيرة ليس هناك وقت ل "تطور" النقيلي- فمن الممكن لتحليل القدرة النقيلي للخلايا السرطانية (أي كفاءتها للذهاب من خلال خطوات النقيلي مثل الغزو, داخل, البقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية, البذخ, والاستعمار, وبالتالي دراسة هذه العمليات في الجسم الحي وفي الوقت الحقيقي8,11,13,14).
خصائص دورة حياتها وضع حمار وحشي كنموذج فريد للطب الشخصي في السرطان. يمكن إجراء المقايسات في فترة زمنية أقصر والنتائج التي تم الحصول عليها في بضعة أسابيع7،8،9،11،12،15،16. الكرفس وجدوى هذه المقايسات توفر للأطباء والباحثين إمكانية الحصول على نتائج تحويلية يمكن أن تكون مفيدة لمرضى السرطان، الذين الوقت هو حاجة أساسية.
على الرغم من المحاولات المتزايدة لتوليد xenografts جنين حمار وحشي ناجحة، لا تزال هناك حاجة لتوحيد إجراءات الحقن، فضلا عن تقييم صلاحية الخلية وسلوك الورم بعد الحقن.
في هذا البروتوكول نقدم للباحثين دليلا تفصيليا وواضحا خطوة بخطوة لحقن خطوط الخلايا السرطانية البشرية في أجنة حمار وحشي وما يليها من تثبيت ، والتلطخ المناعي ، والتصوير ، وتحديد كمي لسلوك الخلايا السرطانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

يتم استخدام يرقات حمار وحشي xenografts على نطاق واسع لأبحاث السرطان لإجراء دراسات حية وفي الوقت الحقيقي للسرطان البشري. إمكانية تصور سريع للاستجابة للعلاجات المضادة للسرطان (العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والبيولوجيات) ، وتولد الأوعية والانبثاث مع قرار خلية واحدة ، يضع نموذج xenograft حمار وحشي كخيار أعلى لتطوير الدراسات قبل السريرية.

يقدم مقايسة يرقات حمار وحشي xenograft العديد من المزايا التجريبية مقارنة بالنماذج الأخرى ، ولكن ربما يكون الأكثر لفتا للنظر هو تقليل حجم الحجم وبالتالي الوقت. يسمح هذا التخفيض في الحجم بتصوير الخلايا المفردة ، واستخدام عدد منخفض نسبيا من الخلايا البشرية (متوافقة مع الخزعات) ، وفحص الأدوية متوسطة وعالية الإنتاجية ، ولكن الأهم من ذلك أنه يمكن من تقليل كبير في وقت الفحص. كل هذه المزايا تجعل من الحمار الوحشي xenograft المقايسة جذابة للغاية لتطبيقات الطب الشخصية في المستقبل.

وقد وضعت العديد من بروتوكولات xenograft حمار وحشي مع تنوع واسع من الأورام البشرية; ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في بروتوكول عام وموحد لتوليد يرقات حمار وحشي بكفاءة. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة، مع نصائح لتوليد xenografts والمبادئ التوجيهية لتحليل سلوك الورم، وفلورية المناعة جبل كامل، وتكميم التصوير الكونفوكوكال.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة، مع نصائح لتوليد xenografts والمبادئ التوجيهية لتحليل سلوك الورم، وفلورية المناعة جبل كامل، وتكميم التصوير الكونفوكوكال.

جيل من يرقات حمار وحشي Xenografts وتحليل سلوك الورم

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

يتم استخدام زنوبرافت حمار وحشي على نطاق واسع لأبحاث السرطان. يمكنك أخذ خلايا الورم البشري وحقنه في سمك الحمار الوحشي الصغير ، أو حتى في البالغين. هنا ، ما نقدمه هو بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج اليرقات ، حيث يمكننا دراسة العديد من السمات المميزة لسرطان الإنسان في حي.يمكنك دراسة الانتشار، يمكنك دراسة تولد الأوعية، يمكنك دراسة الانبثاث، وأيضا التفاعلات داخل البيئة الدقيقة الورم. وميزة كبيرة هي أنه يمكنك دراسة هذا في إطار زمني قصير جدا. أربعة أيام فقط، على سبيل المثال.ميزة أخرى كبيرة هي أنه يمكنك دراسة هذا العيش مع قرار خلية واحدة، وذلك باستخدام مجهر ورقة ضوء أو confocal. يمكنك دراسة كيفية هجرة الخلايا، أو كيفية تفاعل الخلايا مع بعضها البعض، أو حتى كيفية التحدث مع بعضها البعض. لذا فهو نموذج قوي حقا لدراسة بيولوجيا السرطان.يمكن استخدام زنوبرافت حمار وحشي لدراسة الاستجابة للعلاجات المضادة للسرطان، مثل العلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي، أو حتى العلاجات المستهدفة بالأجسام المضادة. وأخيرا، أيضا، يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لاستخدام الخلايا المشتقة من المريض من عينة جراحية، أو حتى من الخزعات، ومن ثم توليد الصور الرمزية حمار وحشي. إعداد للحقن.قبل أسبوعين من الحقن، قم بتوسيع الخلايا في الثقافة. ابدأ بالخلايا الزائدة والأسماك الزائدة حتى تصبح بارعة في هذه التقنية ، حيث ستفقد العديد من الخلايا والأسماك أثناء التدريب. يحتوي الجدول الأول من PDF المصاحب على دليل مفصل للنسب المئوية المثلى للالتقاء في المختبر لحقن عدة خطوط خلوية.قبل ثلاثة أيام من الحقن، عبر حمار وحشي من الخلفية المطلوبة. قبل 24 ساعة من الحقن. تنظيف لوحات جنين حمار وحشي.تجاهل جميع الأجنة الميتة وغير المطورة وتحديث متوسط E3. في غرفة ثقافة الخلية، تجاهل الوسط ثقافة الخلية. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الخلايا الميتة وإضافة وسيطة جديدة.قم بإعداد أدوات إجراء الحقن، مثل إبر الحقن المجهري، وصفائح الآجروز، ودبابيس الشعر لمحاذاة الأجنة للحقن. لإعداد لوحة، صب طبقة واحدة من 2٪ agarose الذائبة في غطاء طبق بيتري نظيفة. السماح لها بلمرة وبمساعدة مسطرة، وجعل ثلاثة إلى أربعة خطوط الآجروز على التوالي لمحاذاة الأجنة.يوم الحقن فصل الأجنة المفقسة عن البويضات غير المفقسة. إضافة Pronase إلى وسيط الجنين في هذه المرحلة يمكن أن تعزز الفقس.ضع الأجنة في الحاضنة عند 28 درجة مئوية حتى الحقن. وضع العلامات على الخلايا للحقن. للمساعدة في إنشاء تقنية وضع العلامات على الخلايا القابلة للاستنساخ، تحقق من الجدولين الأول والاثنين من البروتوكول المكتوب للحصول على تجميع لقائمة خطوط الخلايا والعديد من حلول وضع العلامات.إزالة الخلايا الثقافة المتوسطة وغسل القارورة مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X. تسمية الخلايا مع صبغة ليبوفيلي، وتجنب التعرض للضوء، واحتضان قارورة في 37 درجة. يمكنك أيضا اختيار تسمية الخلايا في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق عند الانفصال.إزالة حل وضع العلامات الخلية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لإخراج الصبغة الزائدة. إضافة عامل مفرزة المقابلة، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. تسهيل عملية مفرزة عن طريق تنظيف القارورة بمكشطة خلية معقمة وجمع الخلايا مع ماصة المصلية.نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل والطرد المركزي. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع خلية الثقافة المتوسطة. قياس صلاحية الخلية باستخدام غرفة نيوباور مع استبعاد الأزرق تريبان أو طريقة أخرى للاختيار.الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في وسيط الحقن. يمكن العثور على تركيزات الخلايا الموصى بها في الوسط في الجدول الأول من المخطوطة. من هذه النقطة فصاعدا، يجب أن تبقى الخلايا على الجليد.إجراءات الحقن. تخدير الأجنة في tricaine 1X لمدة 5 دقائق. ثم، نقل كمية صغيرة من الأجنة تخدير إلى لوحة agarose ومحاذاتها مع مساعدة من حلقة دبوس الشعر.تأكد من الحفاظ على المسافة بين الأجنة. خصوصا بين صفار واحد ورأس واحد المقبل. لمنع الوفيات، تأكد من أن الأجنة المنحازة لا تجف في صفيحة الآجروز عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى ثلاث قطرات من محلول tricaine 1X إلى اللوحة بعناية.اضغط بخفة على أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإعادة تعليق الخلايا. قم بتحميل إبرة الحقن بتعليق الخلية باستخدام طرف Microloader ، وتجنب فقاعات الهواء ، لأنها يمكن أن تعرض سلامة الأجنة للخطر. افتح صمام ضغط الهواء، واقام الحقن المجهري، وضع إبرة الحقن الدقيق بعناية في الحامل.قطع إبرة الحقن المجهري على مقربة من الطرف. ثقب صفار الجنين بعناية ، وخفض زاوية الإبرة والدفع بحذر حتى يصل طرف الإبرة إلى الفضاء perivitelline. بمجرد أن يكون الطرف في الفضاء perivitelline، حقن الخلايا.حاول حقن حجم من الخلايا مشابه لحجم عين الجنين، وبقدر الإمكان من القلب لمنع وذمة القلب. ضبط ضغط الميكروبيكتور، إذا لزم الأمر. نقل الأجنة المحقونة إلى طبق بيتري نظيفة مع الحل 1X tricaine وتركها للراحة لمدة خمس إلى 10 دقائق.هذا سيعطي الجرح وقتا لإغلاقه إزالة الحل 1X tricaine وإضافة جديدة E3 المتوسطة. ثم، احتضان الأجنة في 34 درجة مئوية.هذه الحرارة ستسمح ببقاء كل من أجنة الحمار الوحشي والخلايا السرطانية البشرية. المقايسة النقيلية. إذا كنت ترغب في دراسة الإمكانات النقيلية لخطوط الخلايا الخاصة بك، في حوالي ساعة واحدة بعد الحقن، فحص الأجنة المحقونة على مجسم مفلور، وفرزها إلى مجموعتين وفقا لعدم وجود أو وجود خلايا سرطانية في الدورة الدموية.يوم واحد بعد الحقن. على مجسم مفلور، قم بتحليل كل جنين بعناية وحدد تلك التي تحتوي على أورام تم حقنها بشكل صحيح. فرز xenografts المحددة وفقا لحجم الورم.استخدام حجم العين للمقارنة. تجاهل أي أجنة مع مورفولوجيا غير طبيعية، وذمة القلب أو صفار، xenografts مع عدد قليل جدا من الخلايا السرطانية، أو تلك التي مع الخلايا السرطانية فقط داخل صفار. توزيع xenografts وفقا للتخطيط التجريبي المطلوب وبدء المقايسة المخدرات.استبدال الأدوية وE3 المتوسطة يوميا. احتضان xenografts، والحفاظ على درجة الحرارة من 34 درجة مئوية حتى نهاية المقايسة. أربعة أيام بعد الحقن.في اليوم الأخير من الفحص ، تخدير xenografts مع حل tricaine 1X ، ومحاذاتها بعناية على لوحة أجار. تجاهل أي xenografts ميتة أو منتفخة. لا تعتبر هذه xenografts للقياس الكمي engraftment.على مجسم مفلور، تحليل بعناية كل xenograft وتقييم غياب أو وجود الأورام في الفضاء perivitelline. وفقا لإعداد التجريبية، حدد xenografts من الفائدة والقتل الرحيم لهم مع tricaine 25X. إصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 4 ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة للمضي قدما في التخدير المناعي.خلاف ذلك، تخزين بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية وفي اليوم التالي، استبدال الفورمالديهايد مع الميثانول 100٪. يمكن تخزين Xenografts الثابتة في الميثانول 100٪ في 20 درجة إلى أجل غير مسمى. تركيب كامل مناعة للتصوير البؤري.تستغرق تقنية الفلورة المناعية الكاملة ثلاثة أيام ، مقسمة على النحو التالي. اليوم الأول هو ل permeabilization من xenografts واحتضان الأجسام المضادة الأولية. في اليوم الثاني، لغسل والحضانة الأجسام المضادة الثانوية.واليوم الثالث، لغسل، تثبيت xenografts والتخزين في المتوسط تصاعد. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في PDF المصاحب. تصاعد من xenografts.ختم حواف غطاء زلة مع هلام البترول أو الشحوم السيليكون، بحيث لا تسرب المتوسطة المتصاعدة. باستخدام ماصة باستور، نقل xenografts إلى زلة الغطاء. محاذاتها بعناية مع دبوس الشعر.أضف وسيط التركيب إلى قسيمة غطاء أخرى. انضم بعناية إلى كل من زلات الغطاء ووضعها فوق شريحة المجهر للسماح بالتلاعب الأسهل. التصوير الكونفوشيكال.عدسة الهدف الغمر 25X apochromatic مع تصحيح المياه هو الأمثل لتصوير الأورام مع قرار خلية واحدة. الحصول على عينات باستخدام الدالة Z-المكدس مع فاصل زمني من خمسة ميكرون بين كل شريحة. فتح البيانات الأولية في برنامج فيجي.حدد ثلاث شرائح تمثيلية للورم من أعلى ووسط وأسفل، لكل z-كومة، لكل xenograft. فتح البرنامج المساعد عداد الخلية من برنامج فيجي. في أداة عداد الخلية، انقر فوق تهيئة، وحدد نوع العداد، وانقر على الصورة لبدء وضع العد يدويا.لكل نقرة، يسأل العداد عن عدد الخلايا التي يتم حسابها. للحصول على العدد الإجمالي للخلايا في الورم، استخدم الصيغة التالية. لتقييم إجمالي الأرقام أو النسبة المئوية للعلامات ، مثل الخلايا المناعية ، والأرقام الميتوتيكية ، الكاسباز المنشط ، من بين أمور أخرى ، قم بتحديد الخلايا الإيجابية لوضع العلامات المحددة أو العلامة أو المتحولين جنسيا على طول جميع شرائح المكدس z مع المكون الإضافي ل Cell Counter.يجب أن تدرك أن بعض الخلايا سوف تقع بين شريحتين. انتقل ذهابا وإيابا في المكدس z للتأكد من أنه يتم حساب أي خلية مرتين. النتائج التمثيلية.HCT 116 تم إنشاء خط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم xenografts كما هو موضح في البروتوكول. تم توزيع Xenografts عشوائيا في الضوابط غير المعالجة والعلاج الكيميائي FOLFIRI. تم إجراء الفلورة المناعية للكشف عن الخلايا المبرمج ، وذلك باستخدام الأجسام المضادة للكاسباس -3 المضادة للمشقوق وDAPI لاحتواء النوى.كشف القياس الكمي للمؤشر الميتوتي ، موت الخلايا المبرمج ، وحجم الورم ، أن FOLFIRI يحفز انخفاضا كبيرا في الانقسام وتحريضا كبيرا من موت الخلايا المبرمج ، مصحوبا بانخفاض بنسبة 54٪ في حجم الورم. هذه الميزات مفيدة في شاشات الأدوية عالية الإنتاجية ، وكذلك لاختبار الآثار الجوهرية والفسيولوجية للخلية للعديد من علاجات السرطان في إطار زمني قصير. ميزة أخرى كبيرة لنموذج xenograft حمار وحشي هو أنه من الممكن لدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية المختلفة وتحليل كيف يمكن لكل نوع من الخلايا التأثير على سلوك الآخر.يمكن حقن خلايا سرطانية بشرية مختلفة، أو استنساخات مختلفة من نفس الورم، أو من أورام مختلفة. في هذا المثال، وصفت اثنين من خطوط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم المستمدة من نفس المريض مع الأصباغ الدهنية المختلفة ومختلطة في نسبة واحد إلى واحد للحقن. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على أن يصبحوا خبراء حقيقيين في توليد زنوبرافت سمك الحمار الوحشي.هذا ليس سهلا يجب أن تتدرب، تتدرب. لا تستسلمي، لا تستسلميأنا متأكد من أنك سوف تحصل هناك. حظ سعيد.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

زرع أورام الدماغ الزرد للأطفال في المضيفين ذوي الكفاءة المناعية لدراسة طويلة الأمد لسلوك الخلايا السرطانية واستجابة الأدوية

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

التقييم السريري بيواكتيفيتي OT48 الكومارين السرطان الماغنيسيوم وفحوصات تشكيل مستعمرة، وتكثيفها الزرد

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

استخدام الموجات فوق الصوتية تسترشد الأنسجة الموجهة غرس الخلوية لإنشاء تكثيفها الورم المنتشر بيولوجيا ذات الصلة

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...