Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Vi takker Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medfinansieret af FCT/Lisboa202020) for finansiering. FCT-stipendier til VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle medlemmer af Fior Lab til kritiske diskussioner; B. Costa og C. Rebelo de Almeida til deling af data; og vores Lab medlemmer C. Rebelo de Almeida, M. Barroso og L. Leite for deres deltagelse i videoen. Vi vil gerne takke CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) og Champalimaud Communication, Events and Outreach team især Alexandre Azinheira for den fantastiske filmproduktion og Catarina Ramos og Teresa Fernandes for deres hjælp.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

Zebrafiskens stigende betydning som model for kræftudvikling og lægemiddelscreening har resulteret i talrige publikationer3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Men injektion af kræftceller i zebrafisk embryoner er en teknik, der kræver en høj grad af fingerfærdighed, som kan være udfordrende for forskere. I denne protokol sigter vi mod at give praktiske oplysninger og nogle tips, der kan hjælpe med at overvinde de indledende udfordringer ved at oprette zebrafiskembryo xenografts.
Cellehåndtering før injektion Denne optimerede protokol til generering af zebrafisk xenografts med cellelinjer kan tilpasses forskellige typer (kræft) celler med forskellige morfologier. Vi anbefaler, at alle de cellelinjer, der bruges til zebrafisk xenografts, er mycoplasmafri. I modsætning til andre bakterielle forureninger genererer tilstedeværelsen af mycoplasma i cellekultur ikke ændringer, der let kan påvises under mikroskopet22. Mycoplasmaforurening kan påvirke cellelinjernes indskrivningspotentiale, deres følsomhed over for stoffer samt zebrafiskembryoernes levedygtighed.
Selvom celler kan fortsætte med at formere sig i en længere periode, kan deres fænotype og genotype være tilbøjelige til ændringer. Det er vigtigt at blive fortrolig med morfologien og adfærden af cellelinjerne i kulturen. Vi anbefaler at holde antallet af cellepassager efter optøning mellem 3-12 for at få reproducerbare resultater. Således bør der udføres regelmæssige mycoplasmatest.
Cellerne skal være i deres logfase (eksponentiel vækstfase, før de når sammenløb ~70%) på injektionsdagen. Dette vil muliggøre en passende engraftment og korrekt udvikling af de karakteristiske kendetegn ved tumoren. For at forhindre variation i fosotypen af celler i xenograft er det afgørende at opretholde sammenløbet for injektionskonstant mellem eksperimenter. Antallet af injicerede celler kan tilpasses hver cellelinjes karakteristika, da nogle kan kræve højere indsprøjtningstætheder for at trives i zebrafiskembryoner.
Overvejelser i forbindelse med cellemærkning For bedre at visualisere menneskelige tumorceller til injektion og fremtidig analyse kan tumorceller mærkes med fluorescerende farvestoffer. På grund af forskelle i cellestørrelse varierer det samlede antal celler/cm2 i klæbende kulturer mellem cellelinjer. Dette vil påvirke effekten af farvningsprotokollen samt antallet af celler, der høstes til injektion. Store celler, der giver lave tal pr. kolbe (dvs. Hs578T) eller vokser i klynger (dvs. I dette tilfælde bør farvning af celler ikke udføres direkte i kolben, da dette vil medføre brug af store mængder farvestof (høje omkostninger). På den anden side kan celler, der er meget følsomme over for for store cyklusser af centrifugering, samt celler, der giver et højt antal pr. kolbe (dvs. 
Når det er muligt, skal du i stedet for at bruge en enzymatisk tilgang bruge EDTA til at løsne cellerne på injektionsdagen, så cellerne genvinder deres cellecellekryds hurtigere og udsættes for mindre centrifugeringstrin. Ikke desto mindre, hvis cellerne er følsomme over for EDTA, meget vedhængende eller vokser i klynger - kan der anvendes en enzymatisk metode. Optimeringen af den ideelle koncentration til injektion samt injektionsmediet afhænger af hver cellelinjes karakteristika, og det kan derfor være nødvendigt at foretage visse justeringer (tabel 1).
Kalibrering af mikroinjektion I modsætning til levering af oligonukleotider eller lægemidler til zebrafiskembryoet anvendes en graticule ikke til at kalibrere nålen, når du arbejder med cellelinjer til xenografter. Efter nogen tid under injektionen begynder cellerne at tilstoppe, og det er nødvendigt at skære nålespidsen for at øge dens diameter eller ændre nålen helt. Denne procedure hindrer graticulekalibreringen.
For at løse dette problem reguleres antallet af udleverede celler af udslyngningstryk og den tid, der er nødvendig for at nå en størrelse svarende til embryoøjet inden for 1-3 impulser. Derefter, for yderligere at kontrollere tumor størrelse, på 1 dpi, xenografts sorteres i henhold til tumor størrelse som vist i figur 6 B-B ". Som repræsenteret i figur 6C eksempel, denne metode til sortering er effektiv til at reducere variationen af tumor størrelser: hvis vi samle dem alle sammen (+, ++, +++ ) STEV er ~ dobbelt af ++ klasse (~ 906 celler til ~ 422 celler) og koefficienten variation er ~ 31,9% i forhold til 14,5% i ++klassen. Da referencen til injektion er volumen, varierer det samlede antal celler meget mellem celletyper - afhængigt af cellernes størrelse og form. For eksempel, store celler med en masse cytoplasma som brystkræft Hs578T, producere meget mindre tumorer (~ 600 celler). Hver cellelinje kræver også forskellige antal celler. For eksempel har HT29 CRC og RT112 urinblære kræft cellelinjer vist, at jo højere antallet af injicerede celler, jo højere zebrafisk dødelighed. Derfor er en optimeringsperiode, samtidig med at xenografterne udvikles, nødvendig for at teste, om cellelinjen har toksiske virkninger i embryoet eller kræver højere/lavere injektionstæthed.
Injektionssted En af de mest almindelige uoverensstemmelser ved generering af zebrafisk embryo xenografts er injektionsstedet. Æggeblommen er normalt det foretrukne sted for injektion på grund af dens nemme tilgængelighed. Vi har dog observeret, at celler injiceret i æggeblommen har en højere tendens til at dø. Selvom det er teknisk vanskeligere, anbefaler vi injektion i PVS og så vidt muligt fra hjertet. Inden for PVS kan celler samle, rekruttere beholdere og immunceller og migrere, intravasere, ekstravasere og danne mikrometastase, hvis de udviser metastatiske egenskaber8,11.
Engraftment effektivitet Forskelle i engraftment effektivitet og tumor størrelse blandt cellelinjer på 4 dpi forventes på grund af deres forskellige grader af basal celle død / overlevelse / spredning, men også på grund af den medfødte immunogenicitet, at hver celle linje kan vise9.
metastase Metastaser består af en multistep kaskade af begivenheder, der kan opdeles i to vilkårlige faser. I første fase skal tumorceller løsne sig fra det primære sted, migrere og invadere tilstødende væv og derefter intravasere ind i blodbanen. I anden fase skal tumorceller overleve i omløb, ekstravasere fra blodet eller lymfekar og endelig kolonisere på sekundære steder23. At skelne mellem disse tidlige og sene begivenheder og løse de potentielle / færdigheder i de forskellige tumorceller til at udføre disse trin, vi designet en simpel analyse.
Generelt, når injiceres i PVS, tumorceller kan komme direkte i omløb og derefter få fysisk fanget i kaudale hæmatopoietiske væv (CHT) (hale region). Men i henhold til de særlige kendetegn ved hver tumor celle - vi har set, at nogle tumorceller forbliver på CHT 4 dpi og er i stand til at danne mikrometastase, mens andre tumorceller forsvinder (ryddet efter at blive fanget i CHT).
Derfor, ved at sammenligne mikrometastase effektivitet (ved 4 dpi), når cellerne blev placeret direkte i omløb - CIRC (celler behøver kun at gå gennem de sene trin i metastaser) vs når ikke - INGEN CIRC (celler skal gå gennem tidlige og sene skridt for at kunne danne en mikrometastase) kan vi vurdere deres tidlige eller sene metastatiske potentiale. Vi har observeret tumorceller, der effektivt kan danne mikrometastase i CHT i begge grupper (CIRC og NO CIRC), hvilket tyder på, at disse celler har kapacitet til at gennemgå alle trin i den metastatiske kaskade (SW480 og MDA-MB-468 for eksempel)8,11. I modsætning hertil har andre tumorceller et meget lavt metastatisk potentiale i begge grupper, næppe nogensinde at lave mikrometastase, selv når de injiceres i omløb (dvs. synlig i CHT ved 24 hpi, men ved 4 dpi er de ikke længere der, Hs578T for eksempel)8. Vi har imidlertid klart fundet en anden gruppe - en gruppe, der kun er i stand til at danne mikrometastase, når den injiceres i omløb (vi kan kun observere mikrometastase i CIRC-gruppen). Dette tyder på, at disse celler har en lav effektivitet i at udføre de første trin i den metastatiske kaskade, men på den anden side er i stand til at overleve i omløb, ekstravasere og kolonisere et fjernt sted.
Immunostaining og billeddannelse Før fiksering kan denne injektionsprotokol bruges til andre live billeddannelsesmetoder som levende differentialinterferenskontrastkontrofelli, roterende diskmikroskopi, højopløsnings live konfokal billeddannelse og lysarkmikroskopi osv.
Døde celler og celleaffald fremstår lyse, når de observeres gennem det fluorescerende stereomikroskop og kan forveksles med levende celler, især hvis formålet med undersøgelsen er at vurdere cellelinjernes metastatiske potentiale. Vi vil gerne understrege vigtigheden af at udføre konfokal billeddannelse med specifikke levedygtighedsmarkører og DAPI for at vurdere tumorens og mikrometastastastasens overlevelsestilstand. Det er også grundlæggende at bruge specifikke menneskelige antistoffer til at opdage menneskelige celler som anti-human mitokondrier eller anti-human HLA. Ved implementering af protokollen, tog experimenter øjne ved at sammenligne farvning i stereomikroskop med konfokale billeder. Efter nogen tid kan eksperimenter klart skelne snavs fra levende celler i det fluorescerende stereomikroskop.
Selvom andre metoder til at kvantificere tumorbyrde som hele fluorescensområdet er meget udbredt, anbefaler vi at udføre hele monteringsim immunostaining og konfokal billeddannelse som en mere præcis metode. Ikke kun effektiviteten af lipophilic farvestof farvning er meget variabel (dvs. nogle celler er meget godt farves mens andre ikke-sandsynligvis på grund af lipid indholdet af deres membraner), men også mange gange lipofile farvestoffer form aggregater, og døde celler tendens til at være lysere - at skabe flere artefakter, der kan forveksles med levende celler.
Celler kan transduceres med fluorescerende proteiner for at hjælpe med deres sporing og springe cellemærkning over. Men sørg for, at de transducerede og ikke-transducerede celler producerer de samme resultater i zebrafisk xenografts.
Derudover kan makrofager fyagocytter disse fluorescerende cellerester bliver fluorescerende mærket og migrere, generere falske positive metastatiske celler. Således anbefaler vi en række analytiske værktøjer, som naturligvis kan udvides til mange andre udlæsninger for en mere præcis fortolkning af tumoradfærd:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Spredning - kvantificering af mitotiske tal med DAPI- eller anti-pHH3Ser10-antistof (Merck Millipore Cat. #06-570)</li>
	<li>
Celledød ved apoptose- antistof antiaktiveret Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) eller tilsvarende,</li>
	<li>
Tumor størrelse - DAPI tælle-menneskelige tumorceller viser en meget tydelig chromatin organisation, så de er let skelnes fra zebrafisk celler og er altid muligt at dobbelttjekke med farvestof (når du træner øjet),</li>
	<li>
For metastatiske undersøgelser, at utvetydigt opdage menneskelige celler, - anti-human HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-menneskelige mitokondrier (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Klon 113-1).</li>
</ul>For en konfokal erhvervelse med 5 μm interval mellem skiver i Z-stakken af kontrol kræftceller HCT116 (gennemsnitlig nuklear størrelse på 10-12 μm diameter) med DAPI modstaining, har vi observeret, at ~ 50% af cellerne deles mellem to på hinanden følgende skiver. Derfor, hvis hver skive tælles, er der stor risiko for at tælle de samme celler to gange. At gå frem og tilbage mellem skiver for at undgå problemer med kvantificering resulterer i en tidskrævende og fejlbehæftet teknik. For at lette kvantificeringen af det samlede antal celler og give mulighed for mere reproducerbarhed mellem forskere, skabte vi tumorstørrelsesformlen, der tidligere er beskrevet i denne protokol8.
Vi inkluderede et korrektionsnummer (1,5) for at tage højde for de ~50% celler, der deles mellem udsnit. Vi fandt ud af, at den gennemsnitlige fejl ved manuel optælling af hele tumoren mellem forskere var 20%. To forskere ved hjælp af formlen havde en 2% fejl. Brugen af denne formel har en nøjagtighedsgrad på 93% og 98% reproducerbarhedshastighed. Vi testede også automatiserede metoder, men de viste en fejl, der var højere end 50 % forårsaget af tærskelindstillinger.
På grund af apoptotiske cellers egenskaber er kvantificeringen af aktiverede Caspase 3-celler vanskeligere. For at reducere antallet af fejl og variation i resultaterne anbefaler vi, at kontrol- og forsøgsprøver tælles af den samme forsker. Derudover, når man lærer denne teknik, skal en ny forsker tælle billeder, der allerede var kvantificeret af mere erfarne forskere for at sammenligne resultater og træne.
Analysens længde kan forlænges, hvis det er nødvendigt. Det er dog vigtigt at overveje, at zebrafisklarver kræver levende fodring fra ~ 7 dage efter befrugtning (5 dage efter injektion). Derudover kan dyrevelfærdsretningslinjerne og -reglerne for larver, der er ældre end 6 dage efter befrugtningen, variere.
Denne protokol giver nyttige værktøjer til at gøre det muligt for en enkelt forsker at injicere ca ~ 200-300 zebrafisk larver i timen; og resultater for den fuldstændige analyse, herunder analyse og statistisk fortolkning, opnået på tre uger. Vi håber, at denne protokol kan hjælpe forskere med at blive eksperter i at generere zebrafisk xenografts. Det er ikke let. du har brug for at øve, men du vil komme dertil. Held og lykke!

Zebrafisk (Danio rerio) er på vej som en kraftig hvirveldyr model organisme til at studere udvikling og sygdom. Zebrafisk deler stærkt bevarede genetiske (~70% genetisk homologi og ~84% sygdomsrelaterede gener) og grundlæggende organmorfologiske træk hos mennesker1,2. Denne bevarelse tillader brug af zebrafisk til at modellere flere menneskelige sygdomme, herunder kræft3,4.
Håndtering og vedligeholdelse af zebrafisk er meget lettere og mere omkostningseffektiv end mus på grund af deres lille størrelse, høj fecundity hele året rundt og ekstern befrugtning3,5. Zebrafisk embryoner kræver ikke levende fodring i løbet af deres første 5-7 dage af livet og er blevet brugt som en effektiv model for udvikling, infektion og kræft1,4,6,7. Zebrafisk embryoner klækkes på 48 timer efter befrugtning (hpf) og er fritsvømte dyr med alle dannede organer, et bankende hjerte og funktionelt kredsløbssystem, lever, hjerne, nyremarv osv.1,3. Også på dette udviklingsstadium kun medfødte immunitet er på spil, adaptiv immunitet er stadig under udvikling, så en generel effektiv engraftment af menneskelige celler uden behov for brug af immunkompromitterede mutanter7,8. Ikke desto mindre er det vigtigt at bemærke, at ikke alle menneskelige celler engraft lige9, og at det for f.eks. leukæmiceller blev påvist, at fagocytter (neutrofiler og makrofager) skal nedbrydes for at sikre effektiv engraftment10.
Zebrafiskens genetiske tarmkanal og den optiske gennemsigtighed i dens tidlige embryonale stadier giver mulighed for intravital billeddannelse i en enkelt celle i høj opløsning og dermed for etablering af avancerede billeddannelsesteknikker inden for forskellige biologiområder. Desuden, i forbindelse med kræft, disse funktioner er nyttige for real-time undersøgelser af de tidligste stadier af vært-tumor interaktioner, som at studere angiogene og metastatiske potentiale, samt interaktioner med det medfødte immunsystem8,9,11,12,13.
Selv i den korte xenograft assay er der ikke tid til metastatisk "evolution" - det er muligt at analysere tumorcellernes metastatiske kapacitet (dvs. deres effektivitet til at gå gennem metastatiske trin som invasion, intravasation, overlevelse i omløb, ekstravasation og kolonisering og derfor studere disse processer in vivo og i realtid8,11,13,14).
Kendetegnene ved dens livscyklus placerer zebrafisken som en unik model for personlig medicin i kræft. Assays kan udføres på kortere tid og resultater opnået i et par uger7,8,9,11,12,15,16. Celerity og gennemførligheden af disse assays giver læger og forskere mulighed for at opnå translationelle resultater, der kan være nyttige for kræftpatienter, for hvem tid er et væsentligt behov.
På trods af de stigende forsøg på at generere vellykkede zebrafiskembryo xenografter er der stadig behov for standardisering af injektionsproceduren samt evaluering af cellelevedygtighed og tumoradfærd efter injektion.
I denne protokol giver vi forskere en klar og detaljeret trin-for-trin guide til injektion af humane kræftcellelinjer i zebrafiskembryoner og efterfølgende fiksering, immunostaining, billeddannelse og kvantificering af tumorcelleadfærd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

Zebrafisk larve xenografts bliver udbredt til kræftforskning til at udføre in vivo og real-time undersøgelser af kræft hos mennesker. Muligheden for hurtigt at visualisere reaktionen på kræftbehandlinger (kemo, strålebehandling og biologiske), angiogenese og metastaser med enkeltcelleopløsning placerer zebrafisk xenograft-modellen som et øverste valg til at udvikle prækliniske undersøgelser.

Zebrafisk larve xenograft assay præsenterer flere eksperimentelle fordele i forhold til andre modeller, men sandsynligvis den mest slående er reduktionen af størrelsesskalaen og dermed tid. Denne reduktion af skalaen tillader enkeltcellebilleddannelse, brug af et relativt lavt antal menneskelige celler (kompatibel med biopsier), medium-høj-gennemløb lægemiddelscreeninger, men vigtigst af alt muliggør en betydelig reduktion af tidspunktet for analysen. Alle disse fordele gør zebrafisk xenograft assay yderst attraktivt for fremtidige personlige medicin applikationer.

Mange zebrafisk xenograft protokoller er blevet udviklet med en bred mangfoldighed af menneskelige tumorer; Der mangler dog stadig en generel og standardiseret protokol til effektiv generering af zebrafisk larve xenografts. Her giver vi en trin-for-trin protokol, med tips til at generere xenografts og retningslinjer for tumor adfærd analyse, hele mount immunofluorescens, og konfokale billeddannelse kvantificering.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Her leverer vi en trinvis protokol med tip til at generere xenografts og retningslinjer for tumoradfærdsanalyse, fuldmonterings immunofluorescens og konfokal billeddannelseskvantificering.

Generation af zebrafisk Larval Xenografts og Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafisk xenografts bliver udbredt til kræftforskning. Du kan tage menneskelige tumorceller og injicere det i små larver zebrafisk, eller endda i voksne. Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol af larvemodellen, hvor vi kan studere flere menneskelige kræft kendetegnende i et levende dyr.Du kan studere spredning, du kan studere angiogenese, du kan studere metastaser, og også interaktioner inden for tumormikromiljøet. Og en stor fordel er, at du kan studere dette inden for en meget kort tidsramme. Bare fire dage, for eksempel.En anden stor fordel er, at du kan studere dette live med enkelt celle opløsning, ved hjælp af en konfokal eller et lysark mikroskop. Du kan studere, hvordan celler migrerer, hvordan celler interagerer med hinanden, eller endda hvordan de taler med hinanden. Så det er en virkelig kraftfuld model til at studere kræftbiologi.Zebrafisk xenografts kan bruges til at studere respons på anti-cancer behandlinger, som kemoterapi, strålebehandling, eller endda målrettede behandlinger med antistoffer. Og endelig, også, denne protokol kan også tilpasses til at bruge patient-afledte celler fra en kirurgisk prøve, eller endda fra biopsier, og derefter generere zebrafisk avatarer. Gør det til injektion.To uger før injektionen udvides cellerne i kulturen. Start med overskydende celler og overskydende fisk, indtil de bliver dygtige med teknikken, da mange celler og fisk vil gå tabt under træningen. Tabel et af de ledsagende PDF-filer har en detaljeret vejledning om de optimale procentdele af in vitro-sammenløb til injektion af flere cellelinjer.Tre dage før injektionen krydser zebrafisken i den ønskede baggrund. 24 timer før injektionen. Rengør zebrafiskembryoner.Kassér alle døde og ikke-udviklede embryoner og opdater E3-mediet. Kassér cellekulturmediet i cellekulturrummet. Vask en gang med PBS 1X for at fjerne de døde celler og tilsæt frisk medium.Forbered værktøjerne til injektionsproceduren, såsom mikroinjection nåle, agaroseplader og hårnåle for at justere embryonerne til injektion. Til pladeforberedelsen hældes et lag opløst 2%agarose i låget på en ren petriskål. Lad det polymerisere og ved hjælp af en lineal, lav tre til fire lige agaroselinjer til tilpasning af embryonerne.Injektionsdag. Adskil de udklækkede embryoner fra unhatched æg. Tilføjelse Pronase til embryo medium på dette tidspunkt kan øge udklækning.Placer embryonerne i inkubatoren ved 28 grader Celsius indtil injektion. Cellemærkning til injektion. For at hjælpe med at etablere en reproducerbar cellemærkningsteknik skal du kontrollere tabel et og to i den skriftlige protokol for en samling af en liste over cellelinjer og flere mærkningsløsninger.Fjern cellekulturmediet og vask kolben to gange med PBS 1X. Mærk cellerne med et lipofilt farvestof, undgå udsættelse for lys, og inkuber kolben ved 37 grader. Du kan også vælge at mærke cellerne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved løsrivelse.Fjern cellemærkningsopløsningen, og vask cellerne med PBS 1X for at fjerne det overskydende farvestof. Tilsæt det tilsvarende løsrivelsesmiddel, og inkubter cellerne ved 37 grader Celsius. Afmonteringsprocessen lettes ved at børste kolben med en steril celleskraber og samle cellerne med en serologisk pipette.Cellerne overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge. Kassér supernatant og suspendere pellet med cellekultur medium. Kvantificere celle levedygtighed ved hjælp af en Neubauer kammer med trypan blå udelukkelse eller anden metode valg.Centrifuge og suspendere cellerne i injektionsmediet igen. De anbefalede koncentrationer af celler i medium findes i tabel et af manuskriptet. Fra nu af skal cellerne holdes på is.Injektionsprocedurer. Bedøve embryoner i tricain 1X i 5 minutter. Overfør derefter en lille mængde bedøvede embryoner til en agaroseplade og juster dem ved hjælp af en hårnålsløjfe.Sørg for at holde afstand mellem embryonerne. Især mellem æggeblommen på en og hovedet på den næste. For at forhindre dødelighed skal det sikres, at de justerede embryoner ikke tørrer ud i agarosepladen ved forsigtigt at tilsætte en til tre dråber tricain 1X opløsning til pladen.Tryk let på mikrocentrifugerøret for at suspendere cellerne igen. Indsprøjtningsnålen med en celleaffjedring med en Microloader-spids, så luftbobler undgås, da de kan kompromittere embryonernes integritet. Åbn lufttryksventilen, opsæt mikroinjektoren, og placer forsigtigt mikroinjection nålen i holderen.Skær mikroinjection nålen tæt på spidsen. Gennembor forsigtigt embryoets æggeblomme, sænk nålens vinkel og skub forsigtigt, indtil nålespidsen når perivitellinerummet. Når spidsen er i perivitelline rummet, injicere cellerne.Prøv at injicere et volumen af celler svarende til størrelsen af embryoets øje, og så vidt muligt fra hjertet for at forhindre hjerteødem. Juster mikroinjektortrykket, hvis det er nødvendigt. Overfør de injicerede embryoner til en ren petriskål med tricain 1X opløsning og lad dem hvile i fem til 10 minutter.Dette vil give såret tid til at lukke. Fjern tricain 1X opløsning og tilsæt frisk E3 medium. Derefter inkuber embryonerne ved 34 grader Celsius.Denne temperatur vil gøre det muligt for overlevelsen af både zebrafiskembryoner og de menneskelige tumorceller. Metastatisk analyse. Hvis du ønsker at studere det metastatiske potentiale i din celle linjer, på omkring en time efter injektion, screene de injicerede embryoner på en fluorescens stereomikroskop, og sortere dem i to grupper i henhold til fravær eller tilstedeværelse af kræftceller i omløb.En dag efter injektionen. På et fluorescens stereomikroskop skal du omhyggeligt analysere hvert foster og vælge dem med korrekt injicerede tumorer. Sorter de valgte xenografts efter tumor størrelse.Brug størrelsen af øjet til sammenligning. Kassér alle embryoner med unormal morfologi, hjerte- eller æggeblommeødem, xenografter med meget få kræftceller eller dem med kræftceller kun inde i æggeblommen. Fordel xenografts i henhold til den ønskede eksperimentelle layout og starte stoffet assay.Udskift stofferne og E3-mediet dagligt. Inkuber xenografterne og opretholder temperaturen på 34 grader Celsius indtil slutningen af analysen. Fire dage efter injektionen.På den sidste dag i analysen bedøves xenografterne med tricain 1X-opløsning og justerer dem omhyggeligt på agarpladen. Kassér eventuelle døde eller hævede xenografts. Disse xenografts tages ikke i betragtning ved engraftment kvantificering.På et fluorescens stereomikroskop analyseres omhyggeligt hver xenograft og vurderer fraværet eller tilstedeværelsen af tumorer i perivitellinerummet. Ifølge den eksperimentelle opsætning skal du vælge xenografts af interesse og aflive dem med tricaine 25X. Fix dem i 4%formaldehyd i mindst 4 timer ved stuetemperatur til at fortsætte med immunostaining.Ellers opbevares natten over ved fire grader Celsius og den næste dag erstatte formaldehyd med 100% methanol. Xenografts fast i 100% methanol kan opbevares ved 20 grader på ubestemt tid. Hele mount immunostaining for confocal billeddannelse.Hele mount immunofluorescens teknik tager tre dage, opdelt som følger. Den første dag er for gennemtrængning af xenografts og primære antistof inkubation. Den anden dag, til vask og sekundær antistof inkubation.Og den tredje dag, til vask, fiksering af xenografts og opbevaring i monteringsmediet. Flere detaljer om denne procedure kan findes i den ledsagende PDF. Montering af xenografts.Forsegl kanterne af et dæksel slip med vaseline eller silikone fedt, således at monteringsmediet ikke lækker. Ved hjælp af en Pasteur pipette overføres xenografts til dækslet. Juster dem forsigtigt med en hårnål.Tilstør monteringsmediet til en anden dæksedlen. Tilslut forsigtigt begge dæksedler, og placer dem oven på et mikroskopdias for at gøre det lettere at manipulere. Konfokal billeddannelse.En apochromatic 25X nedsænkning objektiv linse med vand korrektion er optimal til billeddannelse tumorer med en enkelt celle opløsning. Anskaf prøverne ved hjælp af Z-Stack-funktionen med et interval på fem mikron mellem hver skive. Åbn de rå data i Fiji-softwaren.Vælg tre repræsentative skiver af tumoren fra toppen, midten og bunden, pr. z-stak, pr. xenograft. Åbn celltæller-plug-in'en fra Fiji-softwaren. Klik på Initialiser i værktøjet Celletæller, vælg en tællertype, og klik på billedet for at starte optællingstilstanden manuelt.For hvert klik spørger tælleren, hvor mange celler der tælles. For at opnå det samlede antal celler i tumoren skal du bruge følgende formel. At vurdere det samlede antal eller procentdelen af markører, såsom immunceller, mitotiske tal, aktiverede caspase, blandt andre, kvantificere manuelt de celler, der er positive over for den specifikke mærkning, markør eller transgene af interesse langs alle skiver af z-stakken med Cell Counter plugin.Vær opmærksom på, at nogle celler vil være placeret mellem to skiver. Gå frem og tilbage i z-stakken for at sikre, at ingen celle tælles to gange. Repræsentative resultater.HCT 116 kolorektal cancer celle linje xenografts blev genereret som beskrevet i protokollen. Xenografts blev tilfældigt fordelt i ikke-behandlede kontroller og FOLFIRI kemoterapi. Immunofluorescens blev udført for at opdage apoptotiske celler, ved hjælp af anti-kløvet caspase-3 antistof og DAPI for nuklein modstaining.Kvantificering af mitotisk indeks, apoptose og tumorstørrelse afslørede, at FOLFIRI fremkalder et betydeligt fald i mitose og en betydelig induktion af apoptose ledsaget af en 54% reduktion af tumorstørrelse. Disse funktioner er nyttige i høj-gennemløb fænotypiske stof skærme, samt at teste cellen iboende og fysiologiske virkninger af flere kræftbehandlinger i en kort tidsramme. En anden stor fordel ved zebrafisk xenograft model er, at det er muligt at studere samspillet mellem forskellige tumorceller og analysere, hvordan hver type celle kan påvirke den andens adfærd.Forskellige menneskelige kræftceller, forskellige kloner fra den samme tumor, eller fra forskellige tumorer, kan co-injiceres. I dette eksempel, to kolorektal cancer cellelinjer stammer fra samme patient var mærket med forskellige lipofile farvestoffer og blandet i et forhold på en-til-en til injektion. Vi håber, at denne protokol kan hjælpe forskere med at blive reelle eksperter i at generere zebrafisk xenografts.Det er ikke let. Du er nødt til at øve dig, øve dig. Giv ikke op.Jeg er sikker på, du når frem. Held og lykke.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opførsel af humane brystcancerceller i embryonale zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation af zebrafisk-pædiatriske hjernetumorer til immunkompetente værter til langvarig undersøgelse af tumorcelleradfærd og lægemiddelrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel og hurtig metode til at opnå høj kvalitet Tumor DNA fra klinisk-patologisk prøvemateriale ved hjælp af Touch aftryk cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Prækliniske vurdering af Bioactivity af Anticancer cumarin OT48 af Spheroids, koloni dannelse Assays og zebrafisk Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Udnyttelse af ultralyd guidede væv-instrueret cellulære Implantation for etablering af biologisk relevante metastatisk Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo billeddannelse og Kvantitation af værten Angiogen respons i Zebrafish tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...