Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Wij danken Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medegefinancierd door FCT/Lisboa2020) voor de financiering. FCT fellowships voor VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle leden van het Fior Lab voor kritische discussies; B. Costa en C. Rebelo de Almeida voor het delen van gegevens; en onze Lab-leden C. Rebelo de Almeida, M. Barroso en L. Leite voor hun deelname aan de video. We willen de CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) en champalimaud communication, events en outreach team in het bijzonder Alexandre Azinheira bedanken voor het fantastische maken van films en Catarina Ramos en Teresa Fernandes voor hun hulp.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

Het toenemende belang van de zebravis als model voor kankerontwikkeling en geneesmiddelenscreening heeft geresulteerd in talrijke publicaties3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. De injectie van kankercellen in zebravisembryo's is echter een techniek die een hoge mate van behendigheid vereist die een uitdaging kan zijn voor onderzoekers. In dit protocol willen we praktische informatie en enkele tips geven die kunnen helpen bij het overwinnen van de eerste uitdagingen van het opzetten van zebravisembryo xenografts.
Celbehandeling eerdere injectie Dit geoptimaliseerde protocol voor het genereren van zebravis xenografts met cellijnen kan worden aangepast aan verschillende soorten (kanker)cellen met verschillende morfologieën. We raden aan dat alle cellijnen die worden gebruikt voor zebravis xenografts mycoplasma vrij zijn. In tegenstelling tot andere bacteriële besmettingen genereert de aanwezigheid van mycoplasma in celkweek geen veranderingen die gemakkelijk onder de microscoop kunnen worden gedetecteerd22. Mycoplasmabesmetting kan van invloed zijn op het engraftmentpotentieel van de cellijnen, hun gevoeligheid voor geneesmiddelen en de levensvatbaarheid van de zebravisembryo's.
Hoewel cellen zich gedurende een langere periode kunnen blijven verspreiden, kunnen hun fenotype en genotype gevoelig zijn voor veranderingen. Het is belangrijk om vertrouwd te raken met de morfologie en het gedrag van de cellijnen in cultuur. We raden aan om het aantal celpassages na ontdooiing tussen 3-12 te houden om reproduceerbare resultaten te krijgen. Daarom moeten regelmatig mycoplasmatests worden uitgevoerd.
Cellen moeten zich in hun logfase bevinden (exponentiële groeifase voordat ze samenvloeiing bereiken ~70%) op de dag van de injectie. Dit zal een adequate engraftment en een goede ontwikkeling van de kenmerken van de tumor mogelijk maken. Om variatie in het fenotype van cellen in het xenograft te voorkomen, is het van cruciaal belang om de samenvloeiing voor injectieconstante tussen experimenten te behouden. Het aantal geïnjecteerde cellen kan worden aangepast aan de kenmerken van elke cellijn, omdat sommige hogere dichtheden van injectie vereisen om te gedijen in de zebravisembryo's.
Overwegingen bij celetikettering Om menselijke tumorcellen beter te visualiseren voor injectie en toekomstige analyse, kunnen tumorcellen worden geëtiketteerd met fluorescerende kleurstoffen. Vanwege verschillen in celgrootte varieert het totale aantal cellen/cm2 in aanhangend culturen tussen cellijnen. Dit heeft invloed op de effectiviteit van het kleuringsprotocol en het aantal cellen dat voor injectie wordt geoogst. Grote cellen die lage aantallen per kolf (d.w.z. Hs578T) opleveren of in clusters groeien (d.w.z. BFTC905) vereisen het bundelen van meerdere kolven voor één experiment. In dit geval mag de kleuring van cellen niet rechtstreeks in de kolf worden uitgevoerd, omdat dit het gebruik van overmatige hoeveelheden kleurstof (hoge kosten) zal veroorzaken. Aan de andere kant kunnen cellen die zeer gevoelig zijn voor overmatige cycli van centrifugeren en cellen die hoge aantallen per kolf opleveren (d.w.z. HCT116) direct in de kolf worden gekleurd en vervolgens worden losgemaakt met EDTA/celschraper (Zie tabel 1voor meer informatie ).
Gebruik waar mogelijk, in plaats van een enzymatische benadering, EDTA om de cellen op de dag van injectie los te maken, zodat cellen hun celcelverbindingen sneller herstellen en minder centrifugeerstappen krijgen. Niettemin, als de cellen gevoelig zijn voor EDTA, zeer aanhangend zijn of in clusters groeien - kan een enzymatische methode worden toegepast. De optimalisatie van de ideale concentratie voor injectie en het injectiemedium is afhankelijk van de kenmerken van elke cellijn, dus het kan enige aanpassingen nodig hebben (Tabel 1).
Micro-injection kalibratie In tegenstelling tot de levering van oligonucleotiden of geneesmiddelen in het zebravisembryo, wordt een graticule niet gebruikt om de naald te kalibreren bij het werken met cellijnen voor xenograften. Na enige tijd tijdens de injectie beginnen cellen te verstoppen en is het noodzakelijk om de punt van de naald te snijden om de diameter te vergroten of de naald helemaal te veranderen. Deze procedure belemmert de graticulekalibratie.
Om dit probleem aan te pakken, wordt het aantal toegediende cellen gereguleerd door de uitwerpdruk en de tijd die nodig is om binnen 1-3 pulsen een grootte te bereiken die vergelijkbaar is met het embryooog. Vervolgens, om de tumorgrootte verder te controleren, bij 1 dpi, worden xenografts gesorteerd op basis van de tumorgrootte zoals weergegeven in figuur 6 B-B". Zoals weergegeven in figuur 6C voorbeeld, is deze sorteermethode efficiënt in het verminderen van de variatie van tumorgroottes: als we ze allemaal samen bundelen (+, ++, +++) is de STEV ~het dubbele van de ++-klasse (~906 cellen tot ~422 cellen) en de coëfficiëntvariatie is ~31,9% in vergelijking met 14,5% in de ++-klasse. Aangezien de referentie voor injectie volume is, varieert het totale aantal cellen sterk tussen celtypen - afhankelijk van de grootte en vorm van de cellen. Grote cellen met veel cytoplasma zoals borstkanker Hs578T produceren bijvoorbeeld veel kleinere tumoren (~ 600 cellen). Elke cellijn vereist ook een ander aantal cellen. Zo hebben de HT29 CRC- en RT112-cellijnen voor urineblaaskanker aangetoond dat hoe hoger het aantal geïnjecteerde cellen, hoe hoger de zebravissterfte. Daarom is een periode van optimalisatie tijdens het ontwikkelen van de xenograften nodig om te testen of de cellijn toxische effecten in het embryo heeft of hogere / lagere dichtheden van injectie vereist.
Injectieplaats Een van de meest voorkomende discrepanties bij het genereren van zebravisembryo xenografts is de injectieplaats. De dooier is meestal de plaats bij uitstek voor injectie vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid. We hebben echter waargenomen dat cellen die in de dooier worden geïnjecteerd een hogere neiging hebben om te sterven. Hoewel technisch moeilijker, raden we aan om de PVS in te injecteren en zo ver mogelijk van het hart. Binnen het PVS kunnen cellen zich aggregeren, vaten en immuuncellen rekruteren en migreren, intravaseren, extravaseren en micrometastase vormen, als ze gemetastaseerde kenmerkenvertonen 8,11.
Engraftment efficiëntie Verschillen in de engraftmentefficiëntie en tumorgrootte tussen cellijnen bij 4 dpi worden verwacht vanwege hun verschillende mate van basale celdood / overleving / proliferatie, maar ook vanwege de aangeboren immunogeniciteit die elke cellijn kan weergeven9.
uitzaaiing Metastase bestaat uit een multistep cascade van gebeurtenissen die kan worden onderverdeeld in twee willekeurige stadia. In de eerste fase moeten tumorcellen loskomen van de primaire plaats, migreren en aangrenzende weefsels binnendringen en vervolgens in de bloedbaan intravaseren. In de tweede fase moeten tumorcellen overleven in de bloedsomloop, extravaseren uit het bloed of de lymfevaten en uiteindelijk koloniseren op secundaire plaatsen23. Om onderscheid te maken tussen deze vroege en late gebeurtenissen en de potentiële/ vaardigheid van de verschillende tumorcellen aan te pakken om deze stappen uit te voeren, hebben we een eenvoudige test ontworpen.
Over het algemeen kunnen tumorcellen, wanneer ze in het PVS worden geïnjecteerd, direct in de circulatie komen en vervolgens fysiek vast komen te zitten in het caudale hematopoëtische weefsel (CHT) (staartgebied). Volgens de kenmerken van elke tumorcel hebben we echter gezien dat sommige tumorcellen op de CHT 4 dpi blijven en micrometastase kunnen vormen terwijl andere tumorcellen verdwijnen (gewist nadat ze in de CHT zijn gevangen).
Daarom kunnen we, door de efficiëntie van micrometastasen (bij 4 dpi) te vergelijken wanneer cellen direct in omloop werden gebracht - CIRC (cellen hoeven alleen de late stappen van metastase te doorlopen) versus wanneer niet - GEEN CIRC (cellen moeten vroege en late stappen doorlopen om een micrometastase te kunnen vormen) kunnen we hun vroege of late gemetastaseerde potentieel beoordelen. We hebben tumorcellen waargenomen die efficiënt micrometastase in de CHT kunnen vormen in beide groepen (CIRC en NO CIRC), wat suggereert dat deze cellen de capaciteit hebben om alle stappen van de gemetastaseerde cascade (SW480 en MDA-MB-468 bijvoorbeeld)8,11te ondergaan. Andere tumorcellen daarentegen hebben een zeer laag gemetastaseerd potentieel in beide groepen, waardoor ze bijna nooit micrometastase maken, zelfs wanneer ze in omloop worden geïnjecteerd (d.w.z. zichtbaar in de CHT bij 24 hpi, maar bij 4 dpi zijn ze er niet meer, Hs578T bijvoorbeeld)8. We hebben echter duidelijk een andere groep gevonden - een groep die alleen micrometastase kan vormen wanneer deze in omloop wordt geïnjecteerd (we kunnen alleen micrometastase in de CIRC-groep waarnemen). Dit suggereert dat deze cellen een lage efficiëntie hebben bij het uitvoeren van de eerste stappen van de gemetastaseerde cascade, maar aan de andere kant in staat zijn om in omloop te overleven, een verre locatie te extravaseren en te koloniseren.
Immunostaining en beeldvorming Vóór fixatie kan dit injectieprotocol worden gebruikt voor andere live beeldvormingsbenaderingen zoals DIC-microscopie (Live Differential Interference Contrast), spinning disk microscopie, live confocale beeldvorming met hoge resolutie en microscopie van lichtplaten, enz.
Dode cellen en cellulair puin lijken helder wanneer ze worden waargenomen door de fluorescerende stereomicroscoop en kunnen worden verward met levende cellen, vooral als het doel van de studie is het gemetastaseerde potentieel van de cellijnen te beoordelen. We willen het belang benadrukken van het uitvoeren van confocale beeldvorming met specifieke levensvatbaarheidsmarkers en DAPI om de overlevingstoestand van de tumor en micrometastase te beoordelen. Het is ook van fundamenteel belang om specifieke menselijke antilichamen te gebruiken om menselijke cellen zoals anti-menselijke mitochondriën of anti-menselijke HLA te detecteren. Train bij het implementeren van het protocol experimenteerogen door de kleuring in de stereomicroscoop te vergelijken met de confocale beelden. Na enige tijd kunnen experimenteerders vuil duidelijk onderscheiden van levende cellen in de fluorescerende stereomicroscoop.
Hoewel andere methoden om tumorlast te kwantificeren, zoals het hele fluorescentiegebied, veel worden gebruikt, raden we aan om whole mount immunostaining en confocale beeldvorming uit te voeren als een nauwkeurigere methode. Niet alleen de efficiëntie van lipofiele kleurstofkleuring is zeer variabel (d.w.z. sommige cellen zijn zeer goed gekleurd, terwijl andere niet - waarschijnlijk vanwege het lipidegehalte van hun membranen), maar ook vaak lipofiele kleurstoffen vormen aggregaten, en dode cellen hebben de neiging helderder te zijn - waardoor verschillende artefacten ontstaan die kunnen worden verward met levende cellen.
Cellen kunnen worden getransduceerd met fluorescerende eiwitten om te helpen bij het volgen en om celetikettering over te slaan. Zorg er echter voor dat de transduceerde en niet-transduceerde cellen dezelfde resultaten produceren in de zebravis xenografts.
Bovendien kunnen macrofagen deze fluorescerende celresten fagocyten die fluorescerend worden gelabeld en migreren, waardoor vals-positieve gemetastaseerde cellen worden gegenereerd. Daarom raden we een reeks analytische tools aan, die natuurlijk kunnen worden uitgebreid tot vele andere uitlezingen voor een nauwkeurigere interpretatie van tumorgedrag:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Proliferatie - kwantificering van mitotische cijfers met DAPI of anti-pHH3Ser10 antilichaam (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Celdood door apoptose- antilichaam anti-geactiveerd Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) of gelijkwaardig,</li>
	<li>
Tumorgrootte - DAPI-telling- menselijke tumorcellen vertonen een zeer duidelijke chromatineorganisatie, zodat ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de zebraviscellen en het altijd mogelijk is om dubbel te controleren met de kleurstof (wanneer u uw oog traint),</li>
	<li>
Voor gemetastaseerde studies, om ondubbelzinnig menselijke cellen te detecteren, - anti-menselijke HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-menselijke mitochondriën (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>Voor een confocale verwerving met een interval van 5 μm tussen segmenten in de Z-stack van de controlekankercellen HCT116 (gemiddelde nucleaire grootte van 10-12 μm diameter) met DAPI-tegenstaining, hebben we waargenomen dat ~ 50% van de cellen wordt gedeeld tussen twee opeenvolgende segmenten. Daarom, als elk segment wordt geteld, is er een hoog risico om dezelfde cellen twee keer te tellen. Heen en weer gaan tussen segmenten om problemen bij kwantificering te voorkomen, resulteert in een tijdrovende en foutgevoelige techniek. Om de kwantificering van het totale aantal cellen te vergemakkelijken en meer reproduceerbaarheid tussen onderzoekers mogelijk te maken, hebben we de tumorgrootteformule gemaakt die eerder in dit protocol is beschreven8.
We hebben een correctienummer (1,5) opgenomen om rekening te houden met de ~ 50% cellen die tussen segmenten worden gedeeld. We ontdekten dat de gemiddelde fout van handmatig tellen van de hele tumor tussen onderzoekers 20% was. Twee onderzoekers die de formule gebruikten, hadden een fout van 2%. Het gebruik van deze formule heeft een nauwkeurigheidspercentage van 93% en een reproduceerbaarheidspercentage van 98%. We hebben ook geautomatiseerde methoden getest, maar ze toonden een fout aan die hoger was dan 50% veroorzaakt door drempelinstellingen.
Vanwege de kenmerken van apoptotische cellen is de kwantificering van geactiveerde Caspase 3-cellen moeilijker. Om het aantal fouten en variatie in resultaten te verminderen, raden we aan dat de controle- en experimentele monsters door dezelfde onderzoeker worden geteld. Bovendien moet een nieuwe onderzoeker bij het leren van deze techniek afbeeldingen tellen die al door meer ervaren onderzoekers zijn gekwantificeerd om resultaten te vergelijken en te trainen.
De lengte van de test kan indien nodig worden verlengd. Het is echter belangrijk om te overwegen dat zebravislarven levende voeding nodig hebben vanaf ~ 7 dagen na bevruchting (5 dagen na injectie). Bovendien kunnen de richtlijnen en voorschriften voor dierenwelzijn die van toepassing zijn op larven ouder dan 6 dagen na bevruchting variëren.
Dit protocol biedt handige tools om een enkele onderzoeker in staat te stellen ongeveer ~ 200-300 zebravislarven per uur te injecteren; en resultaten voor de volledige test, met inbegrip van analyse en statistische interpretatie, verkregen in drie weken. We hopen dat dit protocol onderzoekers kan helpen experts te worden in het genereren van zebravis xenografts. Het is niet gemakkelijk; je moet oefenen, maar je komt er wel. Succes!

Zebravis (Danio rerio) ontpopt zich als een krachtig gewerveld modelorganisme om ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Zebravis deelt sterk geconserveerde genetische (~70% genetische homologie en ~84% ziektegerelateerde genen) en fundamentele orgaanmorfologische kenmerken met mensen1,2. Deze conservering maakt het gebruik van zebravissen mogelijk om verschillende menselijke ziekten te modelleren, waaronder kanker3,4.
De behandeling en het onderhoud van zebravissen is veel gemakkelijker en kosteneffectiever dan muizen vanwege hun kleine formaat, hoge vruchtbaarheid het hele jaar door en externe bemesting3,5. Zebravisembryo's hebben geen levende voeding nodig tijdens hun eerste 5-7 dagen van hun leven en zijn gebruikt als een effectief model voor ontwikkeling, infectie en kanker1,4,6,7. Zebravisembryo's komen uit na 48 uur na de bevruchting (hpf) en zijn vrijzwemmende dieren met alle gevormde organen, een kloppend hart en functionele bloedsomloop, lever, hersenen, niermerg, enz.1,3. Ook in dit stadium van ontwikkeling is alleen aangeboren immuniteit in het spel, adaptieve immuniteit ontwikkelt zich nog steeds, waardoor een algemene efficiënte engraftment van menselijke cellen mogelijk is zonder gebruik van immunogecompromitteerde mutanten7,8. Niettemin is het belangrijk op te merken dat niet alle menselijke cellen even9 engraferen en dat bijvoorbeeld voor leukemiecellen is aangetoond dat fagocyten (neutrofielen en macrofagen) moeten worden uitgeput voor efficiënte engraftment10.
De genetische tracteerbaarheid van zebravissen en de optische transparantie van de vroege embryonale stadia maken intravitale beeldvorming met één cel mogelijk met een hoge resolutie en dus voor de vaststelling van state-of-the-art beeldvormingstechnieken op verschillende gebieden van de biologie. Bovendien zijn deze kenmerken in de context van kanker nuttig voor realtime studies van de vroegste stadia van gastheer-tumorinteracties, zoals het bestuderen van angiogene en gemetastaseerde mogelijkheden, evenals interacties met het aangeboren immuunsysteem8,9,11,12,13.
Hoewel er in de korte xenografttest geen tijd is voor gemetastaseerde "evolutie"- is het mogelijk om de gemetastaseerde capaciteit van de tumorcellen te analyseren (d.w.z. hun efficiëntie om gemetastaseerde stappen zoals invasie, intravasatie, overleving in omloop, extravasatie en kolonisatie te doorlopen, en daarom deze processen in vivo en in realtime te bestuderen8,11,13,14).
De kenmerken van zijn levenscyclus plaatsen de zebravis als een uniek model voor gepersonaliseerde geneeskunde bij kanker. Assays kunnen in een kortere tijdspanne worden uitgevoerd en resultaten worden verkregen in een paar weken7,8,9,11,12,15,16. De celeriteit en haalbaarheid van deze onderzoeken bieden artsen en onderzoekers de mogelijkheid om translationele resultaten te verkrijgen die nuttig kunnen zijn voor kankerpatiënten, voor wie tijd een essentiële behoefte is.
Ondanks de toenemende pogingen om succesvolle zebravisembryo xenografts te genereren, is er nog steeds behoefte aan de standaardisatie van de injectieprocedure en de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen en tumorgedrag na injectie.
In dit protocol bieden we onderzoekers een duidelijke en gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor de injectie van menselijke kankercellijnen in zebravisembryo's en daaropvolgende fixatie, immunostaining, beeldvorming en kwantificering van tumorcelgedrag.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

Zebravislarven xenografts worden veel gebruikt voor kankeronderzoek om in vivo en real-time studies naar menselijke kanker uit te voeren. De mogelijkheid om de respons op antikankertherapieën (chemo, radiotherapie en biologicals), angiogenese en metastase met eencellige resolutie snel te visualiseren, plaatst het zebravis xenograftmodel als een topkeuze om preklinische studies te ontwikkelen.

De zebravis larvale xenograft assay biedt verschillende experimentele voordelen in vergelijking met andere modellen, maar waarschijnlijk de meest opvallende is de vermindering van de grootteschaal en bijgevolg de tijd. Deze schaalvermindering maakt beeldvorming met één cel mogelijk, het gebruik van een relatief laag aantal menselijke cellen (compatibel met biopten), geneesmiddelenscreenings met een gemiddelde hoge doorvoer, maar maakt vooral een aanzienlijke vermindering van de tijd van de test mogelijk. Al deze voordelen maken de zebravis xenograft assay uiterst aantrekkelijk voor toekomstige gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen.

Veel zebravis xenograft protocollen zijn ontwikkeld met een grote diversiteit aan menselijke tumoren; een algemeen en gestandaardiseerd protocol om zebravislarvenlarven efficiënt te genereren ontbreekt echter nog steeds. Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenografts te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebravis xenografts worden veel gebruikt voor kankeronderzoek. Je kunt menselijke tumorcellen nemen en injecteren in kleine larven zebravissen, of zelfs in volwassenen. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol van het larvemodel, waar we verschillende menselijke kankermerken bij een levend dier kunnen bestuderen.Je kunt proliferatie bestuderen, je kunt angiogenese bestuderen, je kunt metastase bestuderen, en ook interacties binnen de tumormicro-omgeving. En een groot voordeel is dat je dit in een zeer kort tijdsbestek kunt bestuderen. Slechts vier dagen, bijvoorbeeld.Een ander groot voordeel is dat je dit live kunt bestuderen met een enkele celresolutie, met behulp van een confocale of een lichtbladmicroscoop. Je kunt bestuderen hoe cellen migreren, hoe cellen met elkaar communiceren of zelfs hoe ze met elkaar praten. Het is dus een heel krachtig model om kankerbiologie te bestuderen.Zebravis xenografts kunnen worden gebruikt om de respons op antikankertherapieën te bestuderen, zoals chemotherapie, radiotherapie of zelfs gerichte therapieën met antilichamen. En ten slotte kan dit protocol ook worden aangepast om patiënt-afgeleide cellen uit een chirurgisch monster te gebruiken, of zelfs uit biopten, en vervolgens de zebravisavatars te genereren. Instellen voor injectie.Twee weken voor injectie, breid de cellen uit in cultuur. Begin met overtollige cellen en overtollige vissen totdat je bedreven wordt met de techniek, omdat veel cellen en vissen verloren gaan tijdens de training. Tabel één van de bijbehorende PDF bevat een gedetailleerde gids met de optimale percentages in-vitro samenvloeiing voor injectie van verschillende cellijnen.Steek drie dagen voor de injectie de zebravis van de gewenste achtergrond over. 24 uur voor injectie. Maak de zebravis embryoplaten schoon.Gooi alle dode en niet-ontwikkelde embryo's weg en ververs het E3-medium. Gooi in de celkweekkamer het celkweekmedium weg. Was eenmaal met PBS 1X om de dode cellen te verwijderen en vers medium toe te voegen.Bereid de hulpmiddelen voor de injectieprocedure voor, zoals micro-injectienaalden, agaroseplaten en haarspelden om de embryo's uit te lijnen voor injectie. Giet voor de plaatvoorbereiding een laag opgeloste 2% agarose in het deksel van een schone petrischaal. Laat het polymeriseren en maak met behulp van een liniaal drie tot vier rechte agaroselijnen voor de uitlijning van de embryo's.Injectiedag. Scheid de uitgebroede embryo's van onbeschadigde eieren. Het toevoegen van Pronase aan het embryomedium in dit stadium kan het uitkomen stimuleren.Plaats de embryo's in de incubator bij 28 graden Celsius tot injectie. Celetikettering voor injectie. Om te helpen bij het opzetten van een reproduceerbare celetiketteringstechniek, raadpleegt u de tabellen één en twee van het geschreven protocol voor een compilatie van een lijst met cellijnen en verschillende labeloplossingen.Verwijder het celkweekmedium en was de kolf tweemaal met PBS 1X. Label de cellen met een lipofiele kleurstof, vermijd blootstelling aan licht en incubeer de kolf op 37 graden. U kunt er ook voor kiezen om de cellen bij ontkoppeling in een microcentrifugebuis van 1,5 ml te labelen.Verwijder de celetiketteringsoplossing en was de cellen met PBS 1X om de overtollige kleurstof eruit te halen. Voeg het overeenkomstige ontkoppelingsmiddel toe en incubeer de cellen op 37 graden Celsius. Vergemakkelijkt het losmaken door de kolf te borstelen met een steriele celschraper en de cellen te verzamelen met een serologische pipet.Breng de cellen over in 1,5 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer. Gooi supernatant weg en hang de pellet opnieuw op met celkweekmedium. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van een Neubauer-kamer met trypanblauwe uitsluiting of een andere keuzemethode.Centrifugeer en s hang de cellen in het injectiemedium opnieuw op. De aanbevolen concentraties cellen in medium zijn te vinden in tabel één van het manuscript. Vanaf dit punt moeten de cellen op ijs worden gehouden.Injectieprocedures. Verdoof de embryo's gedurende 5 minuten in tricaine 1X. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid verdoofde embryo's over naar een agaroseplaat en lijn ze uit met behulp van een haarspeldlus.Zorg ervoor dat u afstand houdt tussen de embryo's. Vooral tussen de dooier van de ene en de kop van de volgende. Om sterfte te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de uitgelijnde embryo's niet uitdrogen in de agaroseplaat door voorzichtig één tot drie druppels tricaïne 1X-oplossing aan de plaat toe te voegen.Tik lichtjes op de microcentrifugebuis om de cellen opnieuw op te schorten. Laad de injectienaald terug met een celsuspensie met behulp van een Microloader-tip, waarbij luchtbellen worden vermeden, omdat ze de integriteit van de embryo's in gevaar kunnen brengen. Open de luchtdrukklep, zet de micro-injector op en plaats de micro-injectienaald voorzichtig in de houder.Snijd de micro-injectienaald dicht bij de punt. Doorboor voorzichtig de dooier van het embryo, laat de hoek van de naald zakken en duw voorzichtig totdat de punt van de naald de perivitelline-ruimte bereikt. Zodra de punt zich in de perivitellineruimte bevindt, injecteert u de cellen.Probeer een volume cellen te injecteren dat vergelijkbaar is met de grootte van het oog van het embryo, en zo ver mogelijk van het hart om hartoedeem te voorkomen. Pas indien nodig de micro-injectordruk aan. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een schone petrischaal met tricaïne 1X-oplossing en laat ze vijf tot tien minuten rusten.Dit geeft de wond de tijd om te sluiten. Verwijder de tricaine 1X-oplossing en voeg een vers E3-medium toe. Incubeer vervolgens de embryo's op 34 graden Celsius.Deze temperatuur zal het overleven van zowel de zebravisembryo's als de menselijke tumorcellen mogelijk maken. Gemetastaseerde test. Als u het gemetastaseerde potentieel van uw cellijnen wilt bestuderen, screent u de geïnjecteerde embryo's rond een uur na de injectie op een fluorescentiesterioscoop en sorteert u ze in twee groepen op basis van de afwezigheid of aanwezigheid van kankercellen in omloop.Een dag na de injectie. Analyseer op een fluorescentiesteremboscoop zorgvuldig elk embryo en selecteer degenen met correct geïnjecteerde tumoren. Sorteer de geselecteerde xenograften op basis van de tumorgrootte.Gebruik de grootte van het oog voor vergelijking. Gooi embryo's met abnormale morfologie, hart- of dooieroedeem, xenograften met zeer weinig kankercellen of embryo's met kankercellen alleen in de dooier weg. Verdeel de xenografts volgens de gewenste experimentele lay-out en start de medicijntest.Vervang de medicijnen en het E3-medium dagelijks. Incubeer de xenograften en handhaaf de temperatuur van 34 graden Celsius tot het einde van de test. Vier dagen na de injectie.Verdoof de xenografts op de laatste dag van de test met tricaine 1X-oplossing en lijn ze voorzichtig uit op de agarplaat. Gooi dode of gezwollen xenograften weg. Deze xenograften worden niet in aanmerking genomen voor kwantificering van engraftment.Analyseer op een fluorescentiestereoroscoop zorgvuldig elk xenograft en beoordeel de afwezigheid of aanwezigheid van tumoren in de perivitellineruimte. Volgens de experimentele opstelling selecteert u de xenograften van belang en euthanaseert u ze met tricaine 25X. Bevestig ze in 4% formaldehyde gedurende ten minste 4 uur bij kamertemperatuur om door te gaan met immunostaining.Bewaar anders 's nachts bij vier graden Celsius en vervang formaldehyde de volgende dag door 100% methanol. Xenografts gefixeerd in 100% methanol kunnen voor onbepaalde tijd op 20 graden worden bewaard. Hele mount immunostaining voor confocale beeldvorming.De hele mount immunofluorescentie techniek duurt drie dagen, als volgt verdeeld. De eerste dag is voor permeabilisatie van de xenograften en primaire antilichaam incubatie. De tweede dag, voor wassen en secundaire antilichaam incubatie.En de derde dag, voor wassen, fixeren van xenografts en opslag in het montagemedium. Meer details over deze procedure zijn te vinden in de bijbehorende PDF. Montage van xenografts.Sluit de randen van een afdekstrip af met vaseline of siliconenvet, zodat het montagemedium niet lekt. Breng de xenografts met behulp van een Pasteur pipet over op de afdekstrip. Lijn ze voorzichtig uit met een haarspeld.Voeg het montagemedium toe aan een andere afdekstrip. Sluit beide afdekslips voorzichtig aan en plaats ze bovenop een microscoopschuif om gemakkelijker te kunnen manipuleren. Confocale beeldvorming.Een apochromatische 25X immersie objectieve lens met watercorrectie is optimaal voor beeldvormende tumoren met een enkele celresolutie. Verkrijg de monsters met behulp van de Z-Stack-functie met een interval van vijf micron tussen elk segment. Open de onbewerkte gegevens in Fiji-software.Selecteer drie representatieve segmenten van de tumor van boven, midden en onder, per z-stack, per xenograft. Open de Cell Counter plugin van Fiji software. Klik in het gereedschap Celteller op Initialiseren, selecteer een tellertype en klik op de afbeelding om de telmodus handmatig te starten.Voor elke klik vraagt de teller hoeveel cellen worden geteld. Gebruik de volgende formule om het totale aantal cellen in de tumor te verkrijgen. Om de totale aantallen of het percentage markers te beoordelen, zoals immuuncellen, mitotische figuren, geactiveerde caspase, onder andere, kwantificeer handmatig de cellen die positief zijn voor de specifieke etikettering, marker of transgene van belang langs alle segmenten van de z-stack met de Cell Counter plugin.Houd er rekening mee dat sommige cellen zich tussen twee segmenten bevinden. Ga heen en weer in de z-stack om er zeker van te zijn dat er geen cel twee keer wordt geteld. Representatieve resultaten.HCT 116 colorectale kankercellijn xenografts werden gegenereerd zoals beschreven in het protocol. Xenograften werden willekeurig verdeeld in niet-behandelde controles en FOLFIRI-chemotherapie. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om apoptotische cellen te detecteren, met behulp van anti-gespleten caspase-3 antilichaam en DAPI voor nucleïne tegenstaining.Kwantificering van de mitotische index, apoptose en tumorgrootte, onthulde dat FOLFIRI een significante afname van mitose en een significante inductie van apoptose induceert, vergezeld van een vermindering van de tumorgrootte met 54%. Deze functies zijn nuttig in fenotypische geneesmiddelenschermen met hoge doorvoer, evenals om de intrinsieke en fysiologische effecten van verschillende kankerbehandelingen in een kort tijdsbestek te testen. Een ander groot voordeel van het zebravis xenograft model is dat het mogelijk is om de interacties van verschillende tumorcellen te bestuderen en te analyseren hoe elk type cel het gedrag van de ander kan beïnvloeden.Verschillende menselijke kankercellen, verschillende klonen van dezelfde tumor, of van verschillende tumoren, kunnen worden meege injecteerd. In dit voorbeeld werden twee colorectale kankercellijnen afgeleid van dezelfde patiënt gelabeld met verschillende lipofiele kleurstoffen en gemengd in een verhouding van één-op-één voor injectie. We hopen dat dit protocol onderzoekers kan helpen echte experts te worden in het genereren van zebravis xenografts.Het is niet makkelijk. Je moet oefenen, oefenen. Geef niet op.Ik weet zeker dat je er wel komt. Succes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo beeldvorming en Kwantatie van de gastheer Angiogenic respons in zebravis tumor xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...