Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

אנו מודים לקרן Champalimaud, קונג'נטו (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, במימון משותף של FCT/Lisboa2020) למימון. מלגות FCT לסמנכ"ל (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). כל חברי מעבדת פיור לדיונים קריטיים; ב. קוסטה ו- C. רבלו דה אלמיידה לשיתוף נתונים; וחברי המעבדה שלנו C. רבלו דה אלמיידה, מ ' בארוסו ול. לייטה על השתתפותם בסרטון. ברצוננו להודות למתקן הדגים CF (C. Certal, J. Monteiro et al) ולצוות התקשורת, האירועים והסיוע של Champalimaud במיוחד לאלכסנדר אזינהירה על עשיית הסרטים הפנטסטיים ולקתרינה ראמוס ותרזה פרננדס על עזרתם.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

החשיבות הגוברת של דג הזברה כמודל להתפתחות סרטן והקרנת תרופות הביאה לפרסומים רבים3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. עם זאת, הזרקת תאים סרטניים בעוברים זברה הוא טכניקה הדורשת רמה גבוהה של דרגה אשר יכול להיות מאתגר עבור החוקרים. בפרוטוקול זה אנו שואפים לספק מידע מעשי וכמה טיפים שיכולים לעזור להתגבר על האתגרים הראשוניים של הגדרת קסנוגרפטים עובר זברה.
טיפול בתאים לפני הזרקה זה פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור של קסנוגרפטים זברה עם קווי תאים ניתן להתאים סוגים שונים של (סרטן) תאים עם morphologies שונים. אנו ממליצים כי כל קווי התא המשמשים קסנוגרפטים זברה-פיש הם ללא mycoplasma. שלא כמו זיהומים חיידקיים אחרים, נוכחות של mycoplasma בתרבית התא אינו יוצר שינויים שניתן לזהות בקלות תחת מיקרוסקופ22. זיהום Mycoplasma עשוי להשפיע על פוטנציאל החריטה של קווי התא, הרגישות שלהם לסמים, כמו גם את הכדאיות של עוברי זברה.
למרות שהתאים עשויים להמשיך להתרבות לתקופה ממושכת, הפנוטיפ והגנוטיפ שלהם עשויים להיות מועדים לשינויים. חשוב להכיר את המורפולוגיה וההתנהגות של קווי התאים בתרבות. אנו ממליצים לשמור על מספר מעברי התא לאחר הפשרה בין 3-12 כדי לקבל תוצאות לשחזור. לכן, בדיקות mycoplasma רגיל צריך להתבצע.
תאים צריכים להיות בשלב יומן הרישום שלהם (שלב צמיחה מעריכי לפני הגעה להתכנסות ~ 70%) ביום ההזרקה. זה יאפשר חריטה נאותה ופיתוח נאות של סימני ההיכר הייחודיים של הגידול. כדי למנוע וריאציה של פנוטיפ של תאים בתוך xenograft, זה קריטי כדי לשמור על המפגש עבור קבוע הזרקה בין ניסויים. מספר התאים מוזרקים יכול להיות מותאם למאפיינים של כל קו תאים כמו כמה עשויים לדרוש צפיפויות גבוהות יותר של הזרקה על מנת לשגשג בעוברים זברה.
שיקולי תיוג תאים כדי לדמיין טוב יותר תאים סרטניים אנושיים להזרקה וניתוח עתידי, תאים סרטניים יכולים להיות מסומנים עם צבעים פלואורסצנטיים. בשל הבדלים בגודל התא, המספר הכולל של תאים / ס"מ 2 בתרביות חסידים משתנהבין קווי התא. זה ישפיע על היעילות של פרוטוקול הכתם, כמו גם את מספר התאים שנקטפו להזרקה. תאים גדולים המניבים מספרים נמוכים לכל בקבוקון (כלומר, Hs578T) או גדלים באשכולות (כלומר, BFTC905) ידרשו איגום של מספר בקבוקונים לניסוי יחיד. במקרה זה, הכתמת תאים לא צריך להתבצע ישירות בבקבוק כמו זה יגרום לשימוש בכמויות מוגזמות של צבע (עלות גבוהה). מצד שני, תאים רגישים מאוד מחזורים מוגזמים של צנטריפוגה, כמו גם אלה המניבים מספרים גבוהים לכל בקבוק (כלומר, HCT116) יכול להיות מוכתם ישירות בבקבוק ולאחר מכן מנותק עם מגרד EDTA / תא (לקבלת מידע נוסף ראה טבלה 1).
במידת האפשר, במקום להשתמש בגישה אנזימטית, להשתמש EDTA כדי לנתק את התאים ביום ההזרקה, כך תאים לשחזר צמתים התא שלהם במהירות רבה יותר והם נתונים פחות צעדי צנטריפוגה. עם זאת, אם התאים רגישים EDTA, מאוד חסידים או לגדול באשכולות - שיטה אנזימטית ניתן ליישם. אופטימיזציה של הריכוז האידיאלי להזרקה, כמו גם את מדיום ההזרקה תלוי במאפיינים של כל קו תא, ולכן זה עשוי להזדקק כמה התאמות (טבלה 1).
כיול מיקרו-שינג בניגוד למסירת אוליגונוקלאוטידים או סמים לעובר זברה, גרטיקולה אינה משמשת לכיול המחט בעת עבודה עם קווי תאים עבור קסנוגרפטים. לאחר זמן מה במהלך ההזרקה, התאים יתחילו לסתום, ויש צורך לחתוך את קצה המחט כדי להגדיל את קוטרו או לשנות את המחט לגמרי. הליך זה מעכב את כיול הגרטיקולה.
כדי לטפל בבעיה זו, מספר התאים שניתנו מוסדר על ידי לחץ נפלט וזמן הדרוש כדי להגיע לגודל דומה לעין העובר בתוך 1-3 פולסים. לאחר מכן, כדי לשלוט עוד יותר בגודל הגידול, ב- 1 dpi, קסנוגרפטים ממוינים לפי גודל הגידול כפי שמוצג באיור 6 B-B". כפי המיוצג בדוגמה של איור 6C, שיטת מיון זו יעילה בהפחתת הווריאציה של גדלי הגידול: אם אנו אוגדים את כולם יחד (+, ++, ++) STEV הוא ~ כפול מהמחלקה ++(~ 906 תאים ~ 422 תאים) והווריאציה המקדם היא ~ 31.9% לעומת 14,5% במחלקה ++. מאז ההפניה להזרקה היא נפח, המספר הכולל של תאים משתנה הרבה בין סוגי תאים - להיות תלוי בגודל ובצורה של התאים. לדוגמה, תאים גדולים עם הרבה ציטופלסמה כמו סרטן השד Hs578T, לייצר גידולים קטנים בהרבה (~ 600 תאים). כמו כן, כל קו תא דורש מספר תאים שונה. לדוגמה, קווי התאים סרטניים שלפוחית השתן HT29 CRC ו- RT112 הראו כי ככל שמספר התאים שהוזרקו גבוה יותר, כך התמותה של דגי הזברה גבוהה יותר. לכן, תקופה של אופטימיזציה בעת פיתוח xenografts יש צורך לבדוק אם קו התא יש השפעות רעילות בעובר או דורש צפיפויות גבוהות / נמוכות יותר של הזרקה.
אתר הזרקה אחד הפערים הנפוצים ביותר בעת יצירת קסנוגרפטים עובר זברה הוא אתר ההזרקה. החלמון הוא בדרך כלל מקום הבחירה להזרקה בשל הנגישות הקלה שלה. עם זאת, ראינו כי תאים מוזרקים חלמון יש נטייה גבוהה יותר למות. למרות שטכנית קשה יותר, אנו ממליצים להזריק ב- PVS וככל האפשר מהלב. בתוך PVS, תאים יכולים לצבור, לגייס כלי דם ותאי חיסון, ולהגר, intravasate, אקסטרווסטזיס וליצור micrometastasis, אם הם מציגים מאפיינים גרורתיים8,11.
יעילות חריטה הבדלים ביעילות החריטה וגודל הגידול בין קווי תאים ב 4 dpi צפויים בשל דרגות ברורות של מוות תאים בסיסיים / הישרדות / התפשטות, אלא גם בשל האימונוגניות המולדת כי כל קו תא עשוי להציג9.
גרורה גרורות כוללות מפל רב-שלבי של אירועים שניתן לחלק לשני שלבים שרירותיים. בשלב הראשון, תאים סרטניים צריכים להתנתק מהאתר הראשי, לנדוד ולפלוש לרקמות סמוכות ולאחר מכן להיכנס למחזור הדם. בשלב השני, תאים סרטניים חייבים לשרוד במחזור הדם, פזרן מן הדם או כלי הלימפה, ולבסוף להתיישב באתרים משניים23. כדי להבחין בין אירועים מוקדמים ומאוחרים אלה ולטפל בפוטנציאל/בקיאות של תאי הגידול השונים לביצוע שלבים אלה, עיצבנו בדיקה פשוטה.
באופן כללי, כאשר מוזרק לתוך PVS, תאים סרטניים יכולים להיכנס ישירות למחזור ולאחר מכן להילכד פיזית ברקמה hematopoietic caudal (CHT) (אזור הזנב). עם זאת, על פי המאפיינים של כל תא גידול - ראינו כי כמה תאים סרטניים להישאר ב CHT 4 dpi והם מסוגלים ליצור micrometastasis בעוד תאים סרטניים אחרים נעלמים (פינה לאחר שנתפס CHT).
לכן, על ידי השוואת יעילות micrometastasis (ב 4 dpi) כאשר התאים הונחו ישירות לתוך זרימת הדם - CIRC (תאים רק צריך לעבור את השלבים המאוחרים של גרורות) לעומת כאשר לא - אין CIRC (תאים צריכים לעבור צעדים מוקדמים ומאוחרים כדי להיות מסוגל ליצור micrometastasis) אנו יכולים להעריך את הפוטנציאל גרורתי מוקדם או מאוחר שלהם. ראינו תאים סרטניים שיכולים ליצור ביעילות micrometastasis ב- CHT בשתי הקבוצות (CIRC ו- NO CIRC), מה שמרמז כי תאים אלה יש את היכולת לעבור את כל השלבים של מפל גרורתי (SW480 ו MDA-MB-468 למשל)8,11. לעומת זאת, לתאי גידול אחרים יש פוטנציאל גרורתי נמוך מאוד בשתי הקבוצות, כמעט אף פעם לא עושה micrometastasis, גם כאשר מוזרק למחזור (כלומר, גלוי CHT ב 24 hpi, אבל ב 4 dpi הם כבר לא שם, Hs578T למשל)8. עם זאת, מצאנו בבירור קבוצה אחרת - אחת כי הוא מסוגל רק ליצור micrometastasis כאשר מוזרק לתוך זרימת הדם (אנחנו יכולים רק לצפות micrometastasis בקבוצה CIRC). זה מרמז כי תאים אלה יש יעילות נמוכה בביצוע השלבים הראשונים של מפל גרורתי אבל מצד שני מסוגלים לשרוד במחזור, אקסטרווסייט ליישב אתר מרוחק.
חיסון והדמיה לפני הקיבעון, פרוטוקול הזרקה זה יכול לשמש עבור גישות הדמיה חיה אחרות כמו מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית חיה (DIC), מיקרוסקופיה של דיסק מסתובב, הדמיה קונפוקלית חיה ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופיית יריעות אור וכו '.
תאים מתים ופסולת תאית מופיעים בהירים כאשר הם נצפים דרך הסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי וניתן לטעות בהם לגבי תאים חיים, במיוחד אם מטרת המחקר היא להעריך את הפוטנציאל גרורתי של קווי התאים. ברצוננו להדגיש את החשיבות של ביצוע הדמיה confocal עם סמני כדאיות ספציפיים DAPI כדי להעריך את מצב ההישרדות של הגידול micrometastasis. כמו כן, זה היסוד להשתמש בנוגדנים אנושיים ספציפיים כדי לזהות תאים אנושיים כגון מיטוכונדריה אנטי אנושית או HLA אנטי אנושי. בעת יישום הפרוטוקול, לאמן את עיני הניסוי על ידי השוואת הכתמים בסטריומיקרוסקופ עם תמונות confocal. לאחר זמן מה, ניסויים יכולים להבחין בבירור בין פסולת לתאים חיים בסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
למרות ששיטות אחרות לכימות נטל הגידול כגון אזור פלואורסצנטי שלם נמצאות בשימוש נרחב, אנו ממליצים לבצע הדמיה חיסונית ו confocal הר שלם כשיטה מדויקת יותר. לא רק היעילות של כתמי צבע lipophilic משתנה מאוד (כלומר, תאים מסוימים מוכתמים היטב ואילו אחרים אינם - כנראה בשל התוכן השומנים של הממברנות שלהם), אלא גם פעמים רבות צבעים ליפופילי טופס אגרגטים, ותאים מתים נוטים להיות בהירים יותר - יצירת מספר חפצים שניתן לטעות עבור תאים חיים.
תאים יכולים להיות transduced עם חלבונים פלואורסצנטיים כדי לסייע במעקב שלהם לדלג על תיוג התא. עם זאת, ודא כי תאים transduced ולא transduced לייצר את אותן תוצאות קסנוגרפטים זברה.
בנוסף, מקרופאגים יכולים phagocyte אלה פסולת תא פלואורסצנטי הופך פלואורסצנטי שכותרתו נודד, יצירת תאים גרורתיים חיוביים כוזבים. לכן, אנו ממליצים על סדרה של כלים אנליטיים, אשר כמובן ניתן להרחיב קריאות רבות אחרות לפרשנות מדויקת יותר של התנהגות הגידול:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
התפשטות - כימות של דמויות מיטוטיות עם DAPI או נוגדן נגד pHH3Ser10 (מרק מיליפור חתול. #06-570),</li>
	<li>
מוות תאי על ידי אפופטוזיס- נוגדן נגד מופעל Caspase3Asp175 (תא איתות טכנולוגיות חתול. #9661) או שווה ערך,</li>
	<li>
גודל הגידול - ספירת DAPI - תאים סרטניים אנושיים מראים ארגון כרומטין מובהק מאוד, כך שהם נבדלים בקלות מתאי הזברה ותמיד ניתן לבדוק שוב עם הצבע (כאשר אתה מאמן את העין שלך),</li>
	<li>
עבור מחקרים גרורתיים, כדי לזהות באופן חד משמעי תאים אנושיים, - HLA אנטי אנושי (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), המיטוכונדריה האנטי אנושית (מרק מיליפור חתול. #MAB1273- שיבוט 113-1).</li>
</ul>עבור רכישה confocal עם מרווח של 5 מיקרומטר בין פרוסות מחסנית Z של תאי סרטן הבקרה HCT116 (גודל גרעיני ממוצע של 10-12 מיקרומטר קוטר) עם DAPI counterstaining, ראינו כי ~ 50% מהתאים משותפים בין שתי פרוסות רצופות. לכן, אם כל פרוסה נספרת, קיים סיכון גבוה לספירת אותם תאים פעמיים. הולך הלוך ושוב בין פרוסות כדי למנוע בעיות כימות תוצאות טכניקה זמן רב שגיאה נוטה. כדי להקל על הכימות של המספר הכולל של תאים ולאפשר רבייה רבה יותר בין החוקרים, יצרנו את הנוסחה גודל הגידול שתוארה בעבר בפרוטוקול זה8.
כללנו מספר תיקון (1.5) כדי להסביר את התאים ~ 50% המשותפים בין פרוסות. מצאנו כי השגיאה הממוצעת של ספירה ידנית של הגידול כולו בין החוקרים הייתה 20%. שני חוקרים שהשתמשו בנוסחה היו 2% שגיאה. השימוש בנוסחה זו הוא בעל שיעור דיוק של 93% ושיעור רבייה של 98%. בדקנו גם שיטות אוטומטיות, אך הן הדגימו שגיאה הגבוהה מ- 50% הנגרמת על-ידי הגדרות סף.
בשל המאפיינים של תאים אפופטוטיים, הכימות של תאי Caspase מופעל 3 קשה יותר. כדי להפחית את מספר הטעויות ואת השונות בתוצאות, אנו ממליצים כי דגימות הבקרה והניסוי נספרים על ידי אותו חוקר. בנוסף, כאשר לומדים טכניקה זו, חוקר חדש חייב לספור תמונות שכבר כימתו על ידי חוקרים מנוסים יותר כדי להשוות תוצאות ולהתאמן.
ניתן להאריך את אורך ההסתעפות במידת הצורך. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי זחלים זברה דורשים האכלה חיה החל ~ 7 ימים לאחר ההפריה (5 ימים לאחר הזרקה). בנוסף, ההנחיות והתקנות לרווחת בעלי חיים החלות על זחלים מעל גיל 6 ימים לאחר ההפריה עשויות להשתנות.
פרוטוקול זה מספק כלים שימושיים כדי לאפשר לחוקר יחיד להזריק כ ~ 200-300 זחלי זברה לשעה; ותוצאות לבדיקה המלאה, כולל ניתוח ופרשנות סטטיסטית, המתקבלות בשלושה שבועות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יכול לעזור לחוקרים להיות מומחים ביצירת קסנוגרפטים זברה. זה לא קל; אתה צריך להתאמן אבל תגיע לשם. בהצלחה!

זברהפיש (דניו ריו) מתגלה כאורגניזם מודל בעל חוליות רב עוצמה לחקר התפתחות ומחלות. זברה-פיש חולקת תכונות גנטיות שמורות מאוד (כ-70% הומולוגיה גנטית ו-84% גנים הקשורים למחלות) ותכונות מורפולוגיות בסיסיות של איברים עם בני אדם1,2. שימור זה מאפשר שימוש בזברהפיש כדי לדגמן מספר מחלות אנושיות, כולל סרטן3,4.
הטיפול והתחזוקה של דגי זברה הוא הרבה יותר קל וחסכוני יותר מאשר עכברים בשל גודלם הקטן, פוריות גבוהה כל השנה והפריה חיצונית3,5. עוברי זברה אינם דורשים האכלה חיה במהלך 5-7 הימים הראשונים לחייהם ושימשו כמודל יעיל להתפתחות, זיהום וסרטן1,4,6,7. עוברי זברה בוקעים במהירות של 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) והם בעלי חיים שוחים חופשיים עם כל האיברים שנוצרו, לב פועם ומערכת דם תפקודית, כבד, מוח, מוח כליות וכו'1,3. כמו כן, בשלב זה של התפתחות רק חסינות מולדת היא במשחק, חסינות אדפטיבית עדיין מתפתחת, המאפשר תחריט יעיל כללי של תאים אנושיים ללא צורך בשימוש במוטנטים immunocompromised7,8. עם זאת, חשוב לציין כי לא כל התאים האנושיים לחרוט באופן שווה9 וכי, למשל, עבור תאי לוקמיה הוכח כי phagocytes (נויטרופילים ומקפאגים) צריך להיות מדולדל עבור תחריט יעיל10.
המתיחה הגנטית של דג הזברה והשקיפות האופטית של שלבי העובר המוקדמים שלה מאפשרים הדמיה תוך-חיים של תא יחיד ברזולוציה גבוהה ובכך, להקמת טכניקות הדמיה מתקדמות בתחומים מגוונים של ביולוגיה. יתר על כן, בהקשר של סרטן, תכונות אלה שימושיות למחקרים בזמן אמת של השלבים המוקדמים ביותר של אינטראקציות מארח-גידול, כמו לימוד פוטנציאל אנגיוגני גרורתי, כמו גם אינטראקציות עם המערכת החיסונית המולדת8,9,11,12,13.
אמנם במבחן קסנוגרפט קצר אין זמן "אבולוציה" גרורתית - ניתן לנתח את היכולת גרורתית של תאי הגידול (כלומר, היעילות שלהם לעבור צעדים גרורתיים כמו פלישה, intravasation, הישרדות במחזור, פזרנות, קולוניזציה, ולכן ללמוד תהליכים אלה vivo ובזמן אמת8,11,13,14).
מאפייני מחזור החיים שלו מציבים את הזברה-פיש כמודל ייחודי לרפואה מותאמת אישית בסרטן. מבחנים יכולים להתבצע בפרק זמן קצר יותר ותוצאות המתקבלות בכמה שבועות7,8,9,11,12,15,16. הסלריות וההיתכנות של מבחנים אלה מספקים לרופאים ולחוקרים את האפשרות להשיג תוצאות תרגום שיכולות להיות שימושיות לחולי סרטן, שעבורם הזמן הוא צורך חיוני.
למרות הניסיונות הגוברים לייצר קסנוגרפטים מוצלחים לעובר זברה, עדיין יש צורך בתקינה של הליך ההזרקה, כמו גם בהערכת הכדאיות של התא והתנהגות הגידול לאחר ההזרקה.
בפרוטוקול זה אנו מספקים לחוקרים מדריך ברור ומפורט צעד אחר צעד להזרקת קווי תאים סרטניים אנושיים בעוברים של דגי זברה וקיבעון, חיסוני, הדמיה וכימות של התנהגות תאי הגידול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

זברות זברה קסנוגרפטים נמצאים בשימוש נרחב לחקר הסרטן לבצע vivo ומחקרים בזמן אמת של סרטן האדם. האפשרות לדמיין במהירות את התגובה לטיפולים אנטי סרטניים (כימותרפיה, הקרנות וביולוגיות), אנגיוגנזה וגרורות ברזולוציה של תא יחיד, מציבה את מודל קסנוגרפט זברה-דג כבחירה עליונה לפתח מחקרים פרה-קוליניים.

זברת הזברה xenograft assay מציג מספר יתרונות ניסיוניים בהשוואה לדגמים אחרים, אבל כנראה הבולט ביותר הוא הפחתת סולם גודל וכתוצאה מכך זמן. הפחתה זו של קנה המידה מאפשרת הדמיה של תא יחיד, שימוש במספר נמוך יחסית של תאים אנושיים (תואמים לביופסיות), הקרנות סמים בעלות תפוקה בינונית-גבוהה, אך הכי חשוב מאפשרת הפחתה משמעותית של זמן הבדיקה. כל היתרונות הללו הופכים את מבחני הקסנוגרפט של דגי הזברה לאטרקטיביים ביותר עבור יישומי רפואה מותאמים אישית עתידיים.

פרוטוקולי קסנוגרפט רבים של דגי זברה פותחו עם מגוון רחב של גידולים אנושיים; עם זאת, פרוטוקול כללי ומתוקנן כדי ליצור ביעילות זברה זחל זנגוגרפטים עדיין חסר. כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסונות בכל ההר, וכימות הדמיה confocal.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

קסנוגרפטים של דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב לחקר הסרטן. אתה יכול לקחת תאים סרטניים אנושיים ולהזריק אותו זברה קטנה, או אפילו למבוגרים. כאן, מה שאנו מציגים הוא פרוטוקול צעד אחר צעד של מודל הזחל, שבו אנו יכולים לחקור כמה סימני ההיכר של סרטן האדם בבעל חיים.אתה יכול ללמוד התפשטות, אתה יכול ללמוד אנגיוגנזה, אתה יכול ללמוד גרורות, וגם אינטראקציות בתוך microenvironment הגידול. ויתרון גדול הוא שאתה יכול ללמוד את זה בתוך מסגרת זמן קצרה מאוד. רק ארבעה ימים, למשל.יתרון גדול נוסף הוא שאתה יכול ללמוד את זה לחיות עם רזולוציה של תא יחיד, באמצעות confocal או מיקרוסקופ גיליון אור. אתה יכול ללמוד איך תאים נודדים, איך תאים אינטראקציה אחד עם השני, או אפילו איך הם מדברים אחד עם השני. אז זה מודל מאוד חזק ללמוד ביולוגיה של סרטן.ניתן להשתמש בקסנוגרפטים של דגי זברה כדי ללמוד תגובה לטיפולים אנטי סרטניים, כגון כימותרפיה, הקרנות או אפילו טיפולים ממוקדים עם נוגדנים. ולבסוף, גם, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לשימוש בתאים שמקורם בחולה מדגם כירורגי, או אפילו מביופסיות, ולאחר מכן ליצור את אווטרים זברה. מתכוננים להזרקה.שבועיים לפני ההזרקה, להרחיב את התאים בתרבות. התחל עם תאים עודפים ודגים עודפים עד להיות בקיא עם הטכניקה, שכן תאים ודגים רבים יאבדו במהלך האימון. טבלה אחת של PDF הנלווה יש מדריך מפורט של האחוזים האופטימליים של מפגש במבחנה להזרקה של מספר קווי תאים.שלושה ימים לפני ההזרקה, לחצות את הזברה של הרקע הרצוי. 24 שעות לפני ההזרקה. נקו את צלחות העובר של דג הזברה.השלך את כל העוברים המתים והלא מפותחים ורענן את המדיום E3. בחדר תרבות התאים, השלך את מדיום תרבות התאים. יש לשטוף פעם אחת עם PBS 1X כדי להסיר את התאים המתים ולהוסיף מדיום טרי.הכן את הכלים להליך ההזרקה, כגון מחטי microinjection, צלחות agarose, סיכות ראש כדי ליישר את העוברים להזרקה. להכנת הצלחת, יוצקים שכבה אחת של מומס 2% agarose במכסה של צלחת פטרי נקייה. תן לו polymerize ובעזרת סרגל, לעשות שלושה עד ארבעה קווים agarose ישר עבור היישור של העוברים.יום ההזרקה. הפרד את העוברים שבקעו מביצים ללא מים. הוספת Pronase למדיום העובר בשלב זה יכול להגביר את הבקיעה.מניחים את העוברים באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס עד ההזרקה. תיוג תאים להזרקה. כדי לסייע בהקמת טכניקת תיוג תאים הניתנת לשחזור, בדוק טבלאות אחת ושתיים של הפרוטוקול הכתוב עבור קומפילציה של רשימה של שורות תאים ומספר פתרונות תיוג.הסר את מדיום תרבות התא ולשטוף את הבקבוק פעמיים עם PBS 1X. תווית התאים עם צבע ליפופילי, הימנעות מחשיפה לאור, ולדגור את הבקבוק ב 37 מעלות. אתה יכול גם לבחור תווית התאים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל על ניתוק.הסר את פתרון תיוג התא ולשטוף את התאים עם PBS 1X כדי להוציא את הצבע העודף. הוסף את סוכן הניתוק המתאים, והדגיר את התאים ב- 37 מעלות צלזיוס. להקל על תהליך הניתוק על ידי צחצוח הבקבוק עם מגרד תא סטרילי ולאסוף את התאים עם פיפטה סרולוגית.מעבירים את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה. להשליך supernatant ולהשעות מחדש את גלולה עם מדיום תרבות התא. כימת את הכדאיות של התא באמצעות תא Neubauer עם הדרה כחולה trypan או שיטה אחרת של בחירה.צנטריפוגה להשעות מחדש את התאים במדיום ההזרקה. את הריכוזים המומלצים של תאים במדיום ניתן למצוא בטבלה אחת מכתבי היד. מנקודה זו ואילך, התאים חייבים להישמר על קרח.הליכי הזרקה. יש למרדים את העוברים בטרישקאין 1X למשך 5 דקות. לאחר מכן, להעביר כמות קטנה של עוברים מורדמים לצלחת agarose וליישר אותם בעזרת לולאת סיכת ראש.הקפד לשמור על מרחק בין העוברים. במיוחד בין החלמון של אחד וראשו של הבא. כדי למנוע תמותה, ודא כי העוברים המיושרים אינם מתייבשים בצלחת agarose על ידי הוספת בזהירות אחת עד שלוש טיפות של פתרון 1X tricaine לצלחת.הקש קלות על צינור המיקרוצנטריפוגה כדי להשעות מחדש את התאים. טען את מחט ההזרקה עם השעיית תא באמצעות קצה Microloader, הימנעות בועות אוויר, כפי שהם יכולים לסכן את שלמות העוברים. פתח את שסתום לחץ האוויר, להגדיר את microinjector, בזהירות למקם את מחט microinjection לתוך המחזיק.חותכים את מחט microinjection קרוב לקצה. בזהירות לנקב את החלמון של העובר, להוריד את הזווית של המחט בזהירות דוחף עד קצה המחט מגיע לחלל perivitelline. ברגע הקצה הוא בחלל perivitelline, להזריק את התאים.נסו להזריק נפח של תאים דומים לגודל העין של העובר, וככל האפשר מהלב כדי למנוע בצקת לב. כוונן את לחץ המיקרו-אינג'קטור, במידת הצורך. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי נקייה עם פתרון 1X של טריקאין ומשאירים אותם לנוח במשך חמש עד 10 דקות.זה ייתן לפצע זמן לסגור. הסר את פתרון 1X tricaine ולהוסיף בינוני E3 טרי. לאחר מכן, דגירה העוברים ב 34 מעלות צלזיוס.טמפרטורה זו תאפשר את הישרדותם של עוברי הזברה ותאי הגידול האנושיים. מבחנים גרורתיים. אם אתה רוצה ללמוד את הפוטנציאל גרורתי של קווי התא שלך, בסביבות שעה אחת לאחר ההזרקה, לסנן את העוברים מוזרקים על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולמיין אותם לשתי קבוצות על פי היעדר או נוכחות של תאים סרטניים במחזור.יום אחד לאחר ההזרקה. על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, לנתח בזהירות כל עובר ולבחור אלה עם גידולים מוזרקים כראוי. מיין את xenografts שנבחרו בהתאם לגודל הגידול.השתמש בגודל העין להשוואה. השלך את כל העוברים עם מורפולוגיה חריגה, בצקת לב או חלמון, קסנוגרפטים עם מעט מאוד תאים סרטניים, או אלה עם תאים סרטניים רק בתוך החלמון. להפיץ את xenografts על פי הפריסה הניסיונית הרצויה ולהתחיל את בדיקת התרופה.החלף את התרופות ואת E3 בינוני מדי יום. דגירה xenografts, שמירה על הטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס עד סוף ההסתעפות. ארבעה ימים לאחר ההזרקה.ביום האחרון של ההסתעפות, יש למרדים את קסנוגרפטים עם פתרון 1X של טריקאין, וליישר אותם בזהירות על צלחת האגר. השלך כל קסנוגרפטים מתים או נפוחים. קסנוגרפטים אלה אינם נחשבים לכימות חריטה.על סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, לנתח בזהירות כל xenograft ולהעריך את היעדר או נוכחות של גידולים בחלל perivitelline. על פי ההתקנה הניסיונית, בחר את קסנוגרפטים של עניין המתת חסד אותם עם tricaine 25X. לתקן אותם 4% פורמלדהיד לפחות 4 שעות בטמפרטורת החדר כדי להמשיך עם immunostaining.אחרת, לאחסן לילה בארבע מעלות צלזיוס ולמחרת, להחליף פורמלדהיד עם 100% מתנול. Xenografts קבוע ב 100% מתנול ניתן לאחסן ב 20 מעלות ללא הגבלת זמן. המערכת החיסונית של ההר כולו עבור הדמיה confocal.כל טכניקת האימונופלואורסצנטיות של ההר אורכת שלושה ימים, מחולקת כדלקמן. היום הראשון הוא לחדירה של קסנוגרפטים ודגרת נוגדנים ראשונית. היום השני, לשטיפה ודגרת נוגדנים משנית.והיום השלישי, לשטיפה, קיבעון של קסנוגרפטים ואחסון במדיום ההרכבה. פרטים נוספים על הליך זה ניתן למצוא במסמך PDF הנלווה. הרכבה של קסנוגרפטים.לאטום את הקצוות של להחליק כיסוי עם ג'לי נפט או גריז סיליקון, כך המדיום הרכבה לא לדלוף. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את xenografts לתעודת הכיסוי. בזהירות ליישר אותם עם סיכת ראש.מוסיפים את מדיום ההרכבה לתעודת כיסוי נוספת. הצטרף בזהירות שתי תגיות כיסוי ומניחים אותם על גבי שקופית מיקרוסקופ כדי לאפשר מניפולציה קלה יותר. הדמיה קונפוקלית.עדשה אובייקטיבית טבילה אפוכרומטית 25X עם תיקון מים היא אופטימלית להדמיית גידולים ברזולוציה של תא יחיד. רכוש את הדגימות באמצעות הפונקציה Z-Stack עם מרווח של חמישה מיקרון בין כל פרוסה. פתח את הנתונים הגולמיים בתוכנת פיג'י.בחר שלוש פרוסות מייצגות של הגידול מהחלק העליון, האמצעי והתחתון, לכל מחסנית z, לכל קסנוגרפט. פתח את תוסף מונה התאים מתוכנת פיג'י. בכלי מונה תאים, לחץ על אתחול, בחר סוג מונה ולחץ על התמונה כדי להפעיל את מצב הספירה באופן ידני.עבור כל לחיצה, המונה שואל כמה תאים נספרים. כדי להשיג את המספר הכולל של תאים בגידול, השתמש בנוסחה הבאה. כדי להעריך את המספרים הכוללים או אחוז הסמנים, כגון תאים חיסוניים, דמויות מיטוטיות, מופעל caspase, בין היתר, לכמת באופן ידני את התאים חיוביים תיוג ספציפי, סמן או transgene של עניין לאורך כל הפרוסות של מחסנית z עם תוסף מונה התא.שים לב שתאים מסוימים ימוקמו בין שתי פרוסות. עבור הלוך ושוב בערימת z כדי לוודא שאף תא לא נספר פעמיים. תוצאות מייצגות.HCT 116 סרטן המעי הגס קו xenografts נוצרו כמתואר בפרוטוקול. קסנוגרפטים הופצו באופן אקראי בפקדים שאינם מטופלים ובכימותרפיה FOLFIRI. אימונופלואורסצנטיות בוצעה כדי לזהות תאים אפופטוטיים, באמצעות נוגדן caspase-3 אנטי בקע ו DAPI עבור נגד גרעין.כימות המדד המיטוטי, האפופטוזיס וגודל הגידול, גילה כי FOLFIRI גורם לירידה משמעותית של מיטוזה וגיוס משמעותי של אפופטוזיס, מלווה בהפחתה של 54% בגודל הגידול. תכונות אלה שימושיות במסכי תרופות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה, כמו גם כדי לבדוק את ההשפעות המהותיות והפיזיולוגיות של מספר טיפולים בסרטן בתוך זמן קצר. יתרון גדול נוסף של מודל קסנוגרפט זברה הוא שניתן ללמוד את האינטראקציות של תאים סרטניים שונים ולנתח כיצד כל סוג של תא יכול להשפיע על ההתנהגות של השני.תאים סרטניים אנושיים שונים, שיבוטים שונים מאותו גידול, או מגידולים שונים, ניתן להזריק במשותף. בדוגמה זו, שני קווי תאים סרטניים המעי הגס נגזר מאותו חולה תויגו עם צבעים ליפופיליים שונים מעורבב ביחס של אחד לאחד להזרקה. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יכול לעזור לחוקרים להפוך למומחים אמיתיים ביצירת קסנוגרפטים של דגי זברה.זה לא קל. אתה צריך להתאמן, להתאמן. אל תוותר.אני בטוח שתגיע לשם. בהצלחה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...