Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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シャンパリモー財団、コンジェント(LISBOA-01-0145-FEDER-022170、FCT/Lisboa2020の共同出資)に資金を提供し、資金に感謝します。VP(SFRH/BD/118252/2016)、MML(PD/BD/138203/2018)のためのFCTフェローシップ。重要な議論のためのFiorの研究室のすべてのメンバー;データ共有のためのB.コスタとC.レベロ・デ・アルメイダ;そして、私たちの研究室のメンバーC.レベロ・デ・アルメイダ、M.バローゾとL.レイテは、ビデオへの参加のために。CFフィッシュファシリティ(C.セルタル、J.モンテイロら)とシャンパリモー・コミュニケーション、イベント、アウトリーチチーム、特にアレクサンドル・アジンヘイラの素晴らしい映画製作とカタリーナ・ラモスとテレサ・フェルナンデスの助けに感謝します。

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. 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がんの開発と薬物スクリーニングのモデルとしてゼブラフィッシュの重要性が高まっているため、多数の出版物3、4、7、13、14、16、18、19、20、21。しかし、ゼブラフィッシュ胚におけるがん細胞の注入は、研究者にとって困難な高い器用さを必要とする技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚異種移植片の設定の初期課題を克服するのに役立つ実用的な情報とヒントを提供することを目指しています。
細胞処理前注入 細胞株を有するゼブラフィッシュ異種移植片の生成のためのこの最適化されたプロトコルは、異なる形態を有する様々なタイプの(癌)細胞に適合させることができる。ゼブラフィッシュ異種移植片に使用されるすべての細胞株はマイコプラズマフリーであることをお勧めします。他の細菌汚染とは異なり、細胞培養中のマイコプラズマの存在は、顕微鏡22の下で容易に検出できる変化を生じない。マイコプラズマ汚染は、細胞株の生着ポテンシャル、薬物に対する感受性、ゼブラフィッシュ胚の生存率に影響を及ぼす可能性がある。
細胞は長期間増殖し続けるが、その表現型や遺伝子型は変化しやすい。培養における細胞株の形態と挙動に精通することが重要です。再現性のある結果を得るために、3-12の間で解凍した後、細胞の通路の数を維持することをお勧めします。したがって、定期的なマイコプラズマ検査を行う必要があります。
細胞は、合流度に達する前に、その対数相(指数成長期〜70%)にする必要があります注射の日に。これは、腫瘍の特徴的な特徴の適切な生着と適切な開発を可能にする。異種移植片内の細胞の表現型の変動を防ぐためには、実験の間に注入のための合流を一定に保つ事が重要です。注入された細胞の数は、ゼブラフィッシュ胚で繁栄するためにより高い濃度の注射を必要とする可能性があるため、各細胞株の特性に適応することができる。
セル・ラベリングに関する考慮事項 注射および将来の分析のためにヒト腫瘍細胞をよりよく視覚化するために、腫瘍細胞は蛍光色素で標識することができる。細胞サイズの違いにより、接着培養における細胞/cm2 の総数は細胞株によって異なる。これは、染色プロトコルの有効性だけでなく、注射のために収穫された細胞の数に影響を与えます.フラスコ当たりの数が少ない(すなわち、Hs578T)またはクラスターで増殖する大細胞(すなわち、BFTC905)は、単一の実験のためにいくつかのフラスコのプーリングを必要とする。この場合、過剰な量の色素(高コスト)の使用を引き起こすので、細胞の染色はフラスコ内で直接行うべきではありません。一方、遠心分離の過剰なサイクルに対して高感度である細胞とフラスコ(すなわち、HCT116)あたり高い数を生み出す細胞は、フラスコに直接染色し、次いでEDTA/細胞スクレーパーで剥離することができる(詳細については 表1参照)。
可能な限り、酵素的アプローチを使用する代わりに、EDTAを使用して注入の日に細胞を取り外し、細胞がより迅速に細胞と細胞の接合を回復し、より少ない遠心分離ステップを受ける。それにもかかわらず、細胞がEDTAに敏感である場合、非常に付着性またはクラスター内で成長する - 酵素的方法を適用することができます。注射用の理想的な濃度の最適化と注入媒体は、各細胞株の特性に依存するため、調整が必要になる場合があります(表1)。
マイクロインジェクションキャリブレーション ゼブラフィッシュ胚へのオリゴヌクレオチドまたは薬物の送達とは対照的に、異種移植片の細胞株を用いるとき、経緯線は針を較正するために使用されない。注射中にしばらくすると、細胞が詰まり始め、直径を大きくしたり、針を完全に変更するために針の先端を切断する必要があります。この手順は、経緯線の校正を妨げる。
この問題に対処するために、分配される細胞の数は、1〜3パルス以内の胚眼と同様の大きさに達するために必要な排出圧力と時間によって調節される。次いで、腫瘍サイズをさらに制御し、1dpiで、異種移植片が図6B-Bに示すように腫瘍サイズに従ってソートされる。図6Cの例に示すように、このソート方法は腫瘍サイズの変動を減らすのに効率的です:それらをすべて一緒にプールすると(+,++,++)STEVは++クラスの2倍(〜906細胞から〜422細胞)であり、係数変動は++クラスの14,5%と比較して約31.9%です。注入の基準は体積であるため、細胞の総数は細胞タイプによって大きく異なり、細胞のサイズと形状に依存する。例えば、巨細胞は乳癌Hs578Tのような細胞質が多く、はるかに小さい腫瘍(〜600細胞)を産生する。また、各セル行には異なるセル数が必要です。例えば、HT29 CRCおよびRT112尿膀胱癌細胞株は、注入される細胞の数が多いほどゼブラフィッシュの死亡率が高いことを示している。したがって、細胞株が胚に毒性効果を有するか、または注射のより高い/低密度を必要とするかのテストには、異種移植片の開発中に最適化期間が必要です。
注射部位 ゼブラフィッシュ胚異種移植片を生成する際の最も一般的な不一致の1つは、注射部位である。黄身は、通常、その容易なアクセシビリティのために注射のための選択の場所です。しかし、黄身に注入された細胞は死ぬ傾向が高いことが分かりました。技術的に難しいが、我々はPVSに、心臓から可能な限りまで注入することをお勧めします。PVS内では、細胞は、転移特性8,11を示す場合、細胞が凝集し、血管および免疫細胞をリクルートし、移動し、血管内に増殖し、血管内に増殖し、微生物転移を形成し、転移特性を示す場合である。
生着効率 4 dpi での細胞株間の生着効率と腫瘍サイズの違いは、それらの顕著な程度の基底細胞死/生存/増殖が原因で予想されるが、また各細胞株が9を表示する可能性のある自然免疫原性による。
転移 転移は、2つの任意のステージに分割できるイベントの複数のステップカスケードを含みます。第1段階では、腫瘍細胞は原発部位から切り離し、隣接する組織を移動して侵入し、その後血流中に浸潤する必要があります。第2段階では、腫瘍細胞は循環して生き残り、血液またはリンパ管から精腸を起用し、最終的に二次部位23にコロニー形成する。これらの初期事象と後期事象を区別し、これらのステップを実行するために異なる腫瘍細胞の潜在的/熟練度に対処するために、我々は簡単なアッセイを設計した。
一般に、PVSに注入すると、腫瘍細胞は直接循環に入り、尾部造血組織(CHT)(尾部)に物理的に閉じ込められる。しかし、各腫瘍細胞の特性によれば、いくつかの腫瘍細胞がCHT 4 dpiに残り、他の腫瘍細胞が消失する間に微小転移を形成することができることを見てきた(CHTに巻き込まれた後にクリア)。
したがって、細胞が直接循環に入れられたときに微小転移効率(4dpiで)を比較することによって、CIRC(細胞は転移の後期ステップを通過するだけでいい)対しない場合- NO CIRC(細胞は微小転移を形成するために早期および後期のステップを通過する必要がある)を比較することによって、早期または後期転移電位を評価することができる。我々は、CHTにおいて効率的に微小転移を形成し得る腫瘍細胞を観察した(CIRCおよびNO CIRC)、これらの細胞は転移カスケード(例えばSW480およびMDA-MB-468)8,11の全ステップを受ける能力を有することを示唆している。対照的に、他の腫瘍細胞は、両方の群において非常に低い転移電位を有し、微小転移を起こしにくい、循環に注入された場合でさえ(すなわち、24hpiでCHTに見えるが、4dpiでは、それらはもはや存在しない、例えばHs578T)8。しかし、循環に注入されたときにのみ微小転移を形成できる別のグループ(CIRC群の微小転移しか観察できない)を明らかに発見しました。これは、これらの細胞が転移カスケードの最初のステップを実行する効率が低いが、一方で循環して生き残り、外回し、遠くの部位を植民地化できることを示唆している。
免疫染色とイメージング 固定する前に、この注入プロトコルは、ライブ差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡、回転ディスク顕微鏡、高解像度ライブ共焦点イメージング、ライトシート顕微鏡などの他のライブイメージングアプローチに使用できます。
死んだ細胞および細胞破片は、蛍光体顕微鏡を通して観察されると明るく見え、特に研究の目的が細胞株の転移電位を評価することである場合、生細胞と間違えられる可能性がある。我々は、腫瘍および微小転移の生存状態を評価するために、特異的生存マーカーおよびDAPIを用いて共焦点イメージングを行うことの重要性を強調したい。また、抗ヒトミトコンドリアや抗ヒトHLAなどのヒト細胞を検出するために、特定のヒト抗体を使用することが基本です。プロトコルを実装する際、実験者は、実体顕微鏡における染色を共焦点画像と比較して目を向ける。しばらくすると、実験者は蛍光体顕微鏡で生細胞から破片を明確に区別することができます。
蛍光領域全体等の腫瘍の負担を定量化する他の方法は広く用いられているが、より正確な方法として、全体のマウント免疫染色及び共焦点イメージングを行うことを推奨する。親油性色素染色の効率は非常に変動する(すなわち、一部の細胞は非常によく染色されているのに対し、膜の脂質含有量が原因ではない細胞もある)だけでなく、脂肪性染料が凝集体を形成する回数が多く、死んだ細胞が明るい傾向があり、生細胞と間違えられるいくつかのアーティファクトを生じる。
細胞は、蛍光タンパク質を用いて、追跡を助け、細胞標識をスキップすることができます。しかし、トランスデューセと非トランスデューセの細胞がゼブラフィッシュ異種移植片で同じ結果を生じることを確認してください。
さらに、マクロファージは、これらの蛍光細胞デブリが蛍光標識されて移行し、偽陽性の転移細胞を生成する食細胞を食細胞化することができる。したがって、一連の分析ツールを推奨しますが、これはもちろん、腫瘍の挙動をより正確に解釈するために他の多くの読み出しに拡張することができます。
<ul style="list-style-type: square;"><li>
増殖 - DAPIまたは抗pHH3Ser10 抗体(メルクミリポア猫#06-570)を使用した有糸分裂体の定量化、</li>
	<li>
アポトーシスによる細胞死-抗体Caspase3Asp175( 細胞シグナル技術cat.#9661)またはそれに相当する、</li>
	<li>
腫瘍サイズ - DAPIカウント- ヒト腫瘍細胞は非常に明確なクロマチン組織を示すので、ゼブラフィッシュ細胞と容易に区別され、常に色素で再確認することが可能です(眼を訓練しているとき)</li>
	<li>
転移研究では、ヒト細胞を明確に検出する-抗ヒトHLA(Abcam EP1395Y Cat. #ab52922)、抗ヒトミトコンドリア(メルクミリポア猫#MAB1273クローン113-1)。</li>
</ul>コントロール癌細胞HCT116のZスタック間の5μm間隔の共焦点獲得(直径10~12μmの平均核サイズ)を用いて、細胞の約50%が連続した2つのスライス間で共有されているのが観察されました。したがって、すべてのスライスがカウントされる場合、同じセルを2回カウントするリスクが高くなります。スライス間を行き来して定量化の問題を回避すると、時間がかかり、エラーが発生しやすいテクニックが生じます。細胞の総数の定量化を容易にし、研究者間のより再現性を可能にするために、我々は、このプロトコル8で前述した腫瘍サイズ式を作成した。
スライス間で共有される約50%のセルを考慮して、補正番号(1.5)を含めます。研究者間の腫瘍全体の手動カウントの平均誤差は20%であることがわかりました。この式を使用する2人の研究者は2%の誤差を持っていました。この式の使用は93%の正確さおよび98%の再現率を有する。自動化メソッドもテストしましたが、しきい値設定によって 50% を超えるエラーが発生しました。
アポトーシス細胞の特性により、活性化Caspase3細胞の定量化がより困難である。間違いの数と結果の変動を減らすために、コントロールと実験サンプルを同じ研究者が数えることをお勧めします。さらに、この技術を学ぶとき、新しい研究者は、結果を比較し、訓練するために、より経験豊富な研究者によって既に定量化された画像を数える必要があります。
アッセイの長さは必要に応じて延長することができる。しかし、ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後〜7日(注射後5日)から生餌を必要とすることを考慮することが重要です。さらに、動物福祉ガイドラインおよび適用される規則は、受精後6日以上の幼虫に適用される。
このプロトコルは、1人の研究者が1時間あたり約〜200〜300匹のゼブラフィッシュ幼虫を注入することを可能にする有用なツールを提供します。分析と統計的解釈を含む完全なアッセイの結果は、3週間で得られる。このプロトコルが、研究者がゼブラフィッシュ異種移植片を生成する専門家になることを願っています。それは簡単ではありません。練習する必要があるが、そこに着く。がんばって！

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、発達と病気を研究するための強力な脊椎動物モデル生物として登場しています。ゼブラフィッシュは、高度に保存された遺伝(70%の遺伝的相同性および〜84%の疾患関連遺伝子)および基本的な器官形態学的特徴をヒト1,2と共有する。この保存により、ゼブラフィッシュを使用して、がん3、4を含むいくつかのヒト疾患をモデル化することができます。
ゼブラフィッシュの取り扱いとメンテナンスは、その小さなサイズ、一年中高い胎児性、および外受精3、5のためにマウスよりもはるかに簡単で費用対効果が高いです。ゼブラフィッシュ胚は、生後5〜7日間の生き物を必要とせず、発達、感染、および癌1、4、6、7の有効モデルとして使用されてきた。ゼブラフィッシュ胚は、受精後48時間(hpf)で孵化し、すべての器官が形成された自由遊泳動物であり、鼓動心臓および機能的循環系、肝臓、脳、腎臓骨髄、1、3などである。また、現段階では先天性免疫のみが遊びで、適応免疫が未だに発達しており、免疫不全変異体7,8を使用する必要のないヒト細胞の一般的な効率的な生着が可能となる。それにもかかわらず、すべてのヒト細胞が等しく9を生着するわけではないことに注意することが重要であり、例えば白血病細胞については、貪食細胞(好中球およびマクロファージ)が効率的な生着10のために枯渇する必要が示された。
ゼブラフィッシュの遺伝的難解性とその初期胚段階の光学的透明性は、単一細胞の生体内イメージングを高解像度で可能にし、したがって、生物学の多様な分野における最先端のイメージング技術の確立を可能にする。さらに、癌の文脈において、これらの特徴は、血管新生および転移性の可能性を研究する、ならびに自然免疫系8、9、11、12、13との相互作用のような宿主と腫瘍相互作用の初期段階のリアルタイム研究に有用である。
短い異種移植片アッセイでは転移性の「進化」の時間はないが、腫瘍細胞の転移能を分析することが可能である(すなわち、その効率は、浸潤、内膜、循環中の生存、飛び出し、および植民地化のような転移的なステップを経て、したがって、生体内およびリアルタイム8、11、13、14でこれらのプロセスを研究する)。
そのライフサイクルの特徴は、癌の個別化医療のためのユニークなモデルとしてゼブラフィッシュを置きます。アッセイは、より短い期間で実行することができ、数週間で得られた結果7,8,9,9,11,12,15,16.これらのアッセイのセレリティと実現可能性は、医師や研究者に、時間が不可欠なニーズであるがん患者に有用な翻訳結果を得る可能性を提供します。
ゼブラフィッシュ胚異種移植片の生成に成功する試みが増えているにもかかわらず、注射手順の標準化と、注射後の細胞生存率および腫瘍挙動の評価が依然として必要である。
このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚におけるヒトがん細胞株の注入とその後の固定、免疫染色、イメージング、腫瘍細胞挙動の定量化に関する明確で詳細なステップバイステップガイドを研究者に提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

ゼブラフィッシュ幼虫異種移植片は、ヒト癌の インビボ およびリアルタイム研究を行うための癌研究に広く使用されている。抗癌療法(化学療法、放射線療法、および生物学的)、血管新生および単一細胞分解能による転移に対する応答を迅速に可視化する可能性は、ゼブラフィッシュ異種移植片モデルを前臨床試験を開発するための最有力選択肢としている。

ゼブラフィッシュ幼虫異種移植アッセイは、他のモデルと比較していくつかの実験的な利点を提示するが、おそらく最も顕著なのは、サイズスケールとその結果的に時間の減少である。このスケールの縮小は、単一細胞イメージング、比較的少ない数のヒト細胞(生検と互換性がある)の使用を可能にする、中高スループット薬物スクリーニング、最も重要なのは、アッセイの時間の大幅な短縮を可能にする。これらすべての利点は、ゼブラフィッシュ異種移植アッセイを将来の個別化医療用途にとって非常に魅力的なものにします。

多くのゼブラフィッシュ異種移植プロトコルは、ヒト腫瘍の広い多様性と開発されています。しかし、ゼブラフィッシュ幼虫異種移植片を効率的に生成するための一般的かつ標準化されたプロトコルはまだ欠けている。ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。

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Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

ゼブラフィッシュ異種移植片は、がん研究に広く使用されています。あなたは人間の腫瘍細胞を取り、小さな幼虫ゼブラフィッシュ、あるいは大人にそれを注入することができます。ここでは、生きている動物のいくつかのヒト癌の特徴を研究することができる幼虫モデルのステップバイステッププロトコルです。増殖を研究し、血管新生を研究し、転移を研究することができ、腫瘍微小環境内での相互作用も研究できます。そして、大きな利点は、あなたが非常に短い時間枠でこれを研究できることです。例えば、わずか4日間。もう一つの大きな利点は、共焦点または軽シート顕微鏡を使用して、単一細胞分解能でこのライブを研究できることです。細胞がどのように移行するか、細胞が互いに相互作用するか、あるいは細胞が互いにどのように話し合うかを調べることもできます。だから、がん生物学を研究することは本当に強力なモデルです。ゼブラフィッシュ異種移植片は、化学療法、放射線療法、さらには抗体を用いた標的療法のような抗癌療法に対する反応を研究するために使用することができる。そして最後に、このプロトコルはまた、外科サンプルから、あるいは生検から患者由来の細胞を使用するように適応し、ゼブラフィッシュのアバターを生成することもできる。注射用のセットアップ。注射の2週間前に、培養中の細胞を拡大する。多くの細胞や魚が訓練中に失われるので、技術に堪能になるまで余分な細胞と余分な魚から始めます。付属のPDFの表1は、いくつかの細胞株の注入のためのインビトロ合流の最適な割合の詳細なガイドを有する。注射の3日前に、所望の背景のゼブラフィッシュを横切る。注射の24時間前。ゼブラフィッシュの胚プレートをきれいにします。すべての死んだ胚と非発達胚を捨て、E3培地をリフレッシュします。細胞培養室では、細胞培養培地を廃棄する。PBS 1Xで一度洗い、死んだ細胞を取り除き、新鮮な培地を加えます。注射用の胚を揃えるために、マイクロインジェクション針、アガロースプレート、ヘアピンなどの注射手順用のツールを準備します。プレート調製のために、溶解した2%アガロースの1つの層をきれいなペトリ皿の蓋に注ぎます。それを重合させ、定規の助けを借りて、胚の整列のために3〜4本のまっすぐなアガロースラインを作ります。注射日。孵化した胚を孵化していない卵から分離する。この段階で胚培地にプロナーゼを加えることは、孵化を後押しすることができる。胚を注射まで摂氏28度でインキュベーターに入れる。注射用の細胞ラベリング。再現可能なセルラベル技法の確立を支援するために、セルラインのリストと複数のラベリングソリューションをコンパイルするために、書かれたプロトコルの表1と2をチェックします。細胞培養培地を取り出し、PBS1Xでフラスコを2回洗う。細胞に脂溶性染料を付け、光への暴露を避け、フラスコを37度でインキュベートします。また、剥離時に1.5 mlマイクロ遠心チューブ内の細胞にラベルを付けることを選択することができます。細胞標識液を取り出し、細胞をPBS1Xで洗浄し、過剰な染料を取り出します。対応する剥離剤を加え、セルを摂氏37度でインキュベートする。フラスコを滅菌細胞スクレーパーでブラッシングし、血清ピペットで細胞を収集することにより、剥離プロセスを容易にします。細胞を1.5mlのマイクロ遠心チューブおよび遠心分離機に移す。上清を捨て、細胞培養培地でペレットを再懸濁する。トリパンブルー排除または他の選択方法を用いてノイバウアーチャンバーを使用して細胞生存率を定量化する。遠心分離機を注射媒体中の細胞を再び懸濁させる。培地中の細胞の推奨濃度は、原稿の表1に記載されています。この時点以降、細胞は氷の上に保管する必要があります。注射手順。トリカイン1Xの胚を5分間麻酔する。次に、少量の麻酔をした胚をアガロースプレートに移し、ヘアピンループの助けを借りてそれらを整列させます。胚間の距離を維持するようにしてください。特に1の黄身と次の卵の頭の間。死亡率を防ぐために、配位置した胚が、トリケーヌ1X溶液を1~3滴慎重にプレートに加えることによってアガロースプレートで乾燥しないようにします。マイクロ遠心チューブを軽くタップして細胞を再懸濁します。マイクロローダーチップを使用して注射針をセルサスペンションでバックロードし、胚の完全性を損なう可能性があるため、気泡を避けます。空気圧弁を開き、マイクロインジェクターを設置し、マイクロインジェクションニードルをホルダーに慎重に入れる。マイクロインジェクションニードルを先端近くに切ります。慎重に胚の黄身を突き刺し、針の角度を下げ、針の先端がペリビテリン空間に達するまで慎重に押す。先端がペリビテリン空間に入ったら、細胞を注入する。胚の目の大きさに似た細胞の体積を注入し、心臓浮腫を防ぐために心臓から可能な限り注入してみてください。必要に応じてマイクロインジェクターの圧力を調整します。注入した胚をトリカイン1X溶液できれいなペトリ皿に移し、5〜10分間休ませます。これは、傷を閉じる時間を与えます。トリケーヌ1X溶液を取り除き、新鮮なE3培地を加えます。その後、胚を摂氏34度でインキュベートする。この温度は、ゼブラフィッシュ胚とヒト腫瘍細胞の両方の生存を可能にする。転移アッセイ。細胞株の転移電位を研究したい場合は、注入後約1時間で、注入された胚を蛍光立体顕微鏡でスクリーニングし、循環する癌細胞の不在または存在に応じて2つのグループに分類する。1日の注射後。蛍光体顕微鏡では、各胚を注意深く分析し、適切に注射された腫瘍を持つものを選択します。腫瘍サイズに応じて選択した異種移植片を並べ替えます。比較には目の大きさを使用します。異常な形態、心臓または黄身浮腫、癌細胞が非常に少ない異種移植片、または卵黄の中にのみ癌細胞を持つ胚を捨てる。所望の実験レイアウトに従って異種移植片を配布し、薬物アッセイを開始する。毎日薬とE3培地を交換してください。異種移植片をインキュベートし、アッセイの終わりまで摂氏34度の温度を維持する。注射後4日間。アッセイの最終日に、異種移植片をトリカイン1X溶液で麻酔し、寒天板に慎重に位置合わせします。死んだ、または腫れた異種移植片を捨てる。これらの異種移植片は、生着定量のために考慮されていません。蛍光体顕微鏡では、各異種移植片を注意深く分析し、ペリビテリン空間における腫瘍の存在または存在を評価する。実験のセットアップによると、目的の異種移植片を選択し、トリカイン25Xでそれらを安楽死させる。4%ホルムアルデヒドを室温で少なくとも4時間固定し、免疫染色を進めます。それ以外の場合は、摂氏4度で一晩保存し、翌日にホルムアルデヒドを100%メタノールに置き換えます。100%メタノールに固定された異種移植片は、20度無期限に保存することができる。共焦点イメージングのための全体マウント免疫染色。全体のマウント免疫蛍光技術は、次のように分割して、3日間かかります。最初の日は、異種移植片および一次抗体インキュベーションの透過性化のためです。2日目は、洗浄および二次抗体インキュベーションに対する。そして3日目は、洗浄のために、異種移植片の固定および取り付け媒体中の貯蔵を行う。この手順の詳細については、付属の PDF を参照してください。異種移植片の取り付け。取り付け媒体が漏れないように、カバースリップの端を石油ゼリーまたはシリコーングリースで密封します。パスツールピペットを使用して、異種移植片をカバースリップに移します。慎重にヘアピンでそれらを整列させます。取り付け媒体を別のカバースリップに追加します。慎重に両方のカバースリップを結合し、より簡単な操作を可能にするために顕微鏡のスライドの上に置きます。共焦点イメージング。水補正を伴うアポクロマティック25X浸漬対物レンズは、単一細胞分解能を有する腫瘍のイメージングに最適です。Z-Stack 関数を使用して、各スライス間に 5 ミクロンの間隔でサンプルを取得します。フィジーのソフトウェアで生データを開きます。ゼノ移植片ごとに、zスタックごとに、上、中央および下から腫瘍の3つの代表的なスライスを選択する。フィジーのソフトウェアからセルカウンタープラグインを開きます。セル カウンタ ツールで、[初期化] をクリックし、カウンタ の種類を選択してイメージをクリックし、カウント モードを手動で開始します。クリックするたびに、カウンタはカウントされるセルの数を尋ねます。腫瘍内の細胞の総数を得るために、以下の式を用いた。免疫細胞、有糸分裂性の数値、活性化カスパーゼなどのマーカーの総数または割合を評価するには、セルカウンタープラグインを使用してZスタックのすべてのスライスに沿って、特定のラベリング、マーカーまたはトランスジーンの関心のある細胞を手動で定量化します。一部のセルは 2 つのスライスの間に配置されます。z スタックを行ったり来たりして、セルが 2 回カウントされないようにします。代表結果。HCT 116大腸癌細胞株異種移植片は、プロトコルに記載されるように生成した。異種移植片は、非治療コントロールおよびFOLFIRI化学療法において無作為に分布した。免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ-3抗体およびDAPIを用いて核酸対抗染色を行った。有糸分裂指数の定量化、アポトーシス、および腫瘍サイズは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少およびアポトーシスの有意な誘導を誘発し、腫瘍サイズの54%の減少を伴うことを明らかにした。これらの特徴は、ハイスループット表現型の薬物スクリーンにおいて有用であるとともに、短時間で複数の癌治療の細胞固有および生理学的効果をテストする。ゼブラフィッシュ異種移植モデルのもう一つの大きな利点は、異なる腫瘍細胞の相互作用を研究し、各タイプの細胞が他の細胞の挙動にどのように影響するかを分析することができるということです。異なるヒト癌細胞は、同じ腫瘍から、または異なる腫瘍から異なるクローンを、共注射することができる。この例では、同じ患者由来の2つの大腸癌細胞株を異なる親油性染料で標識し、注射のための1対1の比率で混合した。このプロトコルが、研究者がゼブラフィッシュ異種移植片を生成する真の専門家になることを願っています。それは簡単ではありません。練習する必要があります。諦めないで下さい。きっとそこに着くと思いますよ。がんばって。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

タッチ捺印細胞診を用いた臨床病理標本から質の高い腫瘍 DNA を取得する簡易法

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

回転楕円体、コロニー形成アッセイとゼブラフィッシュ異種移植片による抗癌性クマリン OT48 の生物活性の臨床評価

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

超音波の利用ガイド生物学的関連性の転移性腫瘍の異種移植片の確立のため組織指示細胞注入

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...