Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
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우리는 샴페인 마우드 재단, 콘겐토 (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, FCT / 리스보아2020에 의해 공동 자금 조달)에 감사드립니다. 부사장FCT 펠로우십(SFRH/BD/118252/2016), MML(PD/BD/138203/2018). 중요한 토론을 위한 Fior Lab의 모든 구성원; B. 코스타와 C. 레벨로 드 알메이다 데이터 공유; 그리고 우리의 실험실 구성원 C. 레벨로 드 알메이다, M. 바로소와 L. 라이트 비디오에 참여. CF 피쉬 시설(C. 세르탈, J. 몬테이로 등)과 샴페인 커뮤니케이션, 이벤트 및 아웃리치 팀에게 환상적인 영화 제작에 대한 알렉산드르 아진헤이라와 카타리나 라모스와 테레사 페르난데스의 도움을 부탁드립니다.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

암 개발 및 약물 검진의 모델로서제브라피쉬의 중요성이 증가함에 따라 수많은 간행물3,4,7,13,14,16,18,19,20,21이발생했다. 그러나, 제브라피시 배아에 있는 암세포의 주입은 연구원을 위해 도전할 수 있는 손재주성의 높은 수준을 요구하는 기술입니다. 이 프로토콜에서 우리는 제브라피시 배아 xenografts를 설치하는 초기 도전을 극복하는 데 도움이 될 수있는 실용적인 정보와 몇 가지 팁을 제공하는 것을 목표로합니다.
세포 취급 사전 주입 세포주를 가진 제브라피시 제노이식의 생성을 위한 이 최적화된 프로토콜은 상이한 형태를 가진 다양한 유형의 (암) 세포에 적응될 수 있다. 제브라피시 제노이식에 사용되는 모든 세포주는 마이코플라즈마가 없는 것이 좋습니다. 다른 세균 오염과 달리, 세포 배양에 마이코플라즈마의 존재는현미경(22)에서쉽게 검출될 수 있는 변화를 생성하지 않는다. 마이코플라즈마 오염은 세포주 이식 잠재력, 약물에 대한 민감성, 제브라피시 배아의 생존가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
세포가 장기간 계속 증식할 수 있지만 표현형과 유전자형은 변화에 취약할 수 있습니다. 배양시 세포주의 형태와 행동에 익숙해지는 것이 중요합니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 3-12 사이를 해동한 후 세포 구절수를 유지하는 것이 좋습니다. 따라서, 정기적인 마이코플라즈마 테스트는 수행되어야 한다.
세포는 로그 단계에 있어야 합니다(합류 ~70% 전에 기하급수적 성장 단계) 주사 당일. 이것은 종양의 특유한 특징의 적당한 이식 및 적당한 발달을 가능하게 할 것입니다. 이노이식 내 세포의 표현형의 변이를 방지하기 위해 실험 사이에 분사 상수를 유지하는 것이 중요합니다. 주입된 세포의 수는 제브라피시 배아에서 번창하기 위하여 주사의 더 높은 밀도를 요구할 수 있기 때문에 각 세포주의 특성에 적응될 수 있습니다.
셀 라벨링 고려 사항 주사 및 미래 분석을 위해 인간 종양 세포를 더 잘 시각화하기 위해 종양 세포는 형광 염료로 표시 될 수 있습니다. 세포 크기의 차이로 인해, 부착 배양에서 세포 /cm2의 총 수는 세포주마다 다릅니다. 이것은 염색 프로토콜의 효험뿐만 아니라 주입을 위해 수확된 세포의 수에 영향을 미칩니다. 플라스크당 낮은 숫자를 산출하거나 클러스터(즉, BFTC905)에서 성장하는 큰 셀은 단일 실험을 위해 여러 플라스크의 풀링이 필요합니다. 이 경우, 세포의 염색은 과도 한 양의 염료 (높은 비용)의 사용을 일으킬 수 있으므로 플라스크에서 직접 수행해서는 안됩니다. 한편, 원심분리의 과도한 주기에 매우 민감한 세포뿐만 아니라 플라스크당 높은 숫자를 산출하는 세포(즉, HCT116)는 플라스크에 직접 염색한 다음 EDTA/셀 스크레이퍼로 분리될 수 있습니다(자세한 내용은 표 1참조).
가능하면 효소 접근법을 사용하는 대신 EDTA를 사용하여 주입 당일 세포를 분리하여 세포세포 접합부를 보다 신속하게 복구하고 원심 분리 단계를 덜 수행합니다. 그럼에도 불구하고, 세포가 EDTA에 민감하다면 클러스터에서 매우 응집되거나 자라는 경우 효소 방법을 적용할 수 있습니다. 주사 배지뿐만 아니라 주사에 대한 이상적인 농도의 최적화는 각 세포주의 특성에 따라 달라지므로 일부 조정이 필요할 수있습니다(표 1).
미세 주입 교정 제브라피시 배아로 올리고뉴클레오티드 또는 약물을 전달하는 것과는 달리, 잎이 트개 이식을 위해 세포주로 작업할 때 그레이티쿨은 바늘을 보정하는 데 사용되지 않습니다. 주입 하는 동안 몇 시간 후, 세포 는 막히기 시작 됩니다., 그리고 그것의 직경을 증가 하거나 바늘을 완전히 변경 하는 바늘의 끝을 잘라 필요. 이 절차는 무상 교정을 방해합니다.
이 문제를 해결하기 위해, 분배된 세포의 수는 1-3 펄스 내의 배아 눈과 유사한 크기에 도달하는 데 필요한 방출 압력 및 시간에 의해 조절됩니다. 이어서, 종양 크기를 추가로 조절하기 위해, 1dpi에서, xenografts는 도 6 B-B에도시된 바와 같이 종양 크기에 따라 분류된다" . 도 6C 예제에서 와 같이, 선별의이 방법은 종양 크기의 변화를 줄이는 데 효율적입니다 : 우리가 그들 모두를 함께 풀경우 (+, ++, +++++) STEV는 ++클래스의 두 배 (~906 세포 ~ ~ 422 세포) 및 계수 변동은 ++클래스의 14,5 %에 비해 ~31.9 %입니다. 주입에 대한 참조는 부피이기 때문에 셀 유형 마다 셀 의 총 수가 많이 다릅니다 - 세포의 크기와 모양에 의존합니다. 예를 들면, 유방암 Hs578T 같이 세포질이 많은 큰 세포는, 훨씬 더 작은 종양 (~600 세포)를 일으킵니다. 또한, 각 세포주 세포의 다른 수를 필요로한다. 예를 들어, HT29 CRC 및 RT112 오줌 방광암 세포주는 주입된 세포의 수가 높을수록 제브라피시 사망률이 높다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 세포주가 배아에 독성 효과가 있거나 주사밀도가 더 높거나 더 낮은 지밀도가 필요한지 테스트하기 위해서는 이종이이식을 개발하는 동안 최적화기간이 필요하다.
사출 사이트 제브라피시 배아 제노이식을 생성할 때 가장 흔한 불일치 중 하나는 주사 부위입니다. 노른자는 일반적으로 쉽게 접근성으로 인해 주입을위한 장소입니다. 그러나, 우리는 노른자에서 주입된 세포가 정지하는 더 높은 경향이 있다는 것을 관찰했습니다. 기술적으로 더 어렵지만, 우리는 PVS에 가능한 한 심장에서 주입하는 것이 좋습니다. PVS 내에서, 세포는 전이성 특성8,11을표시하는 경우에, 혈관 및 면역 세포를 집계하고, 결합하고, 사치시키고, micrometastasis를 형성할 수 있다.
이식 효율 4dpi에서 세포주 중 이식 효율 및 종양 크기의 차이는 기저 세포 사멸/생존/증식의 뚜렷한 정도뿐만 아니라 각 세포선이9를표시할 수 있는 타고난 면역원성 으로 인해 예상된다.
전이 전이는 두 임의단계로 나눌 수 있는 다단계 이벤트 로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서 종양 세포는 1 차 부위에서 분리하고 인접한 조직을 마이그레이션및 침입한 다음 혈류로 침입해야합니다. 두 번째 단계에서, 종양 세포는 순환에서 살아 나야하며 혈액 이나 림프관에서 사치스럽게 만들고, 마지막으로 이차 부위(23)에서식민지화해야합니다. 이 초기 및 늦은 사건을 구별하고 이 단계를 수행하기 위하여 다른 종양 세포의 잠재력/숙련도를 다루기 위하여, 우리는 간단한 분석기를 디자인했습니다.
일반적으로, PVS에 주입될 때, 종양 세포는 순환으로 직접 입력한 다음 카우달 조혈 조직(CHT)(TAIL region)에 물리적으로 갇힐 수 있다. 그러나, 각 종양 세포의 특성에 따라 - 우리는 몇몇 종양 세포가 CHT 4 dpi에 남아 있고 그밖 종양 세포가 사라지는 동안 micrometastasis를 형성할 수 있다는 것을 보았습니다 (CHT에 붙잡힌 후에 삭제).
따라서, 세포가 순환에 직접 배치되었을 때 미세 전염 효율(4dpi에서)을 비교하여 - CIRC (세포는 전이의 늦은 단계를 거쳐야만) 대 하지 않을 때 - NO CIRC (세포는 미세 전이를 형성할 수 있는 초기 및 후반 단계를 통과해야 합니다)를 초기 또는 후기 metastatic 잠재력을 평가할 수 있습니다. 우리는 두 그룹 (CIRC 및 NO CIRC)에서 CHT에서 마이크로 메타아시스를 효율적으로 형성 할 수있는 종양 세포를 관찰했으며, 이러한 세포는 전이성 캐스케이드 (SW480 및MDA-MB-468)의 모든 단계를 겪을 수있는 능력을 가지고 있음을시사8,11. 대조적으로, 다른 종양 세포는 두 단에서 매우 낮은 전이성 전위력을 가지며, 거의 마이크로메타시스를 만들지 않으며, 혈중 (즉, 24 hpi에서 CHT에서 볼 수 있지만 4 dpi에서 더 이상 존재하지 않는다, Hs578T)8. 그러나, 우리는 명확하게 다른 단을 찾아냈습니다 - 순환에 주입될 때 단지 micrometastasis를 형성할 수 있는 하나 (우리는 CIRC 단에 있는 micrometastasis를 관찰할 수 있습니다). 이것은 이 세포가 전이성 폭포의 첫번째 단계를 수행하는 저효율을 가지고 있다는 것을 건의합니다 그러나 다른 한편으로는 순환에서 살아남을 수 있고, 사치화하고 먼 사이트를 식민지화할 수 있습니다.
면역 염색 및 이미징 고정하기 전에, 이 주입 프로토콜은 살아있는 차등 간섭 대조 (DIC) 현미경 검사법, 회전 디스크 현미경 검사법, 고해상도 라이브 공초점 화상 진찰 및 광시트 현미경 검사법과 같은 그밖 살아있는 화상 진찰 접근에 사용될 수 있습니다.
죽은 세포와 세포 파편은 형광 스테레오 현미경을 통해 관찰될 때 밝게 나타나고 연구 결과의 목적이 세포주의 전이성 잠재력을 평가하는 경우에 특히 살아있는 세포로 착각될 수 있습니다. 우리는 종양과 미세 메타염의 생존 상태를 평가하기 위해 특정 생존 마커 및 DAPI와 함께 공초점 이미징수행의 중요성을 강조하고 싶습니다. 또한, 특정 인간 항체를 사용하여 항인간 미토콘드리아 또는 항인간 HLA와 같은 인간 세포를 검출하는 것이 기본이다. 프로토콜을 구현할 때, 스테레오현미경의 염색을 공초점 이미지와 비교하여 실험자의 눈을 훈련시다. 몇 시간 후, 실험자는 형광 스테레오 현미경의 살아있는 세포와 파편을 명확하게 구별 할 수 있습니다.
전체 형광 영역과 같은 종양 부담을 정량화하는 다른 방법이 널리 사용되지만, 보다 정확한 방법으로 전체 마운트 면역 염색 및 공초점 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 뿐만 아니라 지방 성 염료 염색의 효율은 매우 가변 (즉, 일부 세포는 매우 잘 얼룩진 반면 다른 사람은 -아마 그들의 막의 지질 함량으로 인해), 뿐만 아니라 여러 번 지방 혈성 염료 형성 집계, 죽은 세포는 밝은 경향이 - 살아있는 세포에 대한 오해 될 수있는 여러 유물을 만드는.
세포는 그들의 추적에 원조하고 세포 라벨을 건너 뛰기 위하여 형광 단백질로 변환될 수 있습니다. 그러나, 변환된 및 비변환된 세포가 제브라피시 제노이식에서 동일한 결과를 생성하는지 확인하십시오.
또한, 대식세포는 이러한 형광 세포 파편이 형광으로 표시되고 이동하여 거짓 양성 전이성 세포를 생성할 수 있습니다. 따라서 종양 행동의 보다 정확한 해석을 위해 여러 가지 다른 판독도구로 확장 될 수있는 일련의 분석 도구를 권장합니다.
<ul style="list-style-type: square;"><li>
확산 - DAPI 또는 항 pHH3Ser10 항체를 가진 미토틱 피규어의 정량화 (머크 밀리포어 고양이. #06-570),</li>
	<li>
세포 사멸- 항체 항활성 Caspase3Asp175 (셀 신호 기술 고양이 #9661) 또는 이와 동등한,</li>
	<li>
종양 크기 - DAPI 계수 - 인간 종양 세포는 매우 뚜렷한 크로마틴 조직을 나타내므로 제브라피시 세포와 쉽게 구별되며 항상 염료로 다시 검사 할 수 있습니다 (눈을 훈련 할 때),</li>
	<li>
전이성 연구를 위해,인간 세포를 명확하게 검출하기 위해 - 항인간 HLA (Abcam EP1395Y 고양이 #ab52922), 항인간 미토콘드리아 (머크 밀리포어 고양이. #MAB1273-클론 113-1).</li>
</ul>DAPI 카운터스테인링과 대조암세포 HCT116의 Z 스택(직경 10-12 μm의 평균 핵 크기)에서 슬라이스 사이에 5μm 간격을 갖는 공초점 획득을 위해, 세포의 ~50%가 2개의 연속슬라이스 사이에서 공유되는 것을 관찰하였다. 따라서 모든 슬라이스가 계산되면 동일한 셀을 두 번 계산할 위험이 높습니다. 정량화의 문제를 피하기 위해 슬라이스 사이를 오가면 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 기술이 발생합니다. 총 세포 수의 정량화를 용이하게 하고 연구자 들 간의 더 많은 재현성을 허용하기 위해, 우리는 이전에 이프로토콜8에기술된 종양 크기 공식을 만들었습니다.
우리는 슬라이스 사이에 공유 된 ~50 %의 세포를 설명하기 위해 보정 번호 (1.5)를 포함했습니다. 우리는 연구원 사이 전체 종양의 수동 계산의 평균 오류가 20%이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 포뮬러를 사용하는 두 명의 연구원은 2%의 오차를 가지고 있었습니다. 이 포뮬러의 사용은 93%의 정확도와 98%의 재현성률을 가지고 있습니다. 또한 자동화된 메서드를 테스트했지만 임계값 설정으로 인해 50% 이상의 오류를 보여 주였습니다.
세포 세포의 특성으로 인해 활성화된 Caspase 3 세포의 정량화가 더 어렵습니다. 결과의 실수와 변화의 수를 줄이기 위해, 우리는 제어 및 실험 샘플이 동일한 연구원에 의해 계산하는 것이 좋습니다. 또한,이 기술을 배울 때, 새로운 연구원은 이미 결과와 훈련을 비교하기 위해 경험이 풍부한 연구원에 의해 정량화 된 이미지를 계산해야합니다.
필요한 경우 분석의 길이를 연장할 수 있습니다. 그러나, 제브라피시 애벌레는 ~7일 후 수정(5일 후 주입)부터 생수급이 필요하다는 점을 고려하는 것이 중요하다. 또한, 6일 이상 유충에 적용되는 동물복지 지침 및 규정은 변할 수 있다.
이 프로토콜은 단일 연구원이 시간당 약 ~ 200-300 제브라피어 애벌레를 주입 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다. 분석 및 통계 해석을 포함한 전체 분석 결과에 대한 결과는 3주 만에 수득됩니다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 제브라피시 제노이식생성에 있는 전문가가 되는 것을 도울 수 있기를 바랍니다. 그것은 쉽지 않다; 연습을 해야 하지만 거기에 도착 합니다. 행운을 빌어!

Zebrafish (Danio rerio)는 발달과 질병을 연구하는 강력한 척추 동물 모델 유기체로 부상하고 있습니다. Zebrafish는 매우 보존된 유전(~70% 유전상동성 및 ~84% 질병 관련 유전자)과인간1,2와기본 기관 형태학적 특징을 공유합니다. 이 보존은 제브라피쉬를 사용하여 암3,4를포함한 여러 인간 질환을 모델링할 수 있습니다.
제브라피쉬의 취급 및 유지보수는 생쥐보다 훨씬 쉽고 비용 효율적이며, 일년 내내 높은 배설도, 외장 수정3,5로인해 더욱 효과적이다. Zebrafish 배아는 생애 첫 5-7일 동안 생수급을 필요로 하지 않으며 발달, 감염 및암1,4,6,7을위한 효과적인 모델로 사용되어 왔다. Zebrafish 배아는 48시간 후 수정(hpf)에서 부화하고 모든 장기가 형성된 자유로운 수영 동물이며, 심장과 기능순환 시스템, 간, 뇌, 신장 골수등이다. 또한, 이 단계에서는 선천성 면역만이 작용하고 있으며, 적응성 면역력이 여전히 발달하고 있어면역절돌연변이7,8을사용할 필요 없이 인간 세포의 일반적인 효율적인 이식을 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 모든 인간 세포가 동등하게9로 이식되는 것은 아니며, 예를 들어 백혈병 세포의 경우 식세포(호중구 및 대식세포)가 효율적인 생생을 위해고갈되어야 한다는 것을 보여주었다.
제브라피시 유전적 관성과 초기 배아 단계의 광학적 투명성은 고해상도로 단일 세포 내 인트라비티드 이미징을 허용하므로 다양한 생물학 분야에서 최첨단 이미징 기술을 수립할 수 있습니다. 더욱이, 암의 맥락에서, 이러한 특징은 혈관신생 및 전이성 전이성 전위, 그리고 타고난 면역계통과의상호 작용8,9,11,12,13과의상호 작용과 같은 숙주 종양 상호 작용의 초기 단계의 실시간 연구에 유용하다.
짧은 이노크소식분석에서 전이성 "진화"에 대한 시간이 없지만 종양 세포의 전이성 용량을 분석할 수 있습니다(즉, 침략, 흡폐, 순환 생존, 사치, 식민지화 와 같은 전이성 단계를 거치도록 하는 효율성, 따라서 생체 내 및 본래8,11,14)
그 수명 주기의 특성은 암에서 개인화 된 의학을위한 독특한 모델로 제브라피쉬를 배치합니다. 아세이는 짧은 시간 범위에서 수행될 수 있으며, 몇 주7,8,9,11,12,15,16에서얻은 결과를 얻을 수 있다. 이 assays의 셀러리티와 타당성은 의사와 연구원에게 시간이 필수적인 필수 인 암 환자에게 유용 할 수있는 번역 결과를 얻을 수있는 가능성을 제공합니다.
성공적인 제브라피시 배아 이종이이식생성시도가 증가하고 있음에도 불구하고, 주사 후 세포 생존가능성 및 종양 행동의 평가뿐만 아니라 주사 절차의 표준화에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이 프로토콜에서 우리는 제브라피시 배아에 있는 인간 암 세포 주사제 및 후속 고정, 면역 염색, 화상 진찰 및 종양 세포 행동의 정량화를 위한 명확하고 상세한 단계별 가이드를 연구원에게 제공합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

Zebrafish 애벌레 xenografts널리 생체 및 인간 암의 실시간 연구에서 수행 하는 암 연구에 사용 되 고. 항암 요법(화학요법, 방사선 요법 및 생물학), 혈관신생 및 단일 세포 해상도의 전이에 대한 반응을 빠르게 시각화할 수 있는 가능성은 제브라피시 이종이이식 모델을 임상 전 연구를 개발하기 위한 최고의 선택으로 배치합니다.

제브라피시 애벌레 제노이식 분석은 다른 모델에 비해 여러 가지 실험적인 이점을 제공하지만, 아마도 가장 눈에 띄는 것은 크기 규모의 감소와 결과적으로 시간입니다. 규모의 이 감소는 단하나 세포 화상 진찰을 허용하고, 상대적으로 적은 수의 인간 세포 (생검과 호환), 중간 처리량 약물 검진의 사용을 허용하지만, 가장 중요한 것은 분석의 시간의 상당한 감소를 가능하게한다. 이러한 모든 장점은 미래의 개인화 된 의학 응용 프로그램에 대한 제브라 피쉬 xenograft 분석이 매우 매력적으로 만듭니다.

많은 제브라피시 이노이식 프로토콜은 인간의 종양의 넓은 다양성으로 개발되었습니다; 그러나, 제브라피시 애벌레 제노이식을 효율적으로 생성하는 일반적이고 표준화된 프로토콜은 여전히 부족합니다. 여기서 우리는 종양 거동 분석, 전체 마운트 면역 형광 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.

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Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

여기서는 종양 거동 분석, 전산 면역형화 및 공초점 이미징 정량화를 위한 xenografts 및 지침을 생성하는 팁과 함께 단계별 프로토콜을 제공합니다.

제브라피시 애벌레 제노이식 및 종양 행동 분석의 생성

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

제브라피쉬 이종이이식은 암 연구에 널리 사용되고 있습니다. 당신은 인간의 종양 세포를 가지고 작은 애벌레 얼룩말 물고기에 주입 할 수 있습니다, 또는 성인으로. 여기서 우리가 제시하는 것은 살아있는 동물에서 여러 인간 암 특징을 연구 할 수있는 애벌레 모델의 단계별 프로토콜입니다.증식을 연구할 수 있고, 혈관신생을 연구할 수 있고, 전이를 연구할 수 있으며, 또한 종양 미세 환경 내에서 상호 작용할 수 있습니다. 그리고 가장 큰 장점은 매우 짧은 시간 프레임에서 이것을 연구 할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 불과 4 일.또 다른 큰 장점은 공초점 또는 광시트 현미경을 사용하여 단일 세포 해상도로 이 라이브를 연구할 수 있다는 것입니다. 세포가 이동하는 방법, 세포가 서로 상호 작용하는 방법, 심지어 세포가 서로 어떻게 대화하는지 연구할 수 있습니다. 그래서 암 생물학을 공부하는 것은 정말 강력한 모델입니다.Zebrafish xenografts는 화학요법, 방사선 요법, 또는 항체를 가진 표적으로 한 치료같이 항암 치료에 대한 반응을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그리고 마지막으로, 또한, 이 프로토콜은 또한 외과 견본에서 환자 유래 세포를 사용하기 위하여 적응될 수 있고, 또는 생검에서, 그 후 제브라피시 아바타를 생성합니다. 주입을 위한 설정.주입 2 주 전에, 배양에서 세포를 확장. 많은 세포와 물고기가 훈련 중에 손실되기 때문에, 기술에 능숙해질 때까지 여분의 세포와 과잉 물고기로 시작합니다. 표 중 하나는 여러 세포주 주입을 위한 체외 내 합류의 최적 비율에 대한 자세한 가이드가 있습니다.주입 3 일 전에 원하는 배경의 제브라피시를 교차합니다. 주입 24 시간 전. 제브라피시 배아 판을 청소하십시오.모든 죽은 및 비 개발 된 배아를 버리고 E3 배지를 새로 고칩니다. 세포 배양실에서, 세포 배양 배지를 폐기한다. PBS 1X로 한 번 씻고 죽은 세포를 제거하고 신선한 매체를 추가하십시오.주입 바늘, 아가로즈 플레이트 및 헤어핀과 같은 주사 절차를 위한 공구를 준비하여 주사를 위해 배아를 정렬합니다. 플레이트 준비를 위해 깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 용해된 2% 아가로즈 1층을 붓습니다. 그것은 중합하고 통치자의 도움으로, 배아의 정렬을 위해 3 ~ 4 개의 직선 아가로즈 라인을 만들 수 있습니다.주사 일. 해치되지 않은 계란에서 부화 배아를 분리합니다. 이 단계에서 배아 배지에 Pronase를 추가하면 부화가 향상 될 수 있습니다.배아를 주입 할 때까지 섭씨 28도에서 인큐베이터에 넣습니다. 주입을 위한 세포 라벨링. 재현 가능한 세포 라벨링 기술의 수립을 돕기 위해 셀라인 목록 및 여러 라벨링 솔루션의 컴파일을 위해 작성된 프로토콜 중 하나와 두 개의 테이블을 확인합니다.세포 배양 배지를 제거하고 PBS 1X로 플라스크를 두 번 세척합니다. 광질염으로 세포를 라벨, 빛에 노출을 피하고, 37도에서 플라스크를 배양. 또한 분리 시 1.5ml 마이크로 센실리후지 튜브에 셀에 라벨을 붙일 수도 있습니다.세포 라벨링 용액을 제거하고 PBS 1X로 셀을 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. 해당 분리제를 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 플라스크를 멸균 세포 스크레이퍼로 칫솔질하여 분리 과정을 용이하게 하고 혈청학적 파이펫으로 세포를 수집합니다.세포를 1.5ml 마이크로원심분리기 튜브및 원심분리기로 옮기. 상류체를 버리고 세포 배양 배지로 펠릿을 다시 중단하십시오. 트라이판 블루 배제 또는 다른 선택의 방법으로 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 생존 가능성을 정량화합니다.원심분리기 및 주사 배지에서 세포를 다시 중단한다. 매체에 있는 세포의 추천한 농도는 원고의 표 에서 찾아볼 수 있습니다. 이 시점부터 세포는 얼음 위에 보관해야 합니다.사출 절차. 트리카인 1X에서 5분 동안 배아를 마취시화합니다. 그런 다음 소량의 마취 배아를 아가로즈 플레이트로 옮기고 헤어핀 루프의 도움으로 정렬합니다.배아 사이의 거리를 유지하십시오. 특히 하나의 노른자와 다음 하나의 머리 사이에. 사망률을 방지하기 위해, 정렬 된 배아가 조심스럽게 접시에 트리사인 1X 용액의 1 ~ 3 방울을 추가하여 아가로즈 플레이트에서 건조하지 않도록하십시오.마이크로센트심분리기 튜브를 가볍게 탭하여 세포를 다시 중단합니다. 마이크로 로더 팁을 사용하여 세포 현탁액으로 주사 바늘을 역로드하여 배아의 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 기포를 피하십시오. 기압 밸브를 열고 마이크로 인젝터를 설치하고 미세 주입 바늘을 조심스럽게 홀더에 넣습니다.팁 에 가까운 미세 주입 바늘을 잘라. 조심스럽게 배아의 노른자를 관통하여 바늘의 각도를 낮추고 바늘 끝이 각면이 인식 공간에 도달할 때까지 조심스럽게 밀어 넣습니다. 팁이 인식 공간에 있으면 세포를 주입하십시오.배아의 눈크기와 유사한 세포의 양을 주입하고 심장 부종을 예방하기 위해 심장에서 가능한 한 멀리 주입하십시오. 필요한 경우 마이크로 인젝터 압력을 조정합니다. 주입된 배아를 트리카인 1X 용액으로 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 5~10분 동안 쉬게 합니다.이것은 상처가 닫히는 시간을 줄 것입니다. 트리사인 1X 용액을 제거하고 신선한 E3 배지를 추가합니다. 그런 다음, 섭씨 34도에서 배아를 배양합니다.이 온도는 제브라피시 배아와 인간 종양 세포의 생존을 허용할 것입니다. 전이성 분석. 세포주의 전이성 전위잠재력을 연구하고 싶은 경우, 약 1시간 후 주사후, 형광 스테레오현미경에 주입된 배아를 선별하고, 순환하는 암세포의 부재 또는 존재에 따라 두 그룹으로 분류하십시오.언젠가 사후 주입. 형광 스테레오 현미경에, 주의 깊게 각 배아를 분석하고 제대로 주입 종양을 가진 사람들을 선택합니다. 종양 크기에 따라 선택한 이종이 이식을 정렬합니다.비교를 위해 눈의 크기를 사용합니다. 비정상적인 형태, 심장 또는 노른자 부종, 암세포가 거의 없는 이종이이식, 또는 노른자 내부에서만 암세포를 가진 배아를 폐기하십시오. 원하는 실험 레이아웃에 따라 xenografts를 배포하고 약물 분석을 시작합니다.매일 약물과 E3 배지를 교체하십시오. xenografts를 배양하여 분석이 끝날 때까지 섭씨 34도의 온도를 유지합니다. 4 일 후 주입.분석의 마지막 날에, 트리카인 1X 용액으로 이종이 이식을 마취하고, 신중하게 한고판에 정렬합니다. 죽거나 부어 오른 제노이식을 버리십시오. 이러한 이 종이 이식은 이식 정량화에 대해 간주되지 않습니다.형광 스테레오 현미경에서 각 이종이 접목을 신중하게 분석하고 각 xenograft를 분석하고 각 지각 공간에서 종양의 부재 또는 존재를 평가합니다. 실험 적인 설정에 따르면, 관심의 xenografts를 선택 하 고 트리카인 25X로 안락사. 면역 염색을 진행하기 위해 실온에서 적어도 4 시간 동안 4 % 포름알데히드로 고정하십시오.그렇지 않으면, 섭씨 4도에서 하룻밤을 저장하고 다음 날에, 100 % 메탄올로 포름알데히드를 대체합니다. 100% 메탄올에 고정된 제노이식은 20도 무기한으로 보관할 수 있습니다. 공초점 이미징을 위한 전체 마운트 면역 염색.전체 산 면역 형광 기술은 다음과 같이 나누어 3 일이 걸립니다. 첫날은 이종이이식및 1차 항체 배큐어의 투과화를 위한 것이다. 둘째 날, 세척 및 이차 항체 배양을 위한 것입니다.그리고 셋째 날, 마운팅 매체에 제노이식 및 보관의 세척, 고정. 이 절차에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 PDF에서 확인할 수 있습니다. xenografts의 장착.커버 슬립의 가장자리를 석유 젤리 또는 실리콘 그리스로 밀봉하여 장착 매체가 누출되지 않도록 하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 이종이 접목을 커버 슬립으로 옮습니다. 조심스럽게 머리핀에 정렬합니다.마운팅 매체를 다른 커버 슬립에 추가합니다. 두 커버 슬립을 조심스럽게 결합하고 쉽게 조작 할 수 있도록 현미경 슬라이드 위에 배치하십시오. 공초점 이미징.물 보정을 갖춘 아포오틱 25X 침지 목표 렌즈는 단일 세포 해상도를 가진 이미징 종양에 최적입니다. 각 슬라이스 사이에 5미크론 간격으로 Z-Stack 함수를 사용하여 샘플을 획득합니다. 피지 소프트웨어에서 원시 데이터를 엽니 다.xenograft 당 z 스택 당 상단, 중간 및 아래에서 종양의 세 가지 대표적인 조각을 선택합니다. 피지 소프트웨어에서 셀 카운터 플러그인을 엽니 다. 셀 카운터 도구에서 초기화를 클릭하고 카운터 유형을 선택하고 이미지를 클릭하여 수동으로 계산 모드를 시작합니다.클릭 할 때마다 카운터는 셀수를 계산하는지 묻습니다. 종양내의 총 세포 수를 얻으려면 다음 수식을 사용하십시오. 면역 세포, 미토틱 수치, 활성화된 caspase와 같은 마커의 총 숫자 또는 백분율을 평가하기 위해 셀 카운터 플러그인을 사용하여 z 스택의 모든 조각을 따라 관심있는 특정 라벨링, 마커 또는 변형에 긍정적 인 세포를 수동으로 정량화합니다.일부 셀은 두 조각 사이에 위치합니다. z 스택에서 앞뒤로 이동하여 셀이 두 번 계산되지 않았는지 확인합니다. 대표적인 결과.HCT 116 대장암 세포주 이종이이식은 프로토콜에 기재된 바와 같이 생성되었다. 제노이식은 비치료 대조군 및 FOLFIRI 화학요법에서 무작위로 분포되었다. 면역형광은 핵대항전을 위해 항칸카파제-3 항체 및 DAPI를 사용하여 세포 세포를 검출하기 위해 수행되었다.미토성 지수, 세포사멸 및 종양 크기의 정량화는 FOLFIRI가 종양 크기의 54% 감소와 함께 미토시스의 현저한 감소와 세포멸증의 유의한 유도를 유도한다는 것을 밝혔다. 이러한 특징은 고처리량 의학적 증상 약물 스크린뿐만 아니라 짧은 시간 내에 여러 암 치료의 세포 내재 및 생리적 효과를 테스트하는 데 유용합니다. zebrafish xenograft 모델의 또 다른 큰 장점은 다른 종양 세포의 상호 작용을 연구하고 세포의 각 유형이 다른 사람의 행동에 영향을 미칠 수있는 방법을 분석 할 수 있다는 것입니다.상이한 인간 암세포, 동일한 종양에서 다른 클론, 또는 상이한 종양으로부터, 공동 주입될 수 있다. 이 예에서, 동일한 환자로부터 유래된 2개의 대장암 세포주들은 상이한 리포메이션 염료로 표지되고 주사를 위한 일대일 비율로 혼합하였다. 우리는 이 프로토콜이 연구원이 제브라피시 제노이식을 생성하는 실제 전문가가 되는 데 도움이 되기를 바랍니다.그것은 쉬운 일이 아니다. 연습하고 연습해야 합니다. 포기하지 마십시오.난 당신이 거기에 도착 할 거야 확신합니다. 행운을 빌어.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기 연구를 위해 면역 능력이있는 숙주 내로 Zebrafish Pediatric Brain 종양을 이식

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...