Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Agradecemos a la Fundación Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, cofinanciada por FCT/Lisboa2020) por su financiación. Becas FCT para VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Todos los miembros del Fior Lab para discusiones críticas; B. Costa y C. Rebelo de Almeida por compartir datos; y nuestros miembros del Laboratorio C. Rebelo de Almeida, M. Barroso y L. Leite por su participación en el video. Nos gustaría agradecer a cf Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) y champalimaud comunicación, eventos y alcance equipo en particular Alexandre Azinheira para la realización de películas fantásticas y Catarina Ramos y Teresa Fernandes para su ayuda.

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	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

La creciente importancia del pez cebra como modelo para el desarrollo del cáncer y la detección de fármacos ha dado lugar a numerosas publicaciones3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Sin embargo, la inyección de células cancerosas en embriones de pez cebra es una técnica que requiere un alto nivel de destreza que puede ser un desafío para los investigadores. En este protocolo pretendemos proporcionar información práctica y algunos consejos que puedan ayudar a superar los retos iniciales de la creación de xenoinjertos de embriones de pez cebra.
Manejo celular de inyección previa Este protocolo optimizado para la generación de xenoinjertos de pez cebra con líneas celulares se puede adaptar a varios tipos de células (cancerosas) con diferentes morfologías. Recomendamos que todas las líneas celulares utilizadas para xenoinjertos de pez cebra estén libres de micoplasma. A diferencia de otras contaminaciones bacterianas, la presencia de micoplasma en el cultivo celular no genera cambios que puedan ser fácilmente detectados bajo el microscopio22. La contaminación por micoplasma puede afectar el potencial de injerto de las líneas celulares, su sensibilidad a los fármacos, así como la viabilidad de los embriones de pez cebra.
Aunque las células pueden continuar proliferando durante un período prolongado, su fenotipo y genotipo pueden ser propensos a cambios. Es importante familiarizarse con la morfología y el comportamiento de las líneas celulares en cultivo. Recomendamos mantener el número de pasajes celulares después de la descongelación entre 3-12 para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, se deben realizar pruebas regulares de micoplasma.
Las células deben estar en su fase logarítmica (fase de crecimiento exponencial antes de alcanzar la confluencia ~70%) en el día de la inyección. Esto permitirá un engraftment adecuado y un desarrollo apropiado de los sellos distintivos del tumor. Para prevenir la variación en el fenotipo de células dentro del xenoinjerto, es crítico mantener la confluencia para la inyección constante entre los experimentos. El número de células inyectadas se puede adaptar a las características de cada línea celular, ya que algunas pueden requerir densidades más altas de inyección para prosperar en los embriones de pez cebra.
Consideraciones sobre el etiquetado de las células Para visualizar mejor las células tumorales humanas para su inyección y análisis futuro, las células tumorales se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes. Debido a las diferencias en tamaño celular, el número total de cells/cm2 en cultivos adherentes varía entre las líneas celulares. Esto afectará la eficacia del protocolo de tinción, así como el número de células cosechadas para inyección. Las células grandes que producen números bajos por matraz (es decir, Hs578T) o crecen en grupos (es decir, BFTC905) requerirán la agrupación de varios matrazs para un solo experimento. En este caso, la tinción de las células no debe realizarse directamente en el matraz, ya que esto causará el uso de cantidades excesivas de colorante (alto costo). Por otro lado, las células que son altamente sensibles a los ciclos excesivos de centrifugación, así como las que producen un número elevado por matraz (es decir, HCT116) pueden teñirse directamente en el matraz y luego desprenderse con EDTA /raspador de células (para obtener más información, consulte la Tabla 1).
Siempre que sea posible, en lugar de usar un enfoque enzimático, use EDTA para separar las células el día de la inyección, de modo que las células recuperen sus uniones célula-célula más rápidamente y se someten a menos pasos de centrifugación. Sin embargo, si las células son sensibles a EDTA, muy adherentes o crecen en racimos, se puede aplicar un método enzimático. La optimización de la concentración ideal para inyección, así como del medio de inyección, depende de las características de cada línea celular, por lo que podría necesitar algunos ajustes (Tabla 1).
Calibración de microinyección Contrariamente a la entrega de oligonucleótidos o fármacos en el embrión de pez cebra, una retícula no se utiliza para calibrar la aguja cuando se trabaja con líneas celulares para xenoinjertos. Después de algún tiempo durante la inyección, las células comenzarán a obstruirse, y es necesario cortar la punta de la aguja para aumentar su diámetro o cambiar la aguja por completo. Este procedimiento dificulta la calibración de la retícula.
Para abordar este problema, el número de células dispensadas está regulado por la presión de expulsión y el tiempo necesario para alcanzar un tamaño similar al ojo del embrión dentro de 1-3 pulsos. Luego, para controlar aún más el tamaño del tumor, a 1 dpi, los xenoinjertos se clasifican de acuerdo con el tamaño del tumor como se muestra en la Figura 6 B-B". Como se representa en el ejemplo de la Figura 6C, este método de clasificación es eficiente para reducir la variación de los tamaños de los tumores: si los agrupamos todos juntos (+, ++, +++) el STEV es ~doble de la clase ++(~906 células a ~422 células) y la variación del coeficiente es de ~31,9% en comparación con el 14,5% en la clase ++. Dado que la referencia para la inyección es el volumen, el número total de células varía mucho entre los tipos de celdas, dependiendo del tamaño y la forma de las celdas. Por ejemplo, las células grandes con una gran cantidad de citoplasma como el cáncer de mama Hs578T, producen tumores mucho más pequeños (~ 600 células). Además, cada línea celular requiere un número diferente de celdas. Por ejemplo, las líneas celulares de cáncer de vejiga urinaria HT29 CRC y RT112 han demostrado que cuanto mayor es el número de células inyectadas, mayor es la mortalidad del pez cebra. Por lo tanto, se necesita un período de optimización durante el desarrollo de los xenoinjertos para probar si la línea celular tiene efectos tóxicos en el embrión o requiere densidades de inyección más altas / más bajas.
Sitio de inyección Una de las discrepancias más comunes a la hora de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra es el sitio de inyección. La yema suele ser el lugar de elección para la inyección debido a su fácil accesibilidad. Sin embargo, hemos observado que las células inyectadas en la yema tienen una mayor tendencia a morir. Aunque técnicamente más difícil, recomendamos inyectar en el PVS y lo más lejos posible del corazón. Dentro del PVS, las células pueden agregar, reclutar vasos y células inmunes, y migrar, intravasar, extravasar y formar micrometastasis, si presentan características metastásicas8,11.
Eficiencia del injerto Se esperan diferencias en la eficiencia del injerto y el tamaño del tumor entre las líneas celulares a 4 dpi debido a sus distintos grados de muerte/supervivencia/proliferación de células basales, pero también debido a la inmunogenicidad innata que cada línea celular puede mostrar9.
metástasis La metástasis comprende una cascada de varios pasos de eventos que se pueden dividir en dos etapas arbitrarias. En la primera etapa, las células tumorales tienen que desprenderse del sitio primario, migrar e invadir los tejidos adyacentes y luego intravasar en el torrente sanguíneo. En la segunda etapa, las células tumorales deben sobrevivir en circulación, extravasarse de la sangre o de los vasos linfáticos, y finalmente colonizar en sitios secundarios23. Para distinguir entre estos eventos tempranos y tardíos y abordar el potencial / competencia de las diferentes células tumorales para realizar estos pasos, diseñamos un ensayo simple.
En general, cuando se inyectan en el PVS, las células tumorales pueden entrar directamente en circulación y luego quedar atrapadas físicamente en el tejido hematopoyético caudal (CHT) (región de la cola). Sin embargo, de acuerdo con las características de cada célula tumoral, hemos visto que algunas células tumorales permanecen en el CHT 4 dpi y son capaces de formar micrometastasis mientras que otras células tumorales desaparecen (despejadas después de quedar atrapadas en el CHT).
Por lo tanto, comparando la eficiencia de la micrometastasis (a 4 dpi) cuando las células se colocaron directamente en circulación - CIRC (las células sólo tienen que pasar por los últimos pasos de la metástasis) vs. cuando no - NO CIRC (las células necesitan pasar por pasos tempranos y tardíos para poder formar una micrometastasis) podemos evaluar su potencial metastásico temprano o tardío. Hemos observado células tumorales que pueden formar eficientemente micrometastasis en el CHT en ambos grupos (CIRC y NO CIRC), lo que sugiere que estas células tienen la capacidad de someterse a todas las etapas de la cascada metastásica (SW480 y MDA-MB-468 por ejemplo)8,11. Por el contrario, otras células tumorales tienen un potencial metastásico muy bajo en ambos grupos, casi nunca haciendo micrometastasis, incluso cuando se inyectan en circulación (es decir, visibles en el CHT a 24 hpi, pero a 4 dpi ya no están allí, Hs578T por ejemplo)8. Sin embargo, hemos encontrado claramente otro grupo - uno que es solamente capaz de formar micrometastasis cuando está inyectado en la circulación (podemos observar solamente micrometastasis en el grupo de CIRC). Esto sugiere que estas células tienen una baja eficiencia en la realización de los primeros pasos de la cascada metastásica, pero por otro lado son capaces de sobrevivir en circulación, extravasar y colonizar un sitio distante.
Inmunostaining e imágenes Antes de la fijación, este protocolo de inyección se puede utilizar para otros enfoques de imágenes en vivo como microscopía de contraste de interferencia diferencial en vivo (DIC), microscopía de disco giratorio, imágenes confocales en vivo de alta resolución y microscopía de láminas de luz, etc.
Las células muertas y los desechos celulares aparecen brillantes cuando se observan a través del estereomicroscopio fluorescente y pueden confundirse con células vivas, especialmente si el objetivo del estudio es evaluar el potencial metastásico de las líneas celulares. Quisiéramos tensionar la importancia de realizar proyección de imagen confocal con los marcadores específicos de la viabilidad y DAPI para evaluar el estado de supervivencia del tumor y del micrometastasis. Además, es fundamental utilizar anticuerpos humanos específicos para detectar células humanas como las mitocondrias antihumanas o el HLA antihumano. Al implementar el protocolo, entrene los ojos del experimentador comparando la tinción en el esteremicroscopio con las imágenes confocales. Después de algún tiempo, los experimentadores pueden distinguir claramente los desechos de las células vivas en el estereomicroscopio fluorescente.
Aunque otros métodos para cuantificar carga del tumor tales como área entera de la fluorescencia sean ampliamente utilizados, recomendamos realizar immunostaining del montaje entero y proyección de imagen confocal como método más exacto. No sólo la eficiencia de la tinción de colorantes lipofílicos es muy variable (es decir, algunas células están muy bien teñidas, mientras que otras no lo están - probablemente debido al contenido de lípidos de sus membranas), sino que también muchas veces los tintes lipofílicos forman agregados, y las células muertas tienden a ser más brillantes - creando varios artefactos que se pueden confundir con células vivas.
Las células se pueden transducir con proteínas fluorescentes para ayudar en su seguimiento y omitir el etiquetado celular. Sin embargo, asegúrese de que las células transducidas y no transducidas producen los mismos resultados en los xenoinjertos de pez cebra.
Además, los macrófagos pueden fagocitos estos restos de células fluorescentes que se etiquetan fluorescentemente y migran, generando falsos positivos en células metastásicas. Por lo tanto, recomendamos una serie de herramientas analíticas, que por supuesto se pueden extender a muchas otras lecturas para una interpretación más precisa del comportamiento del tumor:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Proliferación - cuantificación de figuras mitóticas con DAPI o anticuerpo anti-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Muerte celular por apoptosis- anticuerpo anti-activado Caspasa3Asp175 (Tecnologías de Señalización Celular Cat. #9661) o equivalente,</li>
	<li>
Tamaño del tumor - conteo de DAPI: las células tumorales humanas muestran una organización de cromatina muy distinta, por lo que se distinguen fácilmente de las células del pez cebra y siempre es posible verificarlas dos veces con el tinte (cuando está entrenando su ojo),</li>
	<li>
Para estudios metastásicos,para detectar inequívocamente células humanas, - HLA anti-humano (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), mitocondrias anti-humanas (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clon 113-1).</li>
</ul>Para una adquisición confocal con intervalo de 5 μm entre rebanadas en la pila Z de las células cancerosas control HCT116 (tamaño nuclear promedio de 10-12 μm de diámetro) con dapi counterstaining, hemos observado que ~ 50% de las células se comparten entre dos rebanadas consecutivas. Por lo tanto, si se cuenta cada sector, existe un alto riesgo de contar las mismas celdas dos veces. Ir y venir entre rebanadas para evitar problemas en la cuantificación da como resultado una técnica lenta y propensa a errores. Para facilitar la cuantificación del número total de células y permitir una mayor reproducibilidad entre los investigadores, creamos la fórmula de tamaño tumoral previamente descrita en este protocolo8.
Incluimos un número de corrección (1.5) para tener en cuenta las celdas de ~ 50% compartidas entre las rebanadas. Encontramos que el error medio de la cuenta manual del tumor entero entre los investigadores era el 20%. Dos investigadores que utilizaron la fórmula tuvieron un error del 2%. El uso de esta fórmula tiene una tasa de precisión del 93% y una tasa de reproducibilidad del 98%. También probamos métodos automatizados, pero demostraron un error superior al 50% causado por la configuración del umbral.
Debido a las características de las células apoptóticas, la cuantificación de las células caspasa 3 activadas es más difícil. Para reducir el número de errores y la variación en los resultados, se recomienda que las muestras de control y experimentales sean contadas por el mismo investigador. Además, al aprender esta técnica, un nuevo investigador debe contar imágenes que ya fueron cuantificadas por investigadores más experimentados para comparar resultados y entrenar.
La longitud del ensayo se puede ampliar si es necesario. Sin embargo, es importante tener en cuenta que las larvas de pez cebra requieren alimentación viva a partir de ~ 7 días después de la fertilización (5 días después de la inyección). Además, las pautas y regulaciones de bienestar animal aplicadas a las larvas mayores de 6 días después de la fertilización pueden variar.
Este protocolo proporciona herramientas útiles para permitir que un solo investigador inyecte aproximadamente ~ 200-300 larvas de pez cebra por hora; y los resultados para el ensayo completo, incluido el análisis y la interpretación estadística, obtenidos en tres semanas. Esperamos que este protocolo pueda ayudar a los investigadores a convertirse en expertos en la generación de xenoinjertos de pez cebra. No es fácil; necesitas practicar pero llegarás allí. ¡Buena suerte!

El pez cebra (Danio rerio) está emergiendo como un poderoso organismo modelo de vertebrados para estudiar el desarrollo y la enfermedad. El pez cebra comparte características genéticas altamente conservadas (~70% de homología genética y ~84% genes relacionados con enfermedades) y características morfológicas básicas de órganos con los humanos1,2. Esta conservación permite el uso del pez cebra para modelar varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer3,4.
El manejo y mantenimiento del pez cebra es mucho más fácil y rentable que los ratones debido a su pequeño tamaño, alta fecundidad durante todo el año y fertilización externa3,5. Los embriones de pez cebra no requieren alimentación viva durante sus primeros 5-7 días de vida y se han utilizado como un modelo eficaz para el desarrollo, la infección y el cáncer1,4,6,7. Los embriones de pez cebra eclosionan a las 48 horas después de la fertilización (hpf) y son animales que nadan libremente con todos los órganos formados, un corazón latiendo y un sistema circulatorio funcional, hígado, cerebro, médula renal, etc.1,3. Además, en esta etapa de desarrollo sólo la inmunidad innata está en juego, la inmunidad adaptativa todavía se está desarrollando, lo que permite un injerto general eficiente de las células humanas sin necesidad de uso de mutantes inmunocomprometidos7,8. Sin embargo, es importante señalar que no todas las células humanas se injerten por igual9 y que, por ejemplo, para las células leucémicas se demostró que los fagocitos (neutrófilos y macrófagos) necesitan ser agotados para un injerto eficiente10.
La capacidad de tracción genética del pez cebra y la transparencia óptica de sus primeras etapas embrionarias permiten obtener imágenes intravitales unicelulares a una alta resolución y, por lo tanto, para el establecimiento de técnicas de imagen de vanguardia en diversos campos de la biología. Además, en el contexto del cáncer, estas características son útiles para estudios en tiempo real de las primeras etapas de las interacciones huésped-tumor, como el estudio del potencial angiogénico y metastásico, así como las interacciones con el sistema inmune innato8,9,11,12,13.
Aunque en el ensayo de xenoinjerto corto no hay tiempo para la "evolución" metastásica, es posible analizar la capacidad metastásica de las células tumorales (es decir, su eficiencia para pasar por pasos metastásicos como invasión, intravasación, supervivencia en circulación, extravasación y colonización, y por lo tanto estudiar estos procesos in vivo y en tiempo real8,11,13,14).
Las características de su ciclo de vida sitúan al pez cebra como un modelo único de medicina personalizada en cáncer. Los ensayos se pueden realizar en un lapso de tiempo más corto y los resultados se obtienen en unas pocas semanas7,8,9,11,12,15,16. La celeridad y viabilidad de estos ensayos proporcionan a médicos e investigadores la posibilidad de obtener resultados traslacionales que pueden ser útiles para los pacientes con cáncer, para quienes el tiempo es una necesidad esencial.
A pesar de los crecientes intentos de generar xenoinjertos de embriones de pez cebra exitosos, todavía hay una necesidad de la estandarización del procedimiento de inyección, así como la evaluación de la viabilidad celular y el comportamiento del tumor después de la inyección.
En este protocolo proporcionamos a investigadores una guía paso a paso clara y detallada para la inyección de líneas celulares humanas del cáncer en embriones del pez cebra y la fijación subsecuente, immunostaining, proyección de imagen, y cuantificación del comportamiento de la célula del tumor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

Xenoinjertos larvales de pez cebra están siendo ampliamente utilizados para la investigación del cáncer para realizar estudios in vivo y en tiempo real del cáncer humano. La posibilidad de visualizar rápidamente la respuesta a las terapias anticáncer (quimio, radioterapia y biológicos), angiogénesis y metástasis con resolución unicelular, coloca al xenoinjerto de pez cebra como una de las mejores opciones para desarrollar estudios preclínicos.

El ensayo de xenoinjerto larval de pez cebra presenta varias ventajas experimentales en comparación con otros modelos, pero probablemente la más llamativa es la reducción de tamaño de escala y consecuentemente de tiempo. Esta reducción de escala permite la obtención de imágenes unicelulares, el uso de un número relativamente bajo de células humanas (compatible con biopsias), exámenes de detección de fármacos de rendimiento medio-alto, pero lo más importante permite una reducción significativa del tiempo del ensayo. Todas estas ventajas hacen que el ensayo de xenoinjerto de pez cebra sea extremadamente atractivo para futuras aplicaciones de medicina personalizada.

Muchos protocolos del xenoinjerto del pez cebra se han desarrollado con una amplia diversidad de tumores humanos; sin embargo, todavía falta un protocolo general y estandarizado para generar eficientemente xenoinjertos larvales de pez cebra. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

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Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Xenoinjertos de pez cebra están siendo ampliamente utilizados para la investigación del cáncer. Puede tomar células tumorales humanas e inyectarlo en pequeñas larvas de pez cebra, o incluso en adultos. Aquí, lo que estamos presentando es un protocolo paso a paso del modelo larval, donde podemos estudiar varios sellos de cáncer humano en un animal vivo.Se puede estudiar la proliferación, se puede estudiar la angiogénesis, se puede estudiar la metástasis, y también las interacciones dentro del microambiente tumoral. Y una gran ventaja es que se puede estudiar esto en un período de tiempo muy corto. Solo cuatro días, por ejemplo.Otra gran ventaja es que se puede estudiar este vivo con resolución unicelular, utilizando un microscopio confocal o de lámina de luz. Usted puede estudiar cómo las células migran, cómo las células interactúan entre sí, o incluso cómo se hablan entre sí. Así que es un modelo muy poderoso para estudiar la biología del cáncer.Los xenoinjertos de pez cebra se pueden usar para estudiar la respuesta a las terapias contra el cáncer, como la quimioterapia, la radioterapia o incluso las terapias dirigidas con anticuerpos. Y por último, también, este protocolo también se puede adaptar para utilizar células derivadas del paciente de una muestra quirúrgica, o incluso de biopsias, y luego generar los avatares del pez cebra. Configuración para inyección.Dos semanas antes de la inyección, expandir las células en cultivo. Comience con el exceso de células y el exceso de peces hasta llegar a ser competente con la técnica, ya que muchas células y peces se perderán durante el entrenamiento. La tabla uno del PDF adjunto tiene una guía detallada de los porcentajes óptimos de confluencia in vitro para inyección de varias líneas celulares.Tres días antes de la inyección, cruzar el pez cebra del fondo deseado. 24 horas antes de la inyección. Limpie las placas de embriones de pez cebra.Deseche todos los embriones muertos y no desarrollados y actualice el medio E3. En la sala de cultivo celular, deseche el medio de cultivo celular. Lavar una vez con PBS 1X para eliminar las células muertas y añadir el medio fresco.Prepare las herramientas para el procedimiento de inyección, como agujas de microinyección, placas de agarosa y horquillas para alinear los embriones para la inyección. Para la preparación del plato, vierta una capa de agarosa disuelta al 2% en la tapa de una placa de Petri limpia. Déjalo polimerizar y con la ayuda de una regla, haz de tres a cuatro líneas rectas de agarosa para la alineación de los embriones.Día de la inyección. Separe los embriones eclosionados de los huevos no incubados. La adición de pronasa al medio embrionario en esta etapa puede aumentar la eclosión.Coloque los embriones en la incubadora a 28 grados Centígrados hasta la inyección. Etiquetado celular para inyección. Para ayudar en el establecimiento de una técnica de etiquetado celular reproducible, revise las tablas uno y dos del protocolo escrito para una compilación de una lista de líneas celulares y varias soluciones de etiquetado.Retire el medio de cultivo celular y lave el matraz dos veces con PBS 1X. Etiquete las células con un tinte lipofílico, evitando la exposición a la luz, e incube el matraz a 37 grados. También puede optar por etiquetar las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml al desprendimiento.Retire la solución de etiquetado celular y lave las células con PBS 1X para eliminar el exceso de tinte. Agregue el agente de desprendimiento correspondiente e incube las células a 37 grados Centígrados. Facilitar el proceso de desprendimiento cepillando el matraz con un raspador de células estériles y recoger las células con una pipeta serológica.Transferir las células a 1,5 ml de tubos de microcentrífuga y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con medio de cultivo celular. Cuantifique la viabilidad celular utilizando una cámara Neubauer con exclusión de azul tripano u otro método de elección.Centrifugar y volver a suspender las células en el medio de inyección. Las concentraciones recomendadas de células en medio se pueden encontrar en la tabla uno del manuscrito. A partir de este punto, las células deben mantenerse en el hielo.Procedimientos de inyección. Anestesiar los embriones en tricaína 1X durante 5 minutos. Luego, transfiera una pequeña cantidad de embriones anestesiados a una placa de agarosa y alinee con la ayuda de un lazo de horquilla.Asegúrese de mantener la distancia entre los embriones. Sobre todo entre la yema de uno y la cabeza del siguiente. Para prevenir la mortalidad, asegúrese de que los embriones alineados no se sequen en la placa de agarosa agregando cuidadosamente una a tres gotas de solución de tricaína 1X a la placa.Toque ligeramente el tubo de microcentrífuga para volver a suspender las células. Retrocargue la aguja de inyección con una suspensión celular utilizando una punta de Microcargador, evitando burbujas de aire, ya que pueden comprometer la integridad de los embriones. Abra la válvula de presión de aire, configure el microinyector y coloque cuidadosamente la aguja de microinyección en el soporte.Corte la aguja de microinyección cerca de la punta. Perfore cuidadosamente la yema del embrión, bajando el ángulo de la aguja y empujando cautelosamente hasta que la punta de la aguja alcance el espacio de la perivitelina. Una vez que la punta está en el espacio de perivitelina, inyecte las células.Trate de inyectar un volumen de células similar al tamaño del ojo del embrión, y lo más lejos posible del corazón para prevenir el edema cardíaco. Ajuste la presión del microinyector, si es necesario. Transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri limpia con solución tricaína 1X y déjelos descansar durante cinco a 10 minutos.Esto le dará tiempo a la herida para cerrarse. Retire la solución tricaine 1X y agregue el medio E3 fresco. Luego, incuba los embriones a 34 grados Centígrados.Esta temperatura permitirá la supervivencia tanto de los embriones de pez cebra como de las células tumorales humanas. Ensayo metastásico. Si desea estudiar el potencial metastásico de sus líneas celulares, alrededor de una hora después de la inyección, examine los embriones inyectados en un esteremicroscopio de fluorescencia y clíquelos en dos grupos de acuerdo con la ausencia o presencia de células cancerosas en circulación.Un día después de la inyección. En un estereomicroscopio de fluorescencia, analice cuidadosamente cada embrión y seleccione aquellos con tumores inyectados correctamente. Ordene los xenoinjertos seleccionados según el tamaño del tumor.Utilice el tamaño del ojo para la comparación. Deseche cualquier embrión con morfología anormal, edema cardíaco o de yema de yema, xenoinjertos con muy pocas células cancerosas o aquellos con células cancerosas solo dentro de la yema. Distribuya los xenoinjertos de acuerdo con el diseño experimental deseado y comience el ensayo de fármacos.Reemplace los medicamentos y el medio E3 diariamente. Incubar los xenoinjertos, manteniendo la temperatura de 34 grados centígrados hasta el final del ensayo. Cuatro días después de la inyección.En el último día del ensayo, anestesiar los xenoinjertos con solución de tricaina 1X, y alinearlos cuidadosamente en la placa de agar. Deseche cualquier xenoinjerto muerto o hinchado. Estos xenoinjertos no se consideran para la cuantificación del injerto.En un estereomicroscopio de fluorescencia, analice cuidadosamente cada xenoinjerto y evalúe la ausencia o presencia de tumores en el espacio de la perivitelina. Según la configuración experimental, seleccione los xenoinjertos de interés y eutanasiarlos con tricaine 25X. Fijarlos en formaldehído al 4% durante al menos 4 horas a temperatura ambiente para proceder con la inmunotensación.De lo contrario, guarde durante la noche a cuatro grados centígrados y al día siguiente, reemplace el formaldehído con 100% metanol. Los xenoinjertos fijados en 100% metanol se pueden almacenar a 20 grados indefinidamente. Montaje entero immunostaining para la proyección de imagen confocal.La técnica de inmunofluorescencia de montaje completo dura tres días, divididos de la siguiente manera. El primer día es para la permeabilización de los xenoinjertos y la incubación de anticuerpos primarios. El segundo día, para lavado e incubación secundaria de anticuerpos.Y el tercer día, para lavado, fijación de xenoinjertos y almacenamiento en el medio de montaje. Se pueden encontrar más detalles de este procedimiento en el PDF adjunto. Montaje de xenoinjertos.Selle los bordes de un resbalón de cubierta con vaselina o grasa de silicona, para que el medio de montaje no se escape. Usando una pipeta Pasteur, transfiera los xenoinjertos al resguardo de la cubierta. Alinee cuidadosamente con una horquilla.Agregue el medio de montaje a otro resbalón de la cubierta. Únase cuidadosamente ambos resbalones de la cubierta y colótelos encima de un portaobjetos de microscopio para permitir una manipulación más fácil. Imágenes confocales.Una lente objetivo de inmersión apocromática 25X con corrección de agua es óptima para los tumores de imagen con una resolución unicelular. Adquiera las muestras utilizando la función Z-Stack con un intervalo de cinco micras entre cada rebanada. Abra los datos sin procesar en el software de Fiji.Seleccione tres rebanadas representativas del tumor en la parte superior, media e inferior, por pila z, por xenoinjerto. Abra el plugin Cell Counter del software de Fiji. En la herramienta Contador de celdas, haga clic en Inicializar, seleccione un tipo de contador y haga clic en la imagen para iniciar el modo de recuento manualmente.Por cada clic, el contador pregunta cuántas celdas se cuentan. Para obtener el número total de células en el tumor, use la siguiente fórmula. Para evaluar el número total o porcentaje de marcadores, como células inmunes, figuras mitóticas, caspasa activada, entre otros, cuantificar manualmente las células que son positivas para el etiquetado específico, marcador o transgén de interés a lo largo de todas las rebanadas de la z-stack con el plugin Cell Counter.Tenga en cuenta que algunas celdas se ubicarán entre dos sectores. Ir y venir en la pila z para asegurarse de que no se cuenta ninguna celda dos veces. Resultados representativos.Los xenoinjertos colorrectales de la variedades de células del cáncer de HCT 116 fueron generados según lo descrito en el protocolo. Xenografts fue distribuido aleatoriamente en controles no-tratados y quimioterapia de FOLFIRI. La inmunofluorescencia fue realizada para detectar las células apoptotic, usando el anticuerpo anti-hendido caspase-3 y DAPI para counterstaining nucleic.La cuantificación del índice mitótico, del apoptosis, y del tamaño de tumor, reveló que FOLFIRI induce una disminución significativa de la mitosis y de una inducción significativa del apoptosis, acompañada por una reducción del 54% del tamaño de tumor. Estas características son útiles en pantallas fenotípicas de alto rendimiento de drogas, así como para probar los efectos intrínsecos y fisiológicos de la célula de varios tratamientos contra el cáncer en un corto período de tiempo. Otra gran ventaja del modelo xenoinjerto de pez cebra es que es posible estudiar las interacciones de diferentes células tumorales y analizar cómo cada tipo de célula puede influir en el comportamiento de la otra.Se pueden coinyectar diferentes células cancerosas humanas, diferentes clones del mismo tumor o de diferentes tumores. En este ejemplo, dos variedades de células colorrectales del cáncer derivadas del mismo paciente fueron etiquetadas con diversos tintes lipofílicos y mezcladas en un ratio de uno a uno para la inyección. Esperamos que este protocolo pueda ayudar a los investigadores a convertirse en verdaderos expertos en la generación de xenoinjertos de pez cebra.No es fácil. Necesitas practicar, practicar. No te rindas.Estoy seguro de que llegarás allí. Buena suerte.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Evaluación preclínica de la bioactividad de la OT48 contra el cáncer de la cumarina por esferoides, ensayos de formación de Colonia y xenoinjertos de pez cebra

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...