Name: generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Champalimaud Vakfı'na, Congento'ya (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, FCT/Lisboa2020 tarafından ortaklaşa finanse edilmektedir) finansman için teşekkür ederiz. BAŞKAN Yardımcısı (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018) için FCT bursları. Eleştirel tartışmalar için Fior Laboratuvarı'nın tüm üyeleri; B. Costa ve C. Rebelo de Almeida veri paylaşımı için; ve Laboratuvar üyelerimiz C. Rebelo de Almeida, M. Barroso ve L. Leite videoya katılımlarından dolayı. Cf Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro ve diğerleri) ve Champalimaud İletişim, Etkinlikler ve Sosyal Yardım ekibine özellikle Alexandre Azinheira'ya fantastik film yapımı için ve Catarina Ramos ve Teresa Fernandes'e yardımları için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Little+Fish,+Big+Data:+Zebrafish+as+a+Model+for+Cardiovascular+and+Metabolic+Disease.">Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease.</a> Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).</li><li>Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eyes+on+zebrafish.">All eyes on zebrafish.</a> Lab Animals. 46, 323-326 (2017).</li><li>Novoa, B., Figueras, A., Lambris, J. D., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+Model+for+the+Study+of+Inflammation+and+the+Innate+Immune+Response+to+Infectious+Diseases.">Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases.</a> Current Topics in Innate Immunity II. , 253-275 (2012).</li><li>Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient+avatars+in+cancer+biology+and+precision+cancer+therapy.">Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).</li><li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts.">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).</li><li>P&#243;voa, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+evasion+revealed+in+a+colorectal+zebrafish+xenograft+model.">Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model.</a> Nature Communications. 12, 1156 (2021).</li><li>Galletti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Macrophages+Sensitizes+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+to+Apoptosis+and+Inhibits+Disease+Progression.">Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression.</a> Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).</li><li>Rebelo de Almeida, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+fast+screening+platform+for+bevacizumab+cancer+therapy.">Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy.</a> Communications Biology. 3, 1-13 (2020).</li><li>Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Xenografts+Unveil+Sensitivity+to+Olaparib+beyond+BRCA+Status.">Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status.</a> Cancers. 12, 1769 (2020).</li><li>Osmani, N., Goetz, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+Imaging+of+Metastasis+in+Zebrafish.">Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish.</a> Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).</li><li>Hyenne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Fate+of+Tumor+Extracellular+Vesicles+at+High+Spatiotemporal+Resolution+Using+the+Zebrafish+Embryo.">Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo.</a> Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).</li><li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+zebrafish+avatars+as+radiotherapy+sensitivity+reporters+-+towards+personalized+medicine.">Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine.</a> EBioMedicine. 51, 102578 (2020).</li><li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Avatars+towards+Personalized+Medicine-A+Comparative+Review+between+Avatar+Models.">Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models.</a> Cells. 9, 293 (2020).</li><li>TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE">https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</a> (2021)</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Xenograft+Model+in+Zebrafish+for+High-Resolution+Investigating+Dynamics+of+Neovascularization+in+Tumors.">A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors.</a> Plos One. , (2011).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7, 745-754 (2014).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Age+of+Chemical+Screening+in+Zebrafish.">The New Age of Chemical Screening in Zebrafish.</a> Zebrafish. 7, 1 (2010).</li><li>Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.invivogen.com/review-mycoplasma">https://www.invivogen.com/review-mycoplasma</a> (2016)</li><li>van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutation Research. 728, 23-34 (2011).</li></ol>

Zebra balığının kanser gelişimi ve ilaç taraması için bir model olarak artan önemi, çok sayıda yayınla sonuçlandı3, 4,7,13,14,16,18,19,20,21. Bununla birlikte, zebra balığı embriyolarına kanser hücrelerinin enjekte edilmesi, araştırmacılar için zorlayıcı olabilecek yüksek düzeyde el becerisi gerektiren bir tekniktir. Bu protokolde, zebra balığı embriyo ksinograftlarının kurulmasının ilk zorluklarının üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek pratik bilgiler ve bazı ipuçları sağlamayı amaçlıyoruz.
Hücre işleme öncesi enjeksiyon Hücre hatlarına sahip zebra balığı ksinograftlarının üretimi için optimize edilmiş bu protokol, farklı morfolojilere sahip çeşitli (kanser) hücre türlerine uyarlanabilir. Zebra balığı ksinograftları için kullanılan tüm hücre hatlarının mikoplazma içermemesi tavsiye ediyoruz. Diğer bakteriyel kontaminasyonların aksine, hücre kültüründe mikoplazmanın varlığı mikroskop altında kolayca tespit edilebilen değişiklikler oluşturmaz22. Mikoplazma kontaminasyonu hücre hatlarının engraftasyon potansiyelini, ilaçlara duyarlılıklarını ve zebra balığı embriyolarının canlılığını etkileyebilir.
Hücreler uzun süre çoğalmaya devam etse de, fenotipleri ve genotipleri değişikliklere eğilimli olabilir. Kültürdeki hücre çizgilerinin morfolojisine ve davranışına aşina olmak önemlidir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için 3-12 arasında çözdükten sonra hücre pasajı sayısını korumanızı öneririz. Bu nedenle düzenli mikoplazma testleri yapılmalıdır.
Hücreler günlük aşamasında olmalıdır (birışıklığa ulaşmadan önce üstel büyüme aşaması ~%70) enjeksiyon gününde. Bu, tümörün ayırt edici özelliklerinin yeterli bir şekilde bir şekilde ele edilmesini ve uygun şekilde gelişmesini sağlayacaktır. Ksinograft içindeki hücrelerin fenotipinde varyasyonu önlemek için, deneyler arasında enjeksiyon sabiti için birleştiği yer kritik öneme sahiptir. Enjekte edilen hücrelerin sayısı, zebra balığı embriyolarında gelişmek için daha yüksek enjeksiyon yoğunlukları gerektirebileceğinden, her hücre hattının özelliklerine uyarlanabilir.
Hücre etiketlemeyle ilgili önemli noktalar Enjeksiyon ve ileride yapılacak analizler için insan tümör hücrelerini daha iyi görselleştirmek için tümör hücreleri floresan boyalarla etiketlenebilir. Hücresel boyuttaki farklılıklar nedeniyle, yapışan kültürlerdeki toplam hücre/cm2 sayısı hücre çizgileri arasında değişmektedir. Bu, boyama protokolünün etkinliğini ve enjeksiyon için hasat edilen hücre sayısını etkileyecektir. Şişe başına düşük sayılar veren (örneğin, Hs578T) veya kümeler halinde büyüyen büyük hücreler (örneğin, BFTC905) tek bir deneme için birkaç şişenin birikmesini gerektirir. Bu durumda, hücrelerin boyanması doğrudan şişede yapılmamalıdır, çünkü bu aşırı miktarda boya kullanımına neden olacaktır (yüksek maliyet). Öte yandan, aşırı santrifüjleme döngülerine ve şişe başına yüksek sayılar veren hücrelere (yani HCT116) doğrudan şişede boyanabilir ve daha sonra EDTA/ hücre kazıyıcı ile ayrılabilir (Daha fazla bilgi için bkz. Tablo 1).
Mümkün olduğunda, enzimatik bir yaklaşım kullanmak yerine, enjeksiyon gününde hücreleri ayırmak için EDTA'yı kullanın, böylece hücreler hücre hücre bağlantılarını daha hızlı bir şekilde kurtarır ve daha az santrifüjleme adımlarına maruz kalırlar. Bununla birlikte, hücreler EDTA'ya duyarlıysa, kümelerde çok yapışır veya büyür - enzymatic bir yöntem uygulanabilir. Enjeksiyon için ideal konsantrasyonun ve enjeksiyon ortamının optimizasyonu her hücre hattının özelliklerine bağlıdır, bu nedenle bazı ayarlamalara ihtiyaç duyabilir (Tablo 1).
Mikroenjeksiyon kalibrasyonu Zebra balığı embriyosuna oligonükleotidlerin veya ilaçların verilmesinin aksine, ksinograftlar için hücre hatlarıyla çalışırken iğneyi kalibre etmek için bir graticule kullanılmaz. Enjeksiyon sırasında bir süre sonra, hücreler tıkanmaya başlayacaktır ve çapını artırmak veya iğneyi tamamen değiştirmek için iğnenin ucunu kesmek gerekir. Bu prosedür graticule kalibrasyonunu engeller.
Bu sorunu gidermek için, dağıtılan hücre sayısı, 1-3 darbe içinde embriyo gözüne benzer bir boyuta ulaşmak için gereken basınç ve süre ile düzenlenir. Daha sonra tümör boyutunu daha fazla kontrol etmek için 1 dpi'de ksinograftlar Şekil 6 B-B"degösterildiği gibi tümör büyüklüğüne göre sıralanır. Şekil 6C örneğinde belirtildiği gibi, bu sıralama yöntemi tümör boyutlarının varyasyonunun azaltılmasında etkilidir: hepsini bir araya alırsak (+, ++, +++ ) STEV ++sınıfının ~iki katıdır (~906 hücreden ~422 hücreye) ve katsayı varyasyonu ++sınıfında %14,5'e kıyasla ~%31,9'dur. Enjeksiyon referansı hacim olduğundan, toplam hücre sayısı hücre tipleri arasında çok değişir - hücrelerin boyutuna ve şekline bağlı olarak. Örneğin, meme kanseri Hs578T gibi çok fazla sitoplazman olan büyük hücreler çok daha küçük tümörler üretir (~600 hücre). Ayrıca, her hücre satırı farklı sayıda hücre gerektirir. Örneğin, HT29 CRC ve RT112 idrar kesesi kanseri hücre hatları, enjekte edilen hücre sayısı ne kadar yüksekse zebra balığı mortalitesinin de o kadar yüksek olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, hücre hattının embriyoda toksik etkileri olup olmadığını veya enjeksiyonun daha yüksek / daha düşük yoğunluklarını gerektirip gerektirmediğini test etmek için ksenograftları geliştirirken bir optimizasyon süresine ihtiyaç vardır.
Enjeksiyon bölgesi Zebra balığı embriyo ksinograftları üretirken en yaygın tutarsızlıklardan biri enjeksiyon yeridir. Yumurta sarısı, kolay erişilebilirliği nedeniyle genellikle enjeksiyon için tercih olunacak yerdir. Bununla birlikte, yumurta sarısına enjekte edilen hücrelerin ölme eğiliminin daha yüksek olduğunu gözlemledik. Teknik olarak daha zor olsa da, PVS'ye ve kalpten mümkün olduğunca enjekte etmenizi öneririz. PVS içinde, hücreler metastatik özellikler8,11görüntülerlerse, damarları ve bağışıklık hücrelerini toplayabilir, toplayabilir ve göç edebilir, intravazat, ekstravazat ve mikrometastaz oluşturabilir.
Engraftment verimliliği 4 dpi'deki hücre hatları arasında engraftasyon verimliliği ve tümör boyutundaki farklılıklar, farklı derecelerde bazal hücre ölümü / sağkalım / çoğalması nedeniyle ve aynı zamanda her hücre hattının gösterebileceği doğuştan gelen immünojeniklik nedeniyle beklenmektedir9.
metastaz Metastaz, iki rasgele aşamaya ayrılabilen çok düzeyli bir olay basamaklamadan oluşur. İlk aşamada, tümör hücreleri birincil bölgeden ayırmak, bitişik dokuları göç etmek ve istila etmek ve daha sonra kan dolaşımına intravazat yapmak zorunda. İkinci aşamada, tümör hücreleri dolaşımda hayatta kalmalı, kan veya lenfatik damarlardan ekstravaze olmalı ve son olarak ikincil bölgelerde kolonileşmelidir23. Bu erken ve geç olayları ayırt etmek ve farklı tümör hücrelerinin bu adımları gerçekleştirme potansiyelini/yeterliliğini ele almak için basit bir tahlil tasarladık.
Genel olarak, PVS'ye enjekte edildiğinde, tümör hücreleri doğrudan dolaşıma girebilir ve daha sonra kaudal hematopoetik dokuya (CHT) (kuyruk bölgesi) fiziksel olarak hapsolabilir. Bununla birlikte, her tümör hücresinin özelliklerine göre - bazı tümör hücrelerinin CHT 4 dpi'de kaldığını ve diğer tümör hücreleri kaybolurken mikrometastaz oluşturabildiğini gördük (CHT'ye yakalandıktan sonra temizlendi).
Bu nedenle, hücrelerin doğrudan dolaşıma yerleştirilecekleri mikrometastaz verimliliğini (4 dpi'de) karşılaştırarak - CIRC (hücreler sadece metastazın geç adımlarından geçmek zorunda) ve olmadığında - ÇKS YOK (hücrelerin mikrometaz oluşturabilmek için erken ve geç adımlardan geçmesi gerekir) erken veya geç metastatik potansiyellerini değerlendirebiliriz. Her iki grupta da CHT'de verimli bir şekilde mikrometastaz oluşturabilen tümör hücrelerini gözlemledik (CIRC ve NO CIRC), bu hücrelerin metastatik basamaklamanın tüm adımlarından geçme kapasitesine sahip olduğunu öne sürdük (örneğin SW480 ve MDA-MB-468)8,11. Buna karşılık, diğer tümör hücreleri her iki grupta da çok düşük bir metastatik potansiyele sahiptir, dolaşıma enjekte edildiğinde bile neredeyse hiç mikrometastaz yapmaz (yani, CHT'de 24 hpi'de görülebilir, ancak 4 dpi'de artık orada değiller, örneğin Hs578T)8. Bununla birlikte, açıkça başka bir grup bulduk - sadece dolaşıma enjekte edildiğinde mikrometastaz oluşturabilen bir grup (sadece CIRC grubunda mikrometastaz gözlemleyebiliyoruz). Bu, bu hücrelerin metastatik çağlayanın ilk adımlarını gerçekleştirmede düşük bir verimliliğe sahip olduğunu, ancak diğer yandan dolaşımda hayatta kalabildiğini, uzak bir bölgeyi ekstravazasyona ve kolonileştirebildiğini göstermektedir.
İmmün yetinme ve görüntüleme Fiksasyondan önce, bu enjeksiyon protokolü canlı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi, eğirme disk mikroskopisi, yüksek çözünürlüklü canlı konfokal görüntüleme ve ışık tabakası mikroskopisi vb.
Ölü hücreler ve hücresel döküntüler floresan stereomikroskoptan gözlendiğinde parlak görünür ve özellikle çalışmanın amacı hücre çizgilerinin metastatik potansiyelini değerlendirmekse, canlı hücrelerle karıştırılabilir. Tümörün sağkalım durumunu ve mikrometastazı değerlendirmek için spesifik canlılık belirteçleri ve DAPI ile konfokal görüntülemenin önemini vurgulamak isteriz. Ayrıca, anti-insan mitokondri veya anti-insan HLA gibi insan hücrelerini tespit etmek için belirli insan antikorlarının kullanılması esastır. Protokolü uygularken, stereomikroskoptaki lekeleri konfokal görüntülerle karşılaştırarak deneyci gözleri eğitin. Bir süre sonra, deneyciler enkazı floresan stereomikroskoptaki canlı hücrelerden açıkça ayırt edebilir.
Tüm floresan alanı gibi tümör yükünü ölçmek için diğer yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, daha doğru bir yöntem olarak tüm montaj immünostaining ve konfokal görüntülemenin yapılması tavsiye edilir. Sadece lipofilik boya boyamanın verimliliği çok değişken değildir (yani, bazı hücreler çok iyi lekelenirken, diğerleri -muhtemelen zarlarının lipit içeriğinden kaynaklanmıyor), aynı zamanda birçok kez lipofilik boyalar agrega oluşturur ve ölü hücreler daha parlak olma eğilimindedir - canlı hücreler için karıştırılabilecek birkaç eser oluşturur.
Hücreler, takiplerine yardımcı olmak ve hücre etiketlemesini atlamak için floresan proteinlerle transdüklenebilir. Bununla birlikte, transdüklenmiş ve transdüklenmiş olmayan hücrelerin zebra balığı ksinograftlarında aynı sonuçları ürettiğinden emin olun.
Ek olarak, makrofajlar bu floresan hücre kalıntılarının floresan olarak etiketlenmesine ve göç ederek yanlış pozitif metastatik hücreler üretmesini fagositleyebilir. Bu nedenle, tümör davranışının daha doğru yorumlanması için elbette diğer birçok okumaya genişletilebilen bir dizi analitik araç öneriyoruz:
<ul style="list-style-type: square;"><li>
Çoğalma - MITOTİk figürlerin DAPI veya anti-pHH3Ser10 antikoru ile nicelemesi (Merck Millipore Cat. #06-570),</li>
	<li>
Apoptoz ile hücre ölümü- antikor anti-aktif Caspase3Asp175 (Hücre Sinyal Teknolojileri Cat. #9661) veya eşdeğeri,</li>
	<li>
Tümör büyüklüğü - DAPI sayımı- insan tümör hücreleri çok farklı bir kromatin organizasyonu gösterir, bu nedenle zebra balığı hücrelerinden kolayca ayırt edilirler ve boyayı iki kez kontrol etmek her zaman mümkündür (gözünüzü eğitirken),</li>
	<li>
Metastatik çalışmalar için, insan hücrelerini net bir şekilde tespit etmek için, - anti-insan HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-insan mitokondri (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).</li>
</ul>DAPI karşıtlık ile kontrol kanseri hücrelerinin HCT116 (ortalama nükleer boyut 10-12 μm çapında) Z yığınındaki dilimler arasında 5 μm aralıklı bir konfokal alım için, hücrelerin ~ % 50'sinin ardışık iki dilim arasında paylaşulduğunu gözlemledik. Bu nedenle, her dilim sayılırsa, aynı hücreleri iki kez sayma riski yüksektir. Nicelikte sorun yaşamamak için dilimler arasında gidip gelmek, zaman alıcı ve hataya eğilimli bir teknikle sonuçlanır. Toplam hücre sayısının nicelliğini kolaylaştırmak ve araştırmacılar arasında daha fazla tekrarlanabilirlik sağlamak için, daha önce bu protokolde açıklanan tümör boyutu formülünü oluşturduk8.
Dilimler arasında paylaşılan ~%50 hücreleri hesaba katmak için bir düzeltme numarası (1,5) dahil ettik. Araştırmacılar arasında tüm tümörün elle sayılmasında ortalama hatanın %20 olduğunu tespit ettik. Formülü kullanan iki araştırmacıda %2 hata vardı. Bu formülün kullanımı% 93 doğruluk oranına ve% 98 tekrarlanabilirlik oranına sahiptir. Otomatik yöntemleri de test ettik, ancak eşik ayarlarının neden olduğu% 50'den daha yüksek bir hata gösterdiler.
Apoptotik hücrelerin özellikleri nedeniyle, aktif Caspase 3 hücrelerinin nicelemesi daha zordur. Hataların sayısını ve sonuçlardaki varyasyonu azaltmak için, kontrol ve deneysel örneklerin aynı araştırmacı tarafından sayılmasını öneririz. Ek olarak, bu tekniği öğrenirken, yeni bir araştırmacı sonuçları karşılaştırmak ve eğitmek için daha deneyimli araştırmacılar tarafından zaten ölçülen görüntüleri saymalıdır.
Gerekirse tahlil süresi uzatılabilir. Bununla birlikte, zebra balığı larvalarının döllenmeden sonra ~7 günden (enjeksiyondan 5 gün sonra) başlayarak canlı beslenme gerektirdiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Ek olarak, döllenme sonrası 6 günden daha eski larvalara uygulanan hayvan refahı yönergeleri ve düzenlemeleri değişebilir.
Bu protokol, tek bir araştırmacının saatte yaklaşık ~200-300 zebra balığı larvası enjekte etmesini sağlamak için yararlı araçlar sağlar; ve analiz ve istatistiksel yorumlama da dahil olmak üzere tam tahlil sonuçları üç hafta içinde elde edildi. Bu protokolün araştırmacıların zebra balığı ksinograftları üretme konusunda uzman olmalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz. Kolay değil; Pratik yapman gerekiyor ama oraya varacaksın. İyi şanslar!

Zebra balığı (Danio rerio), gelişimi ve hastalığı incelemek için güçlü bir omurgalı model organizma olarak ortaya çıkıyor. Zebra balığı, yüksek oranda korunmuş genetiği (~%70 genetik homoloji ve ~%84 hastalıkla ilişkili genler) ve temel organ morfolojik özelliklerini insanlarla paylaşır1,2. Bu koruma, zebra balıklarının kanser3,4de dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarını modellemek içinkullanılmasınaizin verir.
Zebra balıklarının kullanımı ve bakımı, küçük boyutları, tüm yıl boyunca yüksek doğurganlıkları ve dış gübreleme3,5nedeniyle farelerden çok daha kolay ve daha uygun maliyetlidir. Zebra balığı embriyoları, yaşamlarının ilk 5-7 günü boyunca canlı beslenme gerektirmez ve gelişim, enfeksiyon ve kanser1, 4,6,7için etkili bir model olarak kullanılmıştır. Zebra balığı embriyoları döllenme sonrası 48 saatte yumurtadan çıkar (hpf) ve tüm organları oluşmuş, atan bir kalp ve fonksiyonel dolaşım sistemi, karaciğer, beyin, böbrek iliğivb. Ayrıca, gelişimin bu aşamasında sadece doğuştan gelen bağışıklık oyundadır, adaptif bağışıklık hala gelişmektedir, bu da bağışıklık sistemi baskılanmış mutantların kullanımına gerek kalmadan insan hücrelerinin genel olarak verimli bir şekilde kaplanmasına izin verir7,8. Bununla birlikte, tüm insan hücrelerinin eşit olarak9grafya etmediğini ve örneğin lösemi hücreleri için, verimli engraftasyon için fagositlerin (nötrofiller ve makrofajlar) tükenmesi gerektiğinin gösterildiğini belirtmek önemlidir10.
Zebra balığı genetik çekiş kabiliyeti ve erken embriyonik aşamalarının optik şeffaflığı, tek hücreli intravital görüntülemenin yüksek çözünürlükte ve böylece çeşitli biyoloji alanlarında son teknoloji görüntüleme tekniklerinin oluşturulmasına izin verir. Ayrıca, kanser bağlamında, bu özellikler anjiyojenik ve metastatik potansiyeli incelemek gibi konak tümör etkileşimlerinin en erken aşamalarının gerçek zamanlı çalışmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi ile etkileşimler için yararlıdır 8,9,11,12,13.
Kısa ksenograft tahlilinde metastatik "evrim" için zaman olmamasına rağmen- tümör hücrelerinin metastatik kapasitesini analiz etmek mümkündür (yani, invazyon, intravazasyon, dolaşımda sağkalım, ekstravazasyon ve kolonizasyon gibi metastatik adımlardan geçme verimlilikleri ve bu nedenle bu süreçleri vivo ve gerçek zamanlı olarak incelemek8,11,13,14).
Yaşam döngüsünün özellikleri zebra balığını kanserde kişiselleştirilmiş tıp için benzersiz bir model olarak yerleştirir. Tahliller daha kısa bir zaman aralığında yapılabilir ve birkaç hafta içinde elde edilen sonuçlar7,8,9,11,12,15,16. Bu tahlillerin kerevizi ve fizibilitesi, doktorlara ve araştırmacılara, zamanın önemli bir ihtiyaç olduğu kanser hastaları için yararlı olabilecek çevirisel sonuçlar elde etme imkanı sağlar.
Başarılı zebra balığı embriyo ksinograftları üretme girişimlerine rağmen, enjeksiyon prosedürünün standartlaştırılmasının yanı sıra enjeksiyon sonrası hücre canlılığının ve tümör davranışının değerlendirilmesinde hala ihtiyaç vardır.
Bu protokolde araştırmacılara zebra balığı embriyolarına insan kanseri hücre çizgilerinin enjeksiyonu ve daha sonra tümör hücre davranışının sabitlenmesi, immünostaining, görüntüleme ve nicelleştirilmesi için açık ve ayrıntılı bir adım adım kılavuz sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar for bacteriology</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam EP1395Y</td>
			<td>ab52922</td>
			<td>Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35552</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35560</td>
			<td>Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 50mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube 15mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nuclear and chromosome counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Based Micropipette Puller P-2000</td>
			<td>Sutter-Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Micropipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5mL</td>
			<td>Abdos</td>
			<td>P10202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, cut edge</td>
			<td>RS France</td>
			<td>BPB016</td>
			<td>Slides for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic Picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV820</td>
			<td>Microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>631-9430</td>
			<td>Coverslips for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaKem LE Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td>Agar plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>Borosilicate capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605036</td>
			<td>Enzymatic detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Petroleum jelly for slide sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant CM-DiI Dye</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22888</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant DiO Cell-Labeling Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>V22886</td>
			<td>Lipophilic dye (Dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>Confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis

Zebra balığı larva ksinograftları, insan kanserinin in vivo ve gerçek zamanlı çalışmalarını gerçekleştirmek için kanser araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Anti-kanser tedavilerine (kemoterapi, radyoterapi ve biyolojikler), anjiogenez ve metastazlara yanıtı tek hücre çözünürlüğü ile hızla görselleştirme olasılığı, zebra balığı ksinograft modelini preklinik çalışmalar geliştirmek için en iyi seçim olarak yerleştirir.

Zebra balığı larva xenograft testi, diğer modellere kıyasla birkaç deneysel avantaj sunar, ancak muhtemelen en çarpıcı olanı boyut ölçeğinin ve dolayısıyla zamanın azaltılmasıdır. Ölçeğin bu şekilde azaltılması, tek hücreli görüntülemeye, nispeten düşük sayıda insan hücresinin (biyopsilerle uyumlu), orta-yüksek verimli ilaç taramalarına izin verir, ancak en önemlisi tahlil süresinin önemli ölçüde azaltılmasını sağlar. Tüm bu avantajlar zebra balığı xenograft testini gelecekteki kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için son derece çekici hale getirir.

Çok çeşitli insan tümörleri ile birçok zebra balığı ksinograft protokolü geliştirilmiştir; bununla birlikte, zebra balığı larva ksinograftlarını verimli bir şekilde üretmek için genel ve standartlaştırılmış bir protokol hala eksiktir. Burada, ksinograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelleştirme için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis at JoVE.com

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Burada, ksnograftlar ve tümör davranış analizi, tam montajlı immünofluoresans ve konfokal görüntüleme nicelemesi için yönergeler oluşturmak için ipuçları içeren adım adım bir protokol sunuyoruz.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebra balığı ksinograftları kanser araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsan tümör hücrelerini alıp küçük larva zebra balıklarına, hatta yetişkinlere enjekte edebilirsiniz. Burada, sunduğumuz şey, canlı bir hayvanda birkaç insan kanseri ayırt edici özelliklerini inceleyebileceğimiz larva modelinin adım adım protokolüdür.Çoğalma, anjiogenez, metastaz ve ayrıca tümör mikroçevrim içindeki etkileşimleri inceleyebilirsiniz. Ve büyük bir avantaj, bunu çok kısa bir zaman diliminde inceleyebilebilebilenizdir. Mesela sadece dört gün.Bir başka büyük avantaj, bir konfokal veya ışık sayfası mikroskobu kullanarak bu canlıyı tek hücre çözünürlüğüyle inceleyebilmenizdir. Hücrelerin nasıl göç ettiklerini, hücrelerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve hatta birbirleriyle nasıl konuştuklarını inceleyebilirsiniz. Yani kanser biyolojisi okumak için gerçekten güçlü bir model.Zebra balığı ksinograftları, kemoterapi, radyoterapi ve hatta antikorlarla hedeflenen tedaviler gibi kanser önleyici tedavilere yanıt çalışmak için kullanılabilir. Ve son olarak, bu protokol cerrahi bir örnekten, hatta biyopsilerden hasta kaynaklı hücreleri kullanmak ve daha sonra zebra balığı avatarlarını oluşturmak için de uyarlanabilir. Enjeksiyon için hazırlanıyoruz.Enjeksiyondan iki hafta önce, kültürdeki hücreleri genişletin. Eğitim sırasında birçok hücre ve balık kaybolacağından, teknikle yetkin hale gelene kadar fazla hücreler ve fazla balıklarla başlayın. Tablo 1, eşlik eden PDF'nin birkaç hücre hattının enjeksiyonu için en uygun in-vitro izdiham yüzdelerinin ayrıntılı bir kılavuzuna sahiptir.Enjeksiyondan üç gün önce, istenen arka planın zebra balıklarını geçin. Enjeksiyondan 24 saat önce. Zebra balığı embriyo plakalarını temizleyin.Tüm ölü ve gelişmemiş embriyoları atın ve E3 ortamını yenileyin. Hücre kültürü odasında, hücre kültürü ortamını atın. Ölü hücreleri çıkarmak ve taze ortam eklemek için PBS 1X ile bir kez yıkayın.Embriyoları enjeksiyon için hizalamak için mikroenjeksiyon iğneleri, agarose plakaları ve saç tokaları gibi enjeksiyon prosedürü için araçları hazırlayın. Plaka hazırlığı için, temiz bir Petri kabının kapağına bir tabaka çözünmüş% 2 agarose dökün. Polimerize olmasına izin verin ve bir cetvel yardımıyla embriyoların hizalanması için üç ila dört düz agarose çizgisi yapın.Enjeksiyon günü. Yumurtadan çıkan embriyoları unhatched yumurtalardan ayırın. Bu aşamada embriyo ortamına Pronaz eklenmesi kuluçkayı artırabilir.Embriyoları enjeksiyona kadar 28 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon için hücre etiketlemesi. Tekrarlanabilir bir hücre etiketleme tekniğinin oluşturulmasına yardımcı olmak için, hücre satırlarının listesinin ve birkaç etiketleme çözümünün derlenmesi için yazılı protokolün bir ve iki tablolarını denetleyin.Hücre kültürü ortamını çıkarın ve şişeyi PBS 1X ile iki kez yıkayın. Hücreleri lipofilik bir boya ile etiketleyerek ışığa maruz kalmaktan kaçının ve şişeyi 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ayrıca, hücreleri ayırma üzerine 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünde etiketlemeyi de seçebilirsiniz.Hücre etiketleme solüsyonını çıkarın ve fazla boyayı çıkarmak için hücreleri PBS 1X ile yıkayın. İlgili ayırma maddesini ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Şişeyi steril bir hücre kazıyıcı ile fırçalayarak ayırma işlemini kolaylaştırın ve hücreleri serolojik bir pipetle toplayın.Hücreleri 1,5 ml mikrosantrifüj tüplerine ve santrifüje aktarın. Süpernatant atın ve peletin hücre kültürü ortamı ile yeniden askıya alın. Trypan mavi dışlama veya başka bir tercih yöntemi ile bir Neubauer odası kullanarak hücre canlılığını ölçün.Enjeksiyon ortamındaki hücreleri santrifüjle ve yeniden askıya alın. Orta boyda önerilen hücre konsantrasyonları makalenin bir tablosunda bulunabilir. Bu noktadan sonra hücreler buzda tutulmalıdır.Enjeksiyon prosedürleri. Embriyoları trikain 1X'te 5 dakika uyuşturun. Daha sonra, az miktarda uyuşturularak embriyoları bir agarose plakasına aktarın ve bir saç tokası döngüsü yardımıyla hizalayın.Embriyolar arasındaki mesafeyi koruduğunuzdan emin olun. Özellikle birinin sarısı ile bir sonrakinin başı arasında. Mortaliteyi önlemek için, plakaya bir ila üç damla trikain 1X çözeltisi dikkatlice ekleyerek hizalanmış embriyoların agarose plakasında kurumamasını sağlayın.Hücreleri yeniden askıya almak için mikrosantrifüj tüpüne hafifçe dokunun. Enjeksiyon iğnesini bir Mikro doldurucu ucu kullanarak bir hücre süspansiyonu ile geri yükleyin, embriyoların bütünlüğünü tehlikeye atabilecekleri için hava kabarcıklarından kaçının. Hava basıncı vanasını açın, mikroenjektörü kurun ve mikroenjeksiyon iğnesini dikkatlice tutucuya yerleştirin.Mikroenjeksiyon iğnesini ucuna yakın kesin. Embriyonun sarısını dikkatlice delin, iğnenin açısını düşürün ve iğnenin ucu perivitelline uzayına ulaşana kadar dikkatlice itin. Uç perivitelline alanına girdikten sonra hücrelere enjekte edin.Kardiyak ödemi önlemek için embriyonun gözünün büyüklüğüne ve kalpten mümkün olduğunca uzak bir hücre hacmi enjekte etmeye çalışın. Gerekirse mikroenjektör basıncını ayarlayın. Enjekte edilen embriyoları trikain 1X çözeltili temiz bir Petri kabına aktarın ve beş ila 10 dakika dinlenmeye bırakın.Bu yaranın kapanması için zaman verecektir. Trikain 1X çözeltisini çıkarın ve taze E3 ortamı ekleyin. Daha sonra embriyoları 34 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Bu sıcaklık hem zebra balığı embriyolarının hem de insan tümör hücrelerinin hayatta kalmasını sağlayacaktır. Metastatik test. Hücre hatlarınızın metastatik potansiyelini incelemek istiyorsanız, enjeksiyondan yaklaşık bir saat sonra, enjekte edilen embriyoları floresan stereomikroskop üzerinde tarayın ve dolaşımdaki kanser hücrelerinin yokluğuna veya varlığına göre iki gruba ayırın.Enjeksiyondan sonra bir gün. Floresan stereomikroskopta, her embriyoyu dikkatlice analiz edin ve uygun şekilde enjekte edilmiş tümörleri olanları seçin. Seçilen ksinograftları tümör büyüklüğüne göre sıralayın.Karşılaştırma için gözün boyutunu kullanın. Anormal morfoloji, kardiyak veya yumurta sarısı ödemi olan embriyoları, çok az kanser hücresine sahip ksinograftları veya sadece yumurta sarısının içinde kanser hücresi olanları atın. Ksinograftları istenen deneysel düzene göre dağıtın ve ilaç testini başlatın.İlaçları ve E3 ortamını günlük olarak değiştirin. Xenograft'ları kuluçkaya yatırarak, tahlil sonuna kadar 34 santigrat derecelik sıcaklığı koruyun. Enjeksiyondan dört gün sonra.Tahlilin son gününde, ksinograftları trikain 1X çözeltisi ile uyuşturun ve agar plakasına dikkatlice hizalayın. Ölü veya şişmiş ksinograftları atın. Bu ksinograftlar gravür nicelleştirme için dikkate alınmaz.Floresan stereomikroskopta, her bir ksinograftı dikkatlice analiz edin ve perivitellin alanında tümörlerin yokluğunu veya varlığını değerlendirin. Deneysel kuruluma göre, ilgi çekici ksinograftları seçin ve trikain 25X ile ötenazi. İmmünasyona devam etmek için oda sıcaklığında en az 4 saat boyunca% 4 formaldehit içinde sabitlayın.Aksi takdirde, gece boyunca dört santigrat derecede saklayın ve ertesi gün formaldehiti% 100 metanol ile değiştirin. %100 metanolde sabitlenmiş kinograftlar süresiz olarak 20 derecede saklanabilir. Konfokal görüntüleme için tüm montaj immünostaining.Tüm montaj immünofluoresans tekniği aşağıdaki gibi bölünmüş olarak üç gün sürer. İlk gün ksinograftların permeabilizasyonu ve primer antikor inkübasyonu içindir. İkinci gün, yıkama ve ikincil antikor inkübasyonu için.Ve üçüncü gün, yıkama, ksinograftların sabitlenmesi ve montaj ortamında depolama için. Bu prosedürün daha fazla ayrıntısını eşlik eden PDF'de bulabilirsiniz. Ksinograftların montajı.Montaj ortamının sızmaması için bir kapak fişinin kenarlarını petrol jölesi veya silikon gresle kapatın. Pasteur pipet kullanarak ksinograftları kapak fişine aktarın. Onları dikkatlice bir saç tokası ile hizalayın.Montaj ortamını başka bir kapak fişine ekleyin. Her iki kapak fişini de dikkatlice birleştirin ve daha kolay manipülasyon sağlamak için bir mikroskop slaydının üzerine yerleştirin. Konfokal görüntüleme.Su düzeltmeli apokromatik 25X daldırma objektif lens, tümörleri tek bir hücre çözünürlüğü ile görüntülemek için en uygunudur. Her dilim arasında beş mikronluk bir aralıkla Z-Stack işlevini kullanarak örnekleri alın. Ham verileri Fiji yazılımında açın.Ksenograft başına z-yığını başına üst, orta ve alttan tümörün üç temsili dilimini seçin. Fiji yazılımından Hücre Sayacı eklentisini açın. Hücre Sayacı aracında Başlat'ı tıklatın, bir sayaç türü seçin ve sayım modunu el ile başlatmak için resmi tıklatın.Her tıklama için sayaç kaç hücrenin sayılacağını sorar. Tümördeki toplam hücre sayısını elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın. Bağışıklık hücreleri, mitotik figürler, aktif kaspaz gibi toplam sayıları veya işaretleyicilerin yüzdesini değerlendirmek için, hücre sayacı eklentisi ile z-yığınının tüm dilimleri boyunca belirli etiketleme, işaretleyici veya ilgi alanına olumlu olan hücreleri manuel olarak ölçün.Bazı hücrelerin iki dilim arasında bulunacağını unutmayın. Hiçbir hücrenin iki kez sayılmamasını sağlamak için z yığınında ileri geri gidin. Temsili sonuçlar.Protokolde açıklandığı gibi HCT 116 kolorektal kanser hücre hattı ksinograftları oluşturulmuştır. Ksinograftlar tedavi edilmeyen kontrollerde ve FOLFIRI kemoterapisinde rastgele dağıtıldı. Nükleik karşıtlık için anti-cleaved caspase-3 antikoru ve DAPI kullanılarak apoptotik hücreleri tespit etmek için immünoresans yapıldı.Mitotik indeks, apoptoz ve tümör büyüklüğünün nicelleştirilmesi, FOLFIRI'nin tümör büyüklüğünün% 54 azalması eşliğinde mitozun önemli bir azalmasına ve apoptozun önemli bir indüksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. Bu özellikler, yüksek verimli fenotipik ilaç ekranlarında ve ayrıca birkaç kanser tedavisinin hücre içsel ve fizyolojik etkilerini kısa bir zaman diliminde test etmek için yararlıdır. Zebra balığı ksinograft modelinin bir başka büyük avantajı, farklı tümör hücrelerinin etkileşimlerini incelemek ve her hücre türünün diğerinin davranışını nasıl etkileyebileceğini analiz etmek mümkündür.Farklı insan kanser hücreleri, aynı tümörden veya farklı tümörlerden farklı klonlar birlikte enjekte edilebilir. Bu örnekte, aynı hastadan elde edilen iki kolorektal kanser hücre hattı farklı lipofilik boyalarla etiketlenmiş ve enjeksiyon için bire bir oranında karıştırılmıştır. Bu protokolün araştırmacıların zebra balığı ksinograftları üretmede gerçek uzman olmalarına yardımcı olabileceğini umuyoruz.Hiç kolay değil. Pratik yapman, pratik yapman gerekiyor. Sakın pes etme.Oraya varacağına eminim. İyi şanslar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Preklinik antikanser Coumarin OT48 pulcuklarının, koloni oluşumu deneyleri ve zebra balığı Xenografts Bioactivity değerlendirilmesi

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...