Name: making precise and accurate single-molecule fret measurements using the open-source smfbox
Uploaded: 2021-07-05T13:30:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox at JoVE.com

लेखकों ने निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोतों को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार किया है: BBSRC (BB/ T008032/1); EPSRC (बीए के लिए Studentship) और MRC (ए. आर.-टी. के लिए Studentship)।

<ol>
	<li>Forster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermolecular+energy+migration+and+fluorescence.">Intermolecular energy migration and fluorescence.</a> Annals of Physics. 437 (1-2), 55-75 (1948).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 58 (2), 719-726 (1967).</li><li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion.">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature Communications. 4 (1), 2131 (2013).</li><li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+dynamic+structural+biology:+Two+decades+of+single-molecule+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Science. 359 (6373), (2018).</li><li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation:+single-molecule+FRET+and+beyond.">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li><li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FRET-based+structural+dynamics+challenge+--+community+contributions+to+consistent+and+open+science+practices.">The FRET-based structural dynamics challenge -- community contributions to consistent and open science practices.</a> arXiv. , (2020).</li><li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks.">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2017).</li><li>Craggs, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+conformational+dynamics+facilitate+structure-specific+recognition+of+gapped+DNA+by+DNA+polymerase.">Substrate conformational dynamics facilitate structure-specific recognition of gapped DNA by DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 10788-10800 (2019).</li><li>Tsytlonok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+anticipation+by+Cdk2/Cyclin+A-bound+p27+mediates+signal+integration+in+cell+cycle+regulation.">Dynamic anticipation by Cdk2/Cyclin A-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation.</a> Nature Communications. 10 (1), 1676 (2019).</li><li>Nagy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule+FRET+and+NPS.">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS.</a> Nature Communications. 6 (1), 6161 (2015).</li><li>LeBlanc, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+protein+and+DNA+conformational+changes+govern+mismatch+repair+initiation+by+MutS.">Coordinated protein and DNA conformational changes govern mismatch repair initiation by MutS.</a> Nucleic Acids Research. 46 (20), 10782-10795 (2018).</li><li>Segal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+smFRET+analysis+of+freely+diffusing+nucleic+acid+molecules+and+associated+proteins.">High-throughput smFRET analysis of freely diffusing nucleic acid molecules and associated proteins.</a> Methods. 169, 21-45 (2019).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-aided+molecule+sorting:+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li><li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating-laser+excitation+of+single+molecules.">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 523-533 (2005).</li><li>M&#252;ller, B. K., Zaychikov, E., Brauchle, C., Lamb, D. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+microscopy+for+everyone:+the+OpenFlexure+microscope.">Robotic microscopy for everyone: the OpenFlexure microscope.</a> Biomedical Optics Express. 11 (5), 2447-2460 (2020).</li><li>Courtney, A., Alvey, L. M., Merces, G. O. T., Burke, N., Pickering, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Flexiscope:+a+low+cost,+flexible,+convertible+and+modular+microscope+with+automated+scanning+and+micromanipulation.">The Flexiscope: a low cost, flexible, convertible and modular microscope with automated scanning and micromanipulation.</a> Royal Society Open Science. 7 (3), 191949 (2020).</li><li>Martens, K. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+dCas9+target+search+in+vivo+using+an+open-microscopy+framework.">Visualisation of dCas9 target search in vivo using an open-microscopy framework.</a> Nature Communications. 10 (1), 3552 (2019).</li><li>Auer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer-scale+multiplexed+super-resolution+imaging+with+an+economic+3D-DNA-PAINT+microscope.">Nanometer-scale multiplexed super-resolution imaging with an economic 3D-DNA-PAINT microscope.</a> ChemPhysChem. 19 (22), 3024-3034 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squid:+Simplifying+quantitative+imaging+platform+development+and+deployment.">Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment.</a> bioRxiv. , 424613 (2020).</li><li>Ambrose, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smfBox+is+an+open-source+platform+for+single-molecule+FRET.">The smfBox is an open-source platform for single-molecule FRET.</a> Nature Communications. 11 (1), 5641 (2020).</li><li>Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon-HDF5:+An+open+file+format+for+timestamp-based+single-molecule+fluorescence+experiments.">Photon-HDF5: An open file format for timestamp-based single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).</li><li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study.">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).</li><li>Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S., Weiss, S., Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRETBursts:+An+open+source+toolkit+for+analysis+of+freely-diffusing+single-molecule+FRET.">FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing single-molecule FRET.</a> PLOS One. 11 (8), 0160716 (2016).</li><li>Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+molecular+dynamics+in+single-molecule+FRET+experiments+with+burst+variance+analysis.">Identifying molecular dynamics in single-molecule FRET experiments with burst variance analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (6), 1568-1577 (2011).</li><li>Tomov, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+subpopulations+in+single-molecule+FRET+and+ALEX+experiments+with+photon+distribution+analysis.">Disentangling subpopulations in single-molecule FRET and ALEX experiments with photon distribution analysis.</a> Biophysical Journal. 102 (5), 1163-1173 (2012).</li><li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis.">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li><li>Kalinin, S., Valeri, A., Antonik, M., Felekyan, S., Seidel, C. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+structural+dynamics+by+FRET:+A+photon+distribution+and+fluorescence+lifetime+analysis+of+systems+with+multiple+states.">Detection of structural dynamics by FRET: A photon distribution and fluorescence lifetime analysis of systems with multiple states.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 114 (23), 7983-7995 (2010).</li><li>Pirchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon-by-photon+hidden+Markov+model+analysis+for+microsecond+single-molecule+FRET+kinetics.">Photon-by-photon hidden Markov model analysis for microsecond single-molecule FRET kinetics.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 120 (51), 13065-13075 (2016).</li><li>Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAM:+A+framework+for+integrated+analysis+of+imaging,+single-molecule,+and+ensemble+fluorescence+data.">PAM: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data.</a> Biophysical Journal. 114 (7), 1518-1528 (2018).</li><li>Zijlstra, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microfluidic+dilution+for+single-molecule+spectroscopy+of+low-affinity+biomolecular+complexes.">Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).</li><li>Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+transient+protein+complexes+determined+via+diffusion-independent+microfluidic+mixing+and+fluorescence+stoichiometry.">Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 122 (49), 11554-11560 (2018).</li><li>Bennet, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+conformational+flexibility+couples+substrate+specificity+and+scissile+phosphate+diester+selectivity+in+human+flap+endonuclease+1.">Regional conformational flexibility couples substrate specificity and scissile phosphate diester selectivity in human flap endonuclease 1.</a> Nucleic Acids Research. 46 (11), 5618-5633 (2018).</li></ol>

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम माइक्रोस्कोप का संरेखण और नमूना एकाग्रता को सही कमजोर पड़ने के लिए समायोजित कर रहे हैं। यदि संरेखण बंद है, तो फटने और प्लॉट हिस्टोग्राम की पहचान करने के लिए अपर्याप्त संकेत हो सकता है, और यदि नमूनों के बीच misalignment होता है तो सटीक FRET सुधार रिसाव और पता लगाने / उत्तेजना क्षमता में परिवर्तन के कारण विफल हो सकता है। एक उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग भी महत्वपूर्ण है, बहुत अधिक एकाग्रता संयोग फटने देगी, जिसमें संभावित रूप से अलग-अलग फ्रेट दक्षताओं या लेबलिंग स्टोइकोमेट्री के साथ कई अणु शामिल हैं। बहुत कम एकाग्रता मजबूत डेटा विश्लेषण के लिए बहुत कम फटने देगी।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्थैतिक एकल FRET प्रजातियों में दूरी को मापने के लिए है। यदि नमूने में FRET दक्षता हिस्टोग्राम में एक से अधिक चोटी है, या चोटियां व्यापक दिखाई देती हैं (जो गतिशील प्रजातियों के साथ हो सकती हैं), तो हिस्टोग्राम को सटीकता की एक ही डिग्री में फिट करने के लिए अधिक फटने की आवश्यकता हो सकती है। दो अच्छी तरह से अलग चोटियों के लिए तो लगभग दो बार के रूप में ज्यादा डेटा की आवश्यकता होगी, लेकिन अगर आबादी थोड़ा ओवरलैप तो और भी अधिक डेटा की आवश्यकता है.
यदि दो आबादी प्रयोग के समय पैमाने पर परस्पर परिवर्तित होती है, तो सिस्टम की गतिशीलता और कैनेटीक्स संभावित रूप से निर्धारित किया जा सकता है। BVA27 और 2CDE28 जैसे परीक्षण इस बात की पुष्टि कर सकते हैं कि मध्यवर्ती फटने प्रकृति में गतिशील हैं, जबकि dPDA29,30 या H2MM31 सहित विश्लेषण अंतर-रूपांतरण की दरों को निर्धारित कर सकते हैं। BVA और 2CDE के लिए Jupyter नोटबुक FRETBursts26 वेबसाइट पर उपलब्ध हैं, और MATLab आधारित सॉफ़्टवेयर PAM32 BVA, 2CDE और PDA विश्लेषण चला सकते हैं।
Confocal एकल अणु FRET आसानी से राज्यों को टीआईआरएफ की तुलना में बहुत अधिक अल्पकालिक (~ 1 एमएस) का निरीक्षण कर सकता है; हालांकि, प्रसार द्वारा सीमित लघु अवलोकन समय, कोई आणविक इतिहास नहीं देते हैं, और इसलिए लंबे समय तक रहने के समय, या जटिल संक्रमण नेटवर्क को उस तरह से निर्धारित नहीं कर सकते हैं जिस तरह से सतह स्थिर प्रयोग कर सकते हैं।
जैसा कि प्रोटोकॉल बहुत कम सांद्रता पर अणुओं को स्वतंत्र रूप से अलग करने के उपाय करता है, यह एक ही अणु पर इंट्रामोलेक्यूलर दूरी को मापते समय सबसे अच्छा काम करता है। क्षणिक रूप से बाध्य अणुओं के बीच अंतर-आणविक दूरी को मापा जा सकता है बशर्ते कि दो अणुओं का केडी पर्याप्त रूप से कम हो कि परिसर प्रयोग द्वारा आवश्यक कम काम करने वाली एकाग्रता (~ 100 पीएम) पर एक महत्वपूर्ण मात्रा में मौजूद हो। यदि केडी इससे बहुत अधिक है, तो केवल एकल लेबल वाले अणुओं को देखा जाएगा। इस समस्या को माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके दो लेबल घटकों को एक साथ एक उच्च एकाग्रता पर मिश्रण करने के लिए दूर किया जा सकता है और फिर जटिल विघटित होने से पहले उद्देश्य पर तेजी से पतला और बहरहा है33,34।
एकल-अणु स्तर पर FRET दक्षताओं को मापने का पहनावा तकनीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि यह विषम उप-आबादी पर सूचित करता है, जो एक पहनावा प्रयोग में औसत होगा। इसके अलावा, एलेक्स के साथ एकल-अणु FRET सटीक FRET दक्षता तक पहुंच प्रदान करता है, जिसे सटीक दूरी में परिवर्तित किया जा सकता है। यह केवल सापेक्ष दूरी परिवर्तनों की जांच करने के बजाय अधिक विस्तृत संरचनात्मक जानकारी के निर्धारण को सक्षम बनाता है। SmfBox इन सभी लाभों और क्षमताओं को वहन करता है, लेकिन confocal smFRET23 के लिए सक्षम तुलनीय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप की तुलना में बहुत कम बजट पर बनाया जा सकता है।
SmfBox smFRET तकनीकों के लिए प्रवेश करने के लिए एक बहुत कम बाधा का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे शोधकर्ताओं को संरचनात्मक परिवर्तनों को मापने की अनुमति मिलती है, और प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के भीतर और उनके बीच सटीक दूरी 7,8,9,10,11,35।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino modified oligonucleotide</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avalanche photodiode (APD)</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>SPCM-AQRH-14</td>
			<td>Two APDs are required for the smfBox setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2153</td>
			<td>System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Laser Combiner</td>
			<td>OMICRON</td>
			<td>LightHUB-2</td>
			<td>515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-2742</td>
			<td>Thickness: 0.17 &#177; 0.01 mm, LxW: 22x22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3B</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>PA63101</td>
			<td>1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRETBursts Python Package</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter notebooks</td>
			<td>Project Jupyter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Tissue</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>MC-5</td>
			<td>MC-50E is same item in bulk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ/Ultrapure water</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanopoistioner</td>
			<td>Piezoconcept</td>
			<td>FOC300</td>
			<td>Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-ester modified ATTO-550</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 550-31</td>
			<td>1 mg, AD 550-35 (5 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NHS-ester modified ATTO-647N</td>
			<td>ATTO-TEC</td>
			<td>AD 647N-31</td>
			<td>1 mg, AD 647N-35 (5 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N1480700</td>
			<td>Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMICRON Control Center (OCC)- laser control center</td>
			<td>OMICRON</td>
			<td>N/A</td>
			<td>v3.5.34 - OMICRON laser driver software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press-To-Seal silicone isolator</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>664201</td>
			<td>&#160;8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smOTTER</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7653</td>
			<td>System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93362</td>
			<td>System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ZIQ7000T0</td>
			<td>Milli-Q&#174; IQ 7000 Ultrapure Water System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

making precise and accurate single-molecule fret measurements using the open-source smfbox

SmfBox एकल-अणु Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) के लिए हाल ही में विकसित लागत प्रभावी, ओपन-सोर्स उपकरण है, जो स्वतंत्र रूप से बायोमोलेक्यूल्स को अधिक सुलभ बनाता है। इस अवलोकन में डुप्लेक्स डीएनए नमूनों में सटीक FRET दक्षताओं के माप करने के लिए इस उपकरण का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल शामिल है, जिसमें नमूना तैयारी, उपकरण सेटअप और संरेखण, डेटा अधिग्रहण और पूर्ण विश्लेषण दिनचर्या का विवरण शामिल है। प्रस्तुत दृष्टिकोण, जिसमें सटीक FRET-व्युत्पन्न दूरी माप के लिए आवश्यक सभी सुधार कारकों को निर्धारित करना शामिल है, FRET समुदाय में हाल के सहयोगी कार्य के एक बड़े शरीर पर बनाता है, जिसका उद्देश्य मानक प्रोटोकॉल और विश्लेषण दृष्टिकोण स्थापित करना है। यह प्रोटोकॉल, जो आसानी से बायोमोलेक्यूलर सिस्टम की एक श्रृंखला के लिए अनुकूलहै, व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए smFRET को लोकतांत्रिक बनाने में बढ़ते प्रयासों को जोड़ता है।

प्रोटोकॉल को सेटअप के दौरान प्रयोगात्मक स्थितियों के महत्वपूर्ण मूल्यांकन की आवश्यकता होती है (प्रोटोकॉल चरण 4.8 देखें)। प्राप्त किए गए पहले परिणाम जो प्रयोग की सफलता या विफलता को निर्धारित करते हैं, इस चरण में प्राप्त किए जाते हैं। एक सकारात्मक परिणाम प्रति सेकंड पांच और एक फटने के बीच होगा ( चित्रा 2 बी, सी देखें)। एक नकारात्मक परिणाम उस समय सीमा के भीतर बहुत अधिक (चित्रा 2 ए) या बहुत कम फटने (चित्रा 2 डी) होगा। इन त्रुटियों को सुधारने के लिए इस स्तर पर यह संभव है: बहुत अधिक एकाग्रता वाले नमूने को बस पतला करने की आवश्यकता है; यदि एकाग्रता बहुत कम है, हालांकि, एक नया नमूना तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है (निर्धारक यह है कि क्या यह उचित समय सीमा में डेटा एकत्र करने के लिए इस कम एकाग्रता पर संभव रहता है)।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62378/62378fig02.jpg"> चित्रा 2: प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान लाइव ट्रेस से स्क्रीन शॉट्स डबल लेबल वाले डुप्लेक्स डीएनए नमूनों की विभिन्न सांद्रता दिखाते हैं। (ए) बहुत अधिक, (बी) ऊपरी स्वीकार्य सीमा, (सी) लक्ष्य एकाग्रता, (डी) बहुत कम। फोटॉन गिनती (1 एमएस डिब्बे) तीन डिटेक्शन चैनलों में दिखाए जाते हैं; दाता उत्तेजना (डीडी) के बाद दाता उत्सर्जन, दाता उत्तेजना (डीए) के बाद स्वीकर्ता उत्सर्जन, और स्वीकर्ता उत्तेजना (एए) के बाद स्वीकर्ता उत्सर्जन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/62378fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
एक स्थिर एकल-प्रजाति प्रणाली को आमतौर पर मजबूत डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक आवश्यक ~ 1,000 फटने को प्राप्त करने के लिए 30 से 60 मिनट के माप की आवश्यकता होती है। समय की लंबाई और आवश्यक फटने की संख्या कई प्रजातियों या गतिशील प्रणालियों के साथ बढ़ेगी। प्रोटोकॉल आंकड़ों का उपयोग करके डेटा संग्रह और विश्लेषण के बाद Jupyter नोटबुक्स से निर्यात किए जाते हैं। alternation प्लॉट (चित्रा 3A) प्रयोगात्मक सेटअप की एलेक्स अवधि से मेल खाना चाहिए। समय ट्रेस (चित्रा 3 बी) का उपयोग गुणात्मक रूप से आकलन करने के लिए किया जाता है कि नमूना एकाग्रता उचित है। पृष्ठभूमि प्लॉट (चित्रा 3 C) पृष्ठभूमि दर 26 का अनुमान लगाने के लिए लंबे समय तक रैखिक फिट के साथ अंतर-फोटॉन देरी अवधि के वितरण को दर्शाता है। पृष्ठभूमि ट्रेस (चित्रा 3 डी) यह पहचान सकता है कि क्या प्रयोग की अवधि में नमूने में परिवर्तन हुए थे; मुख्य रूप से यह लंबे समय तक अधिग्रहण समय के दौरान वाष्पीकरण के कारण होगा। ईएस हिस्टोग्राम सभी फोटॉनों (चित्रा 3 ई) और दोगुना लेबल वाली प्रजातियों (चित्रा 3 एफ) के लिए उत्पन्न होते हैं। अंत में, एक 1 डी ई हिस्टोग्राम (चित्रा 3 जी) फट डेटा के गाऊसी फिटिंग के साथ उत्पन्न होता है।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62378/62378fig03.jpg"> चित्र 3: Jupyter नोटबुक्स द्वारा उत्पन्न विश्लेषण किए गए डेटा का उदाहरण आंकड़ा आउटपुट। (A) Alternation plot, (B) Time trace, (C) Background determination, (D) Background rates, (E) All photon ES हिस्टोग्राम, (F) Dual channel ES हिस्टोग्राम, और (G) 1D E हिस्टोग्राम। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/62378fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>नाम</td>
			<td>अनुक्रम</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">1a</td>
			<td>5 '- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>3'- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी - 5'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">1b</td>
			<td>5 '- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>3'- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी - 5'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">1c</td>
			<td>5 '- GAG CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT TTT GAG TGT TTG TCT GG - 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>3'- सीटीसी जीएसी टीटीटी सीएसी एजीसी टीसीए एएसी एएए सीटीसी एसीए एएएसी आगा सीसी - 5'</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले डीएनए अनुक्रम। न्यूक्लियोटाइड्स को नीले और लाल रंग में हाइलाइट किया गया है जो क्रमशः एटो -550 और एटो -647 एन के साथ लेबल किए गए सी 2 अमीनो संशोधित थायमिन अवशेषों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
सुधार कारक खोजक अल्फा-डेल्टा: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/Correction%20Factor%20Finder%20Alpha-Delta.ipynb" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>
सुधार कारक खोजक गामा-बीटा: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/Correction%20Factor%20Finder%20Gamma-Beta.ipynb" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a> 
FRET Analysis 1.4 Corrected: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/FRET%20Analysis%201.4%20Corrected.ipynb" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a> 
FRET विश्लेषण 1.4 Uncorrected: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62378/FRET%20Analysis%201.4%20Uncorrected.ipynb" target="_blank">कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>

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Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

यह आलेख व्यक्तिगत पर पूरी तरह से सही सटीक FRET माप बनाने के लिए चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान करता है, स्वतंत्र रूप से खुले स्रोत, सस्ती smfBox का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स को अलग करता है, स्विच ऑन से, संरेखण के माध्यम से और ध्यान केंद्रित करने के लिए, डेटा संग्रह और विश्लेषण के लिए।

ओपन-सोर्स smfBox का उपयोग कर सटीक और सटीक एकल-अणु FRET माप बनाना

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

यह प्रोटोकॉल किसी को भी smfBox का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के भीतर सटीक निरपेक्ष दूरी को मापने के लिए एकल-अणु FRET प्रयोगों का संचालन करने में सक्षम बनाता है, जो एक सस्ता, मजबूत, ओपन-सोर्स उपकरण है। smFRET आपको एक समय में एक अणु को देखने की अनुमति देता है, बजाय औसत कई अरबों अणुओं के, ताकि आप उन विभिन्न संरचनाओं को चिह्नित कर सकें जिन्हें वे अपनाते हैं। इस विधि की सुंदरता यह है कि इसका उपयोग कई जैव-आणविक प्रणालियों की संरचना और गतिशीलता पर प्रकाश डालने के लिए किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, प्रोटीन तह, प्रोटीन डीएनए इंटरैक्शन, और डीएनए एलोस्टरी। एक विश्लेषण शुरू करने से पहले, लेजर नियंत्रण केंद्र लॉन्च करें और पुष्टि करें कि निरंतर तरंग बारी-बारी से निरंतर वर्तमान मोड का चयन किया गया है। दोनों लेजर पर शक्ति।SmOTTER अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें और पुष्टि करें कि प्रत्येक उपकरण सही ढंग से कॉन्फ़िगर किया गया है। उत्सर्जन पथ को संरेखित करने के लिए, उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें और उद्देश्य लेंस पर एक साफ कवर ग्लास रखें, कवर ग्लास और उद्देश्य के बीच हवा के बुलबुले को फँसाने से रोकने के लिए तेल के कोण पर कम करें। फिर कवर ग्लास के केंद्र पर 100 नैनोमोलर Cy3B डाई के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।लेजर ड्यूटी चक्र पैनल में, दाता लेजर को शून्य, 45 पर, और 55 बंद करने के लिए सेट करें। स्वीकर्ता लेजर को 50 बंद, 45 पर, और पांच बंद पर सेट करें। 100 माइक्रोसेकंड के लिए बारी लेजर उत्तेजना या एलेक्स अवधि सेट करें।Z फ़ोकस टैब खोलें. अधिग्रहण पैनल में, रहने के लिए लेजर स्विच करें और कैमरा शुरू करें। एक्सपोज़र को समायोजित करें ताकि एक उज्ज्वल स्थान केंद्रीय रूप से एक काले रंग की पृष्ठभूमि से घिरा हुआ दिखाई दे।कम जेड स्थिति से शुरू करते हुए, ऊंचाई को बढ़ाएं जब तक कि उज्ज्वल स्थान अपने न्यूनतम आकार तक नहीं पहुंच जाता। फिर तेल के ऊपर नमूने में लेजर पर ध्यान केंद्रित करने और ग्लास को कवर करने के लिए ऊंचाई को अतिरिक्त 20 माइक्रोमीटर तक बढ़ाएं। जब नमूना ध्यान में आता है, तो कैमरे को रोकें।ओमीक्रोन नियंत्रण केंद्र में, smOTTER के संरेखण टैब में y-अक्ष पैमाने की निगरानी करते हुए हरे रंग की लेजर शक्ति को कम करें, जब तक कि दोनों डिटेक्टरों से रीडआउट नहीं देखा जाता है, पैमाने को आवश्यक रूप से बदल दिया जाता है। फिर सामने पैनल को हटाने के लिए smfBox के सामने चार शिकंजा unscrew. पिनहोल को संरेखित करने के लिए, हरे और लाल रंग में सिग्नल बढ़ाने के लिए संरेखण टैब पर सिग्नल देखते समय पिनहोल पोजिशनर पर एक्स घुंडी को चालू करें।दूसरी दिशा में पिनहोल को संरेखित करने के लिए वाई घुंडी को घुमाएं, फिर सिग्नल में किसी भी और वृद्धि की जांच करने के लिए एक्स घुंडी पर लौटें। पिनहोल लेंस को संरेखित करने के लिए, सिग्नल को कम करने के लिए लेंस एक्स घुंडी को एक दिशा में घुमाएं, फिर सिग्नल को मूल स्तर पर वापस करने के लिए पिनहोल एक्स घुंडी को उसी दिशा में घुमाएं। यदि नया अधिकतम संकेत पहले की तुलना में अधिक है, तो उस दिशा में पिनहोल और लेंस नॉब्स दोनों को पुनरावृत्ति से स्थानांतरित करना जारी रखें।यदि संकेत पहले की तुलना में कम है, तो पुनरावर्ती रूप से विपरीत दिशा में knobs को स्थानांतरित करें, फिर पिनहोल और लेंस वाई knobs का उपयोग करके संरेखण को दोहराएं। हिमस्खलन फोटोडायोड लेंस के संरेखण के लिए, हरे हिमस्खलन फोटोडायोड के साथ शुरू करते हुए, एक्स घुंडी को तब तक ले जाएं जब तक कि ग्रीन सिग्नल अपने अधिकतम पर न हो। Y घुंडी के लिए संकेत संशोधन को दोहराएँ।एक्स घुंडी पर लौटें, दहलीज बिंदुओं को खोजने के लिए आगे और पीछे बढ़ते हुए, जिस पर सिग्नल गिरना शुरू हो जाता है। संकेत को इन दो बिंदुओं के बीच आधे रास्ते पर छोड़ दें। वाई घुंडी के लिए आधे रास्ते की स्थिति का पता लगाएं और लाल हिमस्खलन फोटोडायोड के लिए संरेखण को दोहराएं।पहले नमूने का विश्लेषण करने से पहले, मेथनॉल-भिगोए गए लेंस सफाई ऊतक के साथ मंच को साफ करें, धीरे से उद्देश्य को एक छोर से दूसरे छोर तक पोंछते हुए और उद्देश्य के केंद्र पर विसर्जन तेल की तीन से चार बूंदें लागू करें। एक साफ कवर ग्लास के केंद्र में टाइप वन अल्ट्राप्योर पानी के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें और यह पुष्टि करने के लिए पानी के निशान की निगरानी करें कि कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं देखा जाता है। फिर कवर ग्लास को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए रबर-एंडेड चिमटी का उपयोग करें और यदि आवश्यक हो तो विसर्जन तेल को फिर से भरें।यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक एकल-अणु डेटा प्राप्त किया जाता है, नमूने को पतला करने के बाद, एक एकाग्रता का चयन करें जिस पर लाइव ट्रेस पैनल में प्रति सेकंड एक से पांच फटने देखे जाते हैं। जब उचित एकाग्रता निर्धारित की जाती है, तो एक नए कवर ग्लास के केंद्र पर आठ से नौ मिलीमीटर व्यास सिलिकॉन आइसोलेटर्स दबाएं और सिलिकॉन के साथ संपर्क से बचने के लिए केंद्र में नमूने के 10 माइक्रोलीटर को सावधानीपूर्वक जोड़ें। दूसरे कवर ग्लास को आइसोलेटर्स पर मजबूती से रखें जब तक कि एक सील का गठन न हो जाए।लाइव स्टोइकोमेट्री बनाम FRET दक्षता हिस्टोग्राम की जांच करें कि क्या नमूना अपेक्षित व्यवहार कर रहा है। सहेजें सेटिंग्स पैनल में, नमूना नाम और विवरण, दाता और स्वीकर्ता लेबल, बफर, दाता और स्वीकर्ता उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पता लगाने तरंग दैर्ध्य और लेजर शक्ति, अंत उपयोगकर्ता और उपयोगकर्ता संबद्धता के लिए जानकारी दर्ज करें। अधिग्रहण पैनल में, मिनटों में प्रयोग की लंबाई दर्ज करें और त्रुटि के मामले में किसी भी संभावित डेटा हानि को कम करने के लिए एक उपयुक्त बचत अंतराल का चयन करें।यदि आवश्यक हो तो लेजर शक्तियों को सहेजें का चयन करें, फिर डेटा प्राप्त करना शुरू करने के लिए प्रारंभ करें पर क्लिक करें। एक सकारात्मक परिणाम में, पांच और एक फट के बीच प्रति सेकंड प्राप्त किया जाएगा। एक नकारात्मक परिणाम में, एक ही समय सीमा के भीतर बहुत अधिक या बहुत कम फटने देखे जाएंगे।संग्रह और विश्लेषण के बाद, परिवर्तन प्लॉट को प्रयोगात्मक सेटअप की एलेक्स अवधि से मेल खाना चाहिए। समय ट्रेस का उपयोग गुणात्मक रूप से यह आकलन करने के लिए किया जाता है कि नमूना एकाग्रता उचित है। पृष्ठभूमि प्लॉट पृष्ठभूमि दर का अनुमान लगाने के लिए लंबे समय तक रैखिक फिट के साथ अंतर-फोटॉन देरी अवधि के वितरण को दर्शाता है।पृष्ठभूमि ट्रेस का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जा सकता है कि क्या प्रयोग की अवधि में नमूने में परिवर्तन हुए थे। स्टोइकोइमेट्री बनाम FRET दक्षता हिस्टोग्राम उत्पन्न होते हैं, जो सभी प्रजातियों और दोगुना लेबल वाली प्रजातियों के लिए चयन करते हैं। एक 1 डी FRET दक्षता हिस्टोग्राम डेटा के गाऊसी फिटिंग के साथ उत्पन्न होता है।तो यहां नमूने की एकाग्रता महत्वपूर्ण है। यदि यह बहुत अधिक है, तो आप अब एकल-अणु प्रयोग नहीं कर रहे हैं, जबकि यदि यह बहुत कम है, तो डेटा प्राप्त करने में बहुत लंबा समय लगेगा। यह गतिशील बायोमोलेक्यूल्स की संरचनाओं के निर्धारण को सक्षम करता है, जिसे एनएमआर या क्रिस्टलोग्राफी जैसे अन्य तरीकों से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

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