Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

نشكر محققي معهد المعلومات الفيروسية (السابع)، الدكتورة أنكا م. سيغال، ويلو سيغال، وباتريشيا ل. روهوير، وغاري روهوير، وكاري ل. روهوير، وماغدا سيلفيا بينيتا، وإليزابيث كروز كانو، والدكتور غريغوري بيترز، والدكتور ستيوارت أ. ساندين، والدكتورة جنيفر سميث لأخذهم الوقت لجمع عينات عديدة. كما نشكر الدكتور روب نايت، والدكتور جاك جيلبرت، والدكتور بيدرو بالدا فيري، والدكتورة سارة ألارد من قسم طب الأطفال في كلية الطب بجامعة سان دييغو كاليفورنيا (UCSD) لتسهيل الضوابط الإيجابية وردود الفعل المفيدة. نشكر ستايسي كاروتا (كلية العلوم في جامعة SDSU) وجينا سبيدل (SDSU) على الدعم اللوجستي وخوان رودريغيز على التصميم الفني والرسمي لبروتوكول أخذ العينات. نشكر جميع المشاركين على التزامهم وتفانيهم في هذا المشروع خلال الأوقات الصعبة للغاية. وقد دعم هذا العمل تبرع سخي من الدكتور جو آن لين (كلية العلوم في جامعة SDSU) والمؤسسة الوطنية للعلوم RAPID: الخزانات البيئية لمنحة SARS-CoV-2 (رقم الجائزة: 2030479).

ويعلن جميع المؤلفين أنه لا توجد مصالح متنافسة.

مشاركة المواطنين العلماء. وتم تجنيد علماء مواطنين لمسح الأسطح فى جميع انحاء محافظة سان دييجو لعينة واكتشاف وجود السارس - كوف - 2 فى البيئة الحضرية . وغالبية مجموعات أخذ العينات المسلمة (70 في المائة) وأعيدت جميع العينات تقريبا إلى المختبر، واكتمت الانتهاء من جميع هذه العينات (91 في المائة) (الشكل3 ألفوباء والجدول 4). ويمكن للمتطوعين أن يطلبوا بسهولة تسليم/استلام المعدات من خلال المنصة القائمة على شبكة الإنترنت، وأخطر برنامج تخطيط طرق التسليم العلماء المواطنين بالأوقات المقدرة للوصول، وكلاهما من المرجح أن يكونا عاملين هامين للنجاح الملحوظ. متوسط الوقت من عندما تم تسليم عدة إلى المواطن العالم إلى عندما عاد إلى المختبر كان 8 أيام، مع متوسط 3 أيام ومجموعة من 1-64 يوما (الشكل 3A والجدول 4). ومن المرجح أن تؤدي رسائل التذكير الأكثر تواترا للمتطوعين إلى تقليل هذا التأخير الزمني.
تم استخدام منصة جمع البيانات بنجاح من قبل الغالبية العظمى من المستخدمين (73٪) من المستخدمين (73٪) من المستخدمين (1999). (الجدول 4). وفي حين لم يتم قياس جهود العلماء المواطنين، أظهرت الاختبارات الميدانية أن منصة جمع البيانات قللت بشكل كبير من الجهد والوقت اللازمين لإكمال جمع العينات بشكل صحيح. وبالتالي، فإن تخفيض كمية مسك الدفاتر شجع المواطنين على المشاركة في العلماء. وكان الهدف من المنصة القائمة على شبكة الإنترنت هو التغلب على القيود الديمغرافية من خلال توفير خدمة ترجمة آلية عصبية متعددة اللغات وتوفير بروتوكولات بيانية وبصرية باللغتين الإنجليزية والإسبانية. وكان هذا ناجحا جزئيا فقط حيث تم جمع عينات أقل من كل من الخليج الجنوبي والمقاطعة الشمالية حيث يقيم معظم سكان المقاطعة من أصل إسباني / لاتيني45. كما تضم هذه المناطق 63٪ (1,700 حالة لكل 100,000) من إجمالي حالات COVID-19 في مقاطعة سان دييغو مع أعلى معدل انتشار للمرض46 ومعدل دخول المستشفيات (62٪) وبالرغم من ان معظم العينات جاءت من محافظة سنترال ، الا انه تم جمع عدد ممثل من اكثر المناطق تأثرا بالسارس - 19 ، وان جزءا صغيرا فقط من العينات كان ايجابيا ، مما يشير الى ان الخزانات السطحية للسارس - كوف - 2 فى البيئة الحضرية نادرة نسبيا .
معالجة العينة. تم ترطيب مسحات أخذ العينات مع SDS ، والتي عطلت الفيروس عن طريق تعطيل مغلفه واستقرت الحمض النووي الريبي العاري من خلال الكشف عن RNases32. بشكل مريح أثناء الجمع ، قام المنظفات في المسحة بتنظيف السطح الذي تم أخذ عينات منه. العينات البيئية غالبا ما تحتوي على كميات صغيرة جدا من الحمض النووي الريبي. ولتعظيم الاسترداد، تم إجراء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج خام تستند إلى GITC وخالية من الأعمدة. GITC, عامل chaotropic قوية, يعطل الروابط الهيدروجين التي تحافظ على البروتين للطي (أي تأثير مسعور). ينتج عن هذا الإجراء تعطيل الجسيمات الفيروسية ، ويظل الحمض النووي الريبي مستقرا بسبب تثبيط الحمض النووي الريبي34و35و36. حافظ حل GITC على استقرار عينات الحمض النووي الريبي دون اعتبارات صارمة في السلسلة الباردة ، مما سمح للمواطنين بالحفاظ على العينات في درجة حرارة الغرفة إذا لم يكن هناك ثلاجة لحزم الثلج المقدمة. ولتقليل الخطر المحتمل الذي يشكله هذا الكاشف عند حدوث اتصال مباشر بالجلد أو المخاط، تم توعية المواطنين بهذه المخاطر من خلال إدراج ورقة بيانات السلامة المادية المقدمة في المجموعة ووضع ختم تحذير في الصندوق الذي يحتوي على الأنابيب.
ساعدت طريقة استخراج GITC-chloroform الخام على استعادة آثار الحمض النووي الريبي من المسحات ، وكما هو مبين في تضخيم العينات ارتفعت ، نادرا ما استمرت المثبطات في العينات بعد الاستخراج. العينات، التي كانت سلبية للسارس-CoV-2 وأظهرت أي تثبيط RT-مصباح، تمثل السلبيات الحقيقية أو كان عدد نسخة أقل من LOD في 100٪ التردد. وعلى العكس من ذلك، فإن الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي على السطح لا يعني مباشرة خطر انتقال العدوى عن طريق الاتصال حيث أن عدوى الفيروس من العينات الإيجابية تحتاج إلى اختبار. والفحص السريع للبيئة، الذي لا يقتصر على توافر الإمدادات المتطورة أو الموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا، أمر حاسم لتقييم ما إذا كانت الأسطح تشكل خزانا فيروسيا ولزيادة توجيه جهود الوقاية والاحتواء.
وقد تم اختيار RT-LAMP لتكون أفضل طريقة مناسبة لخط أنابيب الكشف المقترح. وقد ثبت أنها طريقة سريعة وغير مكلفة كانت شديدة المقاومة لمعظم المثبطات المتبقية وحساسة ومحددة مثل طرق RT-qPCR الأخرى. وبسبب استخدامها في البيئات السريرية أثناء جائحة السارس-CoV-2، تأثر توافر مجموعات RT-qPCR بالطلب العالمي. وعلاوة على ذلك، كانت تقنيات RT-qPCR – حتى تلك التي صيغت لمقاومة المثبطات – حساسة للمواد الواردة في العينات البيئية التي جمعتها مجموعة تجريبية من العلماء المواطنين، حتى بعد استخدام استراتيجيات مشتركة أخرى للحد من المنافسة المثبطة للإنزيم الملزم49. وتؤيد هذه النتائج دراسة حديثة قارنت كلا الطريقتين للكشف عن السارس-CoV-2 على عينات مسحة من الحلوى التي يتعامل معها مرضى COVID-19 ووجدت أكثر من 83٪ نتيجة التوافق، مع تثبيط أقل بنسبة 25٪ في العينات التي حللها RT-LAMP15. وعلاوة على ذلك، فإن استخراج النفط الخام GITC-الكلوروفورم، إلى جانب RT-LAMP، خفض تكلفة الكواشف والإمدادات بنسبة 42٪ مقارنة باستخراج عدة الحمض النووي الريبي وRT-qPCR (جدول المواد).
سمحت هذه الطريقة بتحليل الإنتاجية العالية لآلاف عينات المسحة السطحية. وقد تم تجهيز ما يصل إلى 80 بركة، تمثل 640 عينة، في يومين من استخراج الحمض النووي الريبي إلى الكشف عن السارس-CoV-2 بواسطة RT-LAMP. البروتوكول المقترح شبه مهم، ويقتصر على الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي، ولا يشير إلى وجود جزيئات فيروسية عدوى. ويلزم إجراء مزيد من التحليل لتقييم خطر انتقال فيروس سارس-كو-2 من الفوميتات المصابة الموجودة على الأسطح المسحة.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لوضع استراتيجية اختبار بسرعة تتضمن سير عمل فعال عند مواجهة حالة طوارئ صحية مع مرض معدي. وبروتوكول أخذ العينات المقترح بسيط ويستخدم الإمدادات التي توجد عادة في الأسر المعيشية، ويتم تنفيذ طريقة الكشف الفيروسي على المعدات المتاحة في البيئات المختبرية الأساسية مثل حمام المياه بدلا من الدراج الحراري. تكاليف كواشف RT-LAMP أقل بكثير من تلك اللازمة لRT-qPCR وأقل عرضة لسيناريوهات الطلب العالمي المرتفعة. وتعمل هذه الدراسة إطارا لتقييم الخزانات الفيروسية البيئية في الفاشيات الوبائية والأوبئة العالمية في المستقبل.

ويعتقد ان السارس - كوف - 2 ينتقل اساسا عن طريق استنشاق الهباء الجوى الملوث وقطرات من الاتصال المباشر مع الافراد المصابين1و2و3و4. ومع ذلك، خلال المراحل الأولى من وباء COVID-19 العالمي، ركزت الجهود الرامية إلى السيطرة على انتقال السارس-CoV-2 بقوة على تطهير الأسطح وغسل اليدين والتطهير. وبحلول نهاية عام 2020، اعتبرت المبادئ التوجيهية لانتقال العدوى منمنظمة الصحة العالمية 5 والمراكز الأميركية لمكافحة الأمراض والوقاية منها(CDC) 6 أن انتقال العدوى جوا يشكل خطرا بشكل رئيسي عندما يكون على اتصال وثيق (<2 متر) مع شخص مصاب أو في وجود إجراءات طبية مولدة للهباء الجوي. ولم يستبعد بعد التلقيح الذاتى بعد ملامسة السطوح الملوثة او استنشاق الفوميتس الهباء الجوى كطريق لانتقال السارس - كو فى - 2 .
وقد تم الإبلاغ عن حالات COVID-19 حيث يبدو انتقال العدوى المحمولة جوا من غير المرجح7،8. سارس-CoV-2 virions تبقى المعدية على النحاس لمدة تصل إلى 8 ساعة، على الورق المقوى والفولاذ المقاوم للصدأ لمدة تصل إلى 24 ساعة، وعلى البلاستيك لمدة تصل إلى 48 ساعة9. في كابينة السفن السياحية، تم الكشف عن سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي بعد 17 يوما من مغادرة الركاب7. وقد ثبت أن عينات الهواء والسطح المأخوذة من المستشفيات ونظم النقل الجماعي إيجابية بالنسبة لفيروس سارس-كوف-2 وغيره من الفيروساتالتاجية8و10و11و12و13و14. وخلصت دراسة أجريت على التعبئة والتغليف الخارجي للحلوى هالوين التعامل معها من قبل المرضى COVID-19 أعراض غير أعراض ومعتدلة / معتدل، أن الجمع بين غسل اليدين من قبل معالج وغسل الحلوى مع صابون اليد خفضت سارس-CoV-2 الجيش الملكي النيبالي إلى ما دون مستويات العتبة15.
وقد نشرت عدة طرق لتشخيص سارس-CoV-2 استنادا إلى في الوقت الحقيقي عكس النسخ البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (RT-qPCR)16،17،عكس النسخ حلقة بوساطة التضخيم isothermal (RT-LAMP)11،18،19، 20،21،و CRISPR-Cas تقنيات18،19،22،23. معظمها يتطلب مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التي غالبا ما تكون قليلة العرض خلال فترات الطلب العالمي الكبير، وقد استخدمت عدد قليل جدا للفحص البيئي للفيروس24. وقد ثبت أن الكشف عن سارس-CoV-2 RNA باستخدام RT-مصباح أن أكثر من 83٪ توافقت مع استخدام RT-qPCR. وعلاوة على ذلك، أدى RT-مصباح في انخفاض بنسبة 25٪ في نتائج غير حاسمة مقارنة RT-qPCR15.
RT-LAMP هو تقنية بسيطة تستخدم النسخ العكسي لتجميع cDNA من قالب الحمض النووي الريبي25، يليه بوليمرات الحمض النووي مع نشاط قوي للإزاحة الخيطية التي تجمع الحمض النووي في درجة حرارة ثابتة (أي التضخيم الإقذري)26. يتم تحقيق خصوصية أعلى للكشف عن الجينوم الفيروسي باستخدام أربعة أو ستة مبرزات تعترف بست أو ثماني مناطق من الحمض النووي المستهدف. يتم بدء التضخيم من التمهيدي الداخلي وينتج بنية الحمض النووي شبه مزدوجة تقطعت بهم السبل. ثم يتم تضخيم حبلا الرائدة من قبل التمهيدي الخارجي. وتتكرر هذه التضخيمات للمبرمجين العكسي. التهيئة الداخلية والخارجية على أي من الطرفين لديها موقع داخلي التكامل الذاتي العكسي الذي يشكل حلقة في المنتج تضخيم26،27. في إزاحة حبلا isothermal، تخليق الحمض النووي غير المتزامن يولد كميات عالية من المنتج تضخيم حيث البلمرة المستمر تضخيم إشارة من عدد قليل من 10 نسخ لكل رد فعل11،20،28. يتم تخزين مزيج RT-LAMP الملون بشكل ضعيف ويستخدم فينول الأحمر كمؤشر درجة الحموضة. كما يتضمن البوليميراز النيوكليوتيدات، فإنه يطلق بروتون، وسوف ما يكفي من البروتونات تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول، فضلا عن لونه من الوردي إلى الأصفر11،20،28،29.
تم تطوير RT-LAMP للكشف عن الأمراض المنقولة بالبعوض في مرافق الرعاية الصحية الطرفية التي تفتقر إلى مختبرات مجهزة تجهيزا كاملا25 وللكشف السريع عن فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية30. وغالبا ما تفتقر أكثر الفئات السكانية ضعفا في الفاشيات الوبائية - وفقا لتعريف منظمة الصحة العالمية - إلى الموارد الاقتصادية الكافية والمعدات المناسبة لتنفيذ الكشف (جدول أعمال الأمم المتحدة العالمي للصحة العامة). وفي جائحة سارس-كوف-2 الحالية، لم تتمكن إمدادات مثل المسحات الطبية والكواشف الخاصة بمجموعات استخراج الحمض النووي الريبي من تلبية الطلب العالمي، لا سيما في البلدان غير المصنعة. استخدم البروتوكول المقترح استخراج الحمض النووي الريبي الخام القائم على جوانيدينيوم (GITC) ، والذي حافظ بشكل فعال على الحمض النووي الريبي بطريقة مستقلة في السلسلة الباردة وقلل بشكل كبير من استمرار المثبطات من العينة. وعلاوة على ذلك، يستند بروتوكول استخراج كلوروفورم GITC على فصل الحمض النووي الريبي عن الحمض النووي والبروتينات يليه هطول الأمطار المعني، مما يسمح باستعادة معظم المواد الوراثية. وتفوق هذه المزايا المخاطر المحتملة للعلماء المواطنين الذين يتعاملون مع المادة الكيميائية إذا اتخذت تدابير لإبلاغهم على النحو المناسب بالمخاطر.
يستخدم سير العمل المقترح المواد والكواشف ذات الاستخدام العام. وهو يتطلب معدات متاحة في البيئات المختبرية الأساسية، والريفية في كثير من الأحيان. هذه الأساليب غير مكلفة، ومقاومة للغاية للمثبطات الموجودة في كثير من الأحيان في العينات البيئية أو العينات التي لا يمكن معالجتها مع مجموعات الاستخراج، والقضاء على الحاجة إلى دراجة حرارية عالية الدقة. تقدم هذه الدراسة خط أنابيب لأخذ عينات من السارس-CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية على أسطح الأسر والبيئة الحضرية التي يتم لمسها بشكل شائع ونادرا ما يتم تطهيرها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

للسيطرة على انتقال فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) في المجتمع خلال الوباء العالمي لعام 2020، نفذت معظم البلدان استراتيجيات تستند إلى الاختبار البشري المباشر، وتغطية الوجه، وتطهير السطح. 32 - وعلى افتراض أن الطريق الرئيسي لانتقال العدوى يشمل الهباء الجوي وقطرات الجهاز التنفسي، تركزت الجهود المبذولة للكشف عن فيروس سارس -CoV-2 في الفوميت على المواقع المشتبه في ارتفاع معدل انتشارها (مثل عنابر المستشفيات، والسفن السياحية، ونظم النقل الجماعي). وللتحقيق فى وجود السارس - كوف - 2 على الأسطح فى البيئة الحضرية التى نادرا ما يتم تنظيفها ونادرا ما يتم تطهيرها ، تم تجنيد 350 مواطنا من محافظة سان دييجو الكبرى . وفي المجموع، جمع هؤلاء العلماء المواطنون 080 4 عينة. وتم تطوير منصة إلكترونية لرصد تسليم مجموعة العينات والتقاطها، فضلا عن جمع بيانات العينات. وقد بنيت مجموعات أخذ العينات في معظمها من الإمدادات المتاحة في المتاجر التي تعاني من الإجهاد الجائح. وجرى تجهيز العينات باستخدام الكواشف التي يسهل الوصول إليها على الرغم من النقص المتكرر في الإمدادات. وكانت الأساليب المستخدمة حساسة للغاية ومقاومة للمثبطات الموجودة عادة في العينات البيئية. وقد نجحت أساليب التصميم والمعالجة التجريبية المقترحة في إشراك العديد من العلماء المواطنين الذين جمعوا عينات من مناطق سطحية متنوعة بشكل فعال. إن سير العمل والأساليب الموصوفة هنا ذات صلة بمسح البيئة الحضرية بحثا عن فيروسات أخرى، والتي تثير قلقا في مجال الصحة العامة وتشكل تهديدا للأوبئة في المستقبل.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

تم تصميم مشروع علمي للمواطنين لتوظيف سكان سان دييغو لجمع عينات بيئية للسارس-CoV-2. تم إنشاء نظام أساسي متعدد اللغات على شبكة الإنترنت لتقديم البيانات باستخدام واجهة جهاز محمول سهلة الاستخدام. ويسر نظام لإدارة المعلومات المختبرية جمع آلاف العينات المتنوعة جغرافيا مع تتبع النتائج في الوقت الحقيقي.

مسح البيئة الحضرية - خط أنابيب لأخذ عينات من السارس -CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

تقدم هذه الدراسة سير عمل جديد للكشف عن السارس-CoV-2 على الأسطح التي نادرا ما يتم تنظيفها في البيئة الحضرية، مثل مقابض مضخات الغاز والملاعب وأجهزة الصراف الآلي. وفي حالة الجائحة، تندر الإمدادات. نحن نستخدم مواد وأجهزة ومعدات يمكن الحصول عليها بسهولة في البيئات المختبرية الأساسية.نحن نستخدم طريقة استخراج تحافظ على الحمض النووي الريبي دون سلسلة باردة ، وطريقة اكتشاف مقاومة للمثبطات. وهذا البروتوكول يخدم مصلحة الصحة العامة. وهو يوفر إطارا لتقييم الخزانات الفيروسية البيئية لوباء COVID-19 الحالي وغيره من العوامل المعدية خلال الفاشيات العالمية في المستقبل.توظيف العلماء المواطنين باستخدام دعوة مباشرة وواضحة للعمل تم إصدارها عبر وسائل الإعلام المحلية والاجتماعية. إنشاء مقبض وسائل الاعلام الاجتماعية لربط الموضوع عبر محتوى وسائل الاعلام الاجتماعية. إنشاء رابط إلى SMP ، وتوفير المكونات متعددة اللغات لتمكين الملاحة بلغات متعددة للأفراد للتقدم بطلب للمشاركة في جهود أخذ العينات البيئية من خلال الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالسلامة البيولوجية المحددة في نموذج عبر الإنترنت.تضمين في قسم أخذ العينات الرسم والبروتوكولات السمعية والبصرية باللغتين الإنجليزية والإسبانية. تصور البيانات الجغرافية المكانية باستخدام واجهة برمجة التطبيقات الجغرافية المكانية التي يسهلها مزود خدمة الكمبيوتر السحابي. تخزين البيانات المقدمة إلى نظام إدارة المعلومات من خلال SMP لتسهيل التخزين المركزي وتتبع سير العمل المعالجة وإدارة الخدمات اللوجستية.معلومات التحميل المسبق مثل معرف مجموعة العينات، معرف العينة، التاريخ، الوقت، وإحداثيات نظام تحديد المواقع العمومي لتمكين التوافق مع نوع البيانات وتقليل الخطأ. قم بتضمين رابط طلب استلام عينة للمشاركين، والذي يمكنهم استخدامه بمجرد جمع جميع العينات. بناء مجموعة تحتوي على جميع لوازم أخذ العينات، بما في ذلك معدات الحماية الشخصية اللازمة، مثل القناع والقفازات، وبروتوكول أخذ العينات، والمعلومات ذات الصلة بالسلامة البيولوجية.نادرا ما كانت المسحة تطهر الأسطح في الأسر والبيئة الحضرية عن طريق ترطيب مسحة ماصة من البوليستر مربع سنتيمتر واحد بمنظف ومسح سطح مساحته 10 سنتيمترات مربعة. بمساعدة مسواك، غمر كل مسحة عينة في أنبوب المسمى مسبقا تحتوي على 200 ميكرولتر من ثيوسيانات جوانيدينيوم. ارتداء قناع المقدمة وزوج جديد من القفازات لجمع كل عينة لتجنب التلوث المتبادل.بعد الانتهاء من أخذ العينات، استخدم مطهر اليد المقدم. تخزين الأنابيب في أربع درجات مئوية حتى يتم نقلها إلى المختبر. بمجرد وصول العينات إلى المختبر، قم بتخزينها عند درجة حرارة ناقصة 80 درجة مئوية.لزيادة سرعة الفحص، قم بمعالجة العينات في المسابح. إذا كان تجمع إيجابي، استخراج الحمض النووي الريبي من كل عينة بشكل مستقل. الجمع بين العينات من كل مجموعة أخذ العينات في اثنين من برك عن طريق تجميع 50 ميكرولتر من كل من العينات الثمانية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وحفظ العينات المتبقية في ناقص 80 درجة مئوية.إضافة 80 ميكرولتر من الكلوروفورم ودوامة لمدة 15 ثانية. ثم تحتضن لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. جهاز الطرد المركزي في 13، 000 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.نقل طبقة مائي في أنبوب جديد للطرد المركزي. تخزين الواجهة المتبقية والسائل الوردي في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. هذه الكسور تحتوي على الحمض النووي والبروتينات.استخراج الحمض النووي الريبي من الطبقة المائية المستردة باستخدام بروتوكول استخراج خام الحمض النووي الريبي القائم على جوانيدينيوم ثيوسيانات. قم بإعداد مزيج رد فعل RT-LAMP في درجة حرارة الغرفة مع حجم زائد بنسبة 10٪ لحساب فقدان الأنابيب. إضافة خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي إلى رد فعل العينة وخمسة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي بالإضافة إلى 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية سارس-CoV-2 إلى رد الفعل ارتفعت.إضافة 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الاصطناعية سارس-CoV-2 إلى السيطرة الإيجابية وخمسة ميكرولترات من المياه إلى السيطرة السلبية. تخلط جيدا وتدور أسفل ردود الفعل. بالنسبة لمراقبة الألوان، يشار إلى النتيجة السلبية باللون الوردي ويشار إلى نتيجة إيجابية باللون الأصفر.بعد RT-مصباح، إجراء إلكتروفورسيس هلام. يتم عرض توزيع مواقع جمع العينات هنا. وقد اكتملت معظم مجموعات المواد، وحملت البيانات المقابلة إلى النظام.وكان الحد الأقصى للكشف على تردد 100٪ 500 نسخة لكل 25 ميكرولتر من التفاعل. في COLORImetric RT-LAMP، تغيرت العينات الإيجابية اللون من الوردي إلى الأصفر بسبب تحول رقم الحموضة من ثمانية إلى 5.5. في أرقام النسخ المنخفضة ، تم تشغيل العينات على هلام agarose لتأكيد الإيجابيات مع نمط يشبه السلم الناتج.تم اختبار أساليب RT QPCR مع عينات بيئية. كانت جميع الخلطات الرئيسية حساسة للمثبطات بتركيزات عدد النسخ المنخفضة للتحكم الإيجابي. في تركيزات منخفضة من القالب، أظهرت أساليب RT PCR التقليدية إيجابيات كاذبة وسلبيات كاذبة.وأخيرا، كشفت تقنية تسمى تضخيم الدائرة الدوارة عن كميات صغيرة من التسلسل المستهدف. ومع ذلك ، فإنه أظهر تضخيم التحقيق في غياب قالب الجيش الملكي النيبالي. ومن الأهمية بمكان إطلاق نداء للعمل يصل إلى جميع قطاعات المجتمع المحلي بحيث تمثل العينة حقا خطر تعرض جميع أفراد ذلك المجتمع.يكشف هذا الإطار عن المادة الوراثية سارس-CoV-2. الدراسات لاختبار الجدوى الفيروسية هي الخطوة التالية.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

أخذ عينات الدم من الوريد الذيل الأفقي من الفئران

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

بروتوكول شاشة إشارة متحولة لتوفير العمالة وتكرارها لدراسة الثيغمومورفولوجينيس لمصنع نموذجي أرابيدوبسيس ثاليانا

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...