Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

We danken de onderzoekers van het Viral Information Institute (VII), Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin en Dr. Jennifer Smith voor het nemen van de tijd om talloze monsters te verzamelen. We danken ook Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre en Dr. Sarah Allard van de afdeling Kindergeneeskunde van de School of Medicine University of San Diego California (UCSD) voor het faciliteren van positieve controles en nuttige feedback. We danken Stacey Carota (SDSU College of Sciences) en Gina Spidel (SDSU) voor logistieke ondersteuning en Juan Rodríguez voor de kunst en grafische vormgeving van het samplingprotocol. We danken alle deelnemers voor hun inzet en toewijding aan dit project in zeer moeilijke tijden. Dit werk werd ondersteund door een genereuze donatie van Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) en de National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).

Zie de tabel met materialen voor een gedetailleerde lijst van reagentia en benodigdheden, inclusief catalogusnummers, fabrikant en bijbehorende kosten.
1. Bemonstering van de stedelijke omgeving
<ol><li>Burgerwetenschapper outreach<ol><li>Rekruteer burgerwetenschappers met behulp van een directe en duidelijke call-to-action die wordt vrijgegeven via lokale en sociale media. Maak een handvat voor sociale media (bijvoorbeeld #swab4corona) om het onderwerp te verbinden met sociale media-inhoud.</li>
		<li>Maak een e-mailaccount aan voor directe communicatie tussen het laboratoriumteam en elke burgerwetenschapper, beheerd door een persoon die vloeiend de belangrijkste talen van de regio van belang spreekt (bijv. Spaans en Engels voor San Diego County).</li>
		<li>Bouw een beveiligd webgebaseerd sample management platform (SMP) om te dienen als database, een laboratoriuminformatiebeheersysteem (LIMS) en om te communiceren met burgerwetenschappers. OPMERKING: De SMP biedt een gecentraliseerde locatie waar gebruikers een kit aanvragen, toegang krijgen tot protocollen voor het verzamelen van monsters, metagegevens van monsters indienen en een pick-up aanvragen voor voltooide voorbeeldkits.</li>
		<li>Maak een koppeling naar het SMP (bijv. https://demo.covidsample.org/) (figuur 1) voor personen om een aanvraag in te dienen om deel te nemen aan de milieubemonsteringsinspanning door bioveiligheidsgerelateerde vragen te beantwoorden die in een onlineformulier zijn gespecificeerd.</li>
		<li>Beveilig de toegang tot de SMP met behulp van een authentication application programming interface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. Geef goedgekeurde gebruikers toegang tot het SMP. OPMERKING: Raadpleeg de literatuur voor een beschrijving van het OAuth 2.0-protocol31 voor verificatie en autorisatie. Het biedt een wrijvingsloos aanmeldingsproces voor vrijwilligers van burgerwetenschappers. Het stelt gebruikers ook in staat om zich aan te melden met een bestaand account, waardoor het niet nodig is om een aangepaste aanmeldings oplossing te maken en gebruikers referenties te beheren, wat een aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaart en deelname aanmoedigt. Volgens recente rapporten heeft de gratis e-mailservice die beschikbaar is voor de gekozen cloudcomputerserviceprovider ongeveer 1,5 miljard maandelijks actieve e-mailgebruikers; het vereisen van een e-mailaccount van deze serviceprovider voor deelname wordt niet beschouwd als een ontmoedigende factor.</li>
		<li>Leg het doel van de studie- en bioveiligheidsoverwegingen uit aan de burgerwetenschappers van het SMP voordat ze hun eerste kit aanvragen. Zorg voor een meertalige plug-in om navigatie mogelijk te maken in een van de talen die beschikbaar zijn via een meertalige neurale machinevertalingsservice die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider.</li>
		<li>Neem in de steekproefsectie grafische en audiovisuele protocollen op in het Engels en Spaans.</li>
		<li>Wijs een unieke id toe aan elke kit en ontwerp de gebruikersinterface om knoppen te gebruiken die zijn gekoppeld aan Sample ID om het gegevensinvoerproces te stroomlijnen (Figuur 1A).</li>
		<li>Gebruik een software voor het plannen van bezorgroutes met een applicatie voor mobiele apparaten die door chauffeurs moet worden gebruikt om bezorg-/ophaalroutes te optimaliseren en burgerwetenschappers op de hoogte te stellen van nauwkeurige geschatte aankomsttijden.</li>
		<li>Bouw het LIMS-platform op een PHP-webservicestack en host het op een commercieel hostingplatform (aanbevolen besturingssysteem, webserversoftware en databasesoftware zijn gespecificeerd in de tabel met materialen).</li>
		<li>Zorg voor een veilige webgebaseerde applicatie-interface waarmee laboratoriumpersoneel gegevens snel en eenvoudig kan beheren in het LIMS. Zorg voor gegevensvisualisatie met behulp van een data Charting Application Programming Interface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider.</li>
		<li>Visualiseer georuimtelijke gegevens met behulp van een georuimtelijke applicatieprogrammeringsinterface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. De gegevens die via het SMP bij het LIMS worden ingediend, opslaan om (1) gecentraliseerde opslag van projectgegevens te vergemakkelijken; (2) het volgen van workflows voor monster- en gegevensverwerking; en (3) beheer van de logistiek van de distributie van monsterkits aan burgerwetenschappers.</li>
		<li>Beveiligde ingediende metagegevens met behulp van best practices (bijv. https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>Pre-load informatie zoals Sample Kit ID, Sample ID, datum, tijd en Global Positioning System (GPS) coördinaten (automatisch verzameld uit een afbeelding van de site) om naleving van het gegevenstype mogelijk te maken en het indienen van onjuiste of ontbrekende gegevens door de gebruiker te minimaliseren (Figuur 1B). Voeg de volgende velden toe die handmatig en snel (<1 min) door de burgerwetenschapper moeten worden ingevuld: datum en tijd van verzameling, een korte beschrijving van de locatie en een foto van de bemonsteringslocatie.</li>
		<li>Reinig alle geüploade gegevens en valideer voor het gegevenstype. Valideer bijvoorbeeld afbeeldingsgegevens die door gebruikers zijn geüpload om .jpg bestanden te selecteren, hernoem ze met Sample ID voor snelle koppeling met het voorbeeld en sla geüploade afbeeldingen op op een afzonderlijke beveiligde locatie die niet toegankelijk is voor gebruikers.</li>
		<li>Activeer de optie om de levering en afhaling van de kit aan te vragen wanneer alle monsters (16) zijn voltooid. Activeer bovendien de optie om een nieuwe kit aan te vragen die moet worden geleverd bij het ophalen van de vorige (Figuur 1A). OPMERKING: Voor vrijwilligers die de voorkeur geven aan een niet-webgebaseerd platform en voor degenen die zich zorgen maken over het bekendmaken van hun GPS-locatie (bijv. leden van de gemeenschap die zich zorgen maken over hun migratiestatus), kunnen kits worden geleverd op een overeengekomen vergaderlocatie en vrijwilligers worden gevraagd om een schriftelijke versie van de gegevensverzameling op te nemen. Voor communicatie tussen het laboratorium en elke burgerwetenschapper, heb een tweetalig lid van het project beschikbaar voor telefoongesprekken en sms'jes.</li>
	</ol></li>
	<li>Swab voor Corona<ol>
<li>Identificeer een epidemiologisch relevant tijdvenster voor de bemonsteringsinspanning.</li>
		<li>Bouw een kit die alle bemonsteringsbenodigdheden bevat, inclusief de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen (d.w.z. masker, handschoenen), een bemonsteringsprotocol en relevante informatie over bioveiligheid (figuur 2). Label elke buis vooraf met de toegewezen unieke id (sample-ID).</li>
		<li>Swab zelden gedesinfecteerde oppervlakken die worden blootgesteld aan aerosolized fomites in huishoudens en de stedelijke omgeving.<ol>
<li>Draag het meegeleverde masker in het openbaar en een nieuw paar handschoenen voor het verzamelen van elk monster om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik na het beëindigen van de bemonstering het meegeleverde handdesinfecterend middel.</li>
			<li>Bevochtig een 1 cm2 polyester absorberend wattenstaafje (bijv. dweilpads) met een reinigingsmiddel (bijv. 0,5% natriumdodecylsulfaat (SDS)) om het virus te inactiveren door de envelop te verstoren en het naakte RNA te stabiliseren door het uitvouwen van RNases32op te wekken .</li>
			<li>Wattenstaafje een oppervlak van 10 cm2. Laat elk monsterswab met behulp van een tandenstoker volledig onderdompelen in de overeenkomstige voorgelabelde buis met 200 μL guanidiniumthiocyanaatoplossing (GITC). Bewaar buizen bij 4 °C totdat ze naar het laboratorium worden vervoerd. Zodra de monsters in het laboratorium aankomen, bewaar ze bij -80 °C. OPMERKING: GITC is een giftige irriterende stof; vermijd contact met de huid. GITC-oplossing is eenvoudig te bereiden op basis van gangbare laboratoriumchemicaliën, voor het recept zie33,34. Het inactiveert het virus, stabiliseert RNA door RNases34,35, 36te denatureren en stabiliseert monsters bijkamertemperatuur. De kit bevat echter ijspakketten om de monsters koud te houden zonder dat u huishoudelijke koelkasten hoeft te gebruiken voor opslag.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. SARS-CoV-2 detectie
<ol><li>Totale RNA-isolatie<ol>
<li>Desinfecteer oppervlakken, apparatuur en pipettors met een oplossing van 2 mM kopersulfaat en 3% waterstofperoxide; gevolgd door een oplossing van 10% bleekmiddel, 90 mM natriumbicarbonaat, 5% SDS en 2,5% NaOH. Veeg grondig af met gedestilleerd water gevolgd door 75% ethanol. OPMERKING: Deze oplossingen zijn een alternatief voor de commercieel beschikbare oplossingen.</li>
		<li>Dooimonsters op ijs. Vortex monsters gedurende 2 min op gemiddelde snelheid.</li>
		<li>Om de snelheid van de screening te verhogen, verwerkt u de monsters in pools. Als een pool positief is, moet u het RNA van elk monster onafhankelijk extraheren om de positieve steekproef(en) te vinden. Combineer de monsters uit elke bemonsteringskit (16 in totaal) in 2 groepen van 8 monsters. OPMERKING: Het hebben van 8 monsters per zwembad betekent dat er slechts 2 zwembaden per kit hoeven te worden verwerkt. Als een pool positief is, worden de afzonderlijke monsters opnieuw verwerkt voor individuele RT-LAMP-analyse. Dit vermindert tijd, kosten en reagentia.</li>
		<li>Pool 50 μL van elk van de 8 monsters in een microcentrifugebuis (totaal volume 400 μL); bewaar het resterende monster bij -80 °C. Voeg 0,2 volume (80 μL) chloroform, vortex gedurende 15 s toe en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten bij 4 °C. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C.</li>
		<li>Breng de waterige (heldere vloeistof) laag over in een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar de resterende interface en roze vloeistof in de vriezer van -80 °C; deze fracties bevatten DNA en eiwitten33,36.</li>
		<li>Voeg een gelijk volume isopropanol (~200 μL) en 2,6 μL glycogeen coprecipitant (15 mg ml-1)37toe. Meng goed en incubeer bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door 4 °C gedurende 10 minuten om RNA te precipiëren. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door monsters 's nachts bij -20 °C te incuberen in plaats van 1 uur.</li>
		<li>Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 50 μL met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water en voeg een gelijk volume (50 μL) RNase-vrij 5 M ammoniumacetaat en 2,5 volumes (250 μl) 100% ethanol7,38toe . OPMERKING: Ammoniumionen remmen polynucleotidekinase bij gebruik in een downstreamproces38. Het mengsel precipitateert RNA terwijl deoxynucleosidetrifosfaten en oligosachariden in oplossing38achterblijven .</li>
		<li>Meng goed en incubeer bij -20 °C gedurende ten minste 1 uur, gevolgd door 4 °C gedurende 10 minuten om RNA te precipiëren. OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd door monsters 's nachts bij -20 °C te incuberen in plaats van 1 uur.</li>
		<li>Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 min bij 4 °C. Was de pellet met 1 ml koude (-20 °C), vers gemaakt van 75% ethanol. Centrifugeer bij 8.000 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een P10 pipet om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord.</li>
		<li>Droog de pellet 10-15 minuten aan de lucht totdat er geen ethanol meer over is. Resuspend de pellet in 50 μL MET DEPC behandeld water, voeg 5 μL 10x DNase buffer + 1μL DNase (2 Eenheden μL-1)toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.</li>
		<li>Voeg 0,1 volume (5,6 μL) DNase inactivatiereagens toe, incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur en meng elke minuut voorzichtig. Centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 2 minuten en breng supernatant over naar een nieuwe buis (~50 μL). Plaats de buis onmiddellijk op ijs tijdens het voorbereiden van de RT-qPCR- of RT-LAMP-reacties of bewaar deze in een vriezer van -20 °C. OPMERKING: Voer RNA-isolatie uit in een ampliconvrije ruimte om overlast te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplex reverse-transcription loop-gemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP)<ol>
<li>Bereid een 20X primer mix oplossing (Tabel 1) voor elke set primers (Tabel 2). Bereid de RT-LAMP reactiemix (tabel 3) voor op kamertemperatuur met 10% overtollig volume om het pipetverlies te verklaren. OPMERKING: De colorimetrische LAMP 2X mastermix met Antarctisch thermolabiel uracil-DNA glycosylase (UDG) voorkomt versterking van DNA-besmetting door eerdere reacties20,28.</li>
		<li>Draai en draai het mengsel naar beneden. Verdeel 20 μL van het mengsel in elke reactiebuis: steekproef, spiked, positieve controle,en negatieve controle. Incubeer de reacties in de buizen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, zodat de UDG kan reageren op mogelijke overdrachtsverontreiniging.</li>
		<li>Voeg 5 μL RNA toe aan de monsterreactie, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopieën) synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de piekreactie, 2,5 μL (450 kopieën) synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de positieve controlereactie en 5 μL H2O aan de negatieve controlereactie. Meng goed en draai de reacties naar beneden; ontdooi alle RNA op ijs.</li>
		<li>Terwijl de thermocycler, of het waterbad, wordt verwarmd tot 65 °C, laat u alle reacties op kamertemperatuur blijven. De UDG wordt bij >50 °C ingeactiveerd. Plaats de reacties in de thermocycler (gebruik het deksel), incubeer gedurende 40 minuten op 65 °C en laat de reacties 5 minuten op kamertemperatuur komen (~22 °C) of koel 1 minuut af op ijs. Analyseer de resultaten met behulp van de colorimetrische functie (eenvoudige observatie) of door de producten in een agarose gel uit te voeren. OPMERKING: Hoewel de detectielimiet (LOD) 10 kopieën per reactie bedraagt, neemt de detectiefrequentie toe naarmate het kopieeraantal 500 kopieën per reactie nadert (figuur 3A). Houd er bij colorimetrische waarneming rekening mee dat een negatief resultaat wordt aangegeven met roze (pH = 8,8), terwijl een positief resultaat wordt aangegeven door geel (pH = 5) (figuur 3B). De colorimetrische optie vermijdt het openen van de RT-LAMP-buizen na versterking, waardoor het volume van de RT-LAMP-producten in de werkomgeving en overdrachtsverontreiniging wordt verminderd. Voor gelelektroforese, bereid een 1,5% agarosegel met 1X DNA-gelvlek in 0,5% Tris / Borate / EDTA (TBE) buffer. Laad 25 μL van de reactie + 5 μL 6X ladingskleurstof in elke put. Voer de gel 60 minuten uit op 100 V. Een moleculaire marker is niet nodig omdat positieve monsters een ladderpatroon vertonen (figuur 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Alle auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen bestaan.

Burgerwetenschapper engagement. Burgerwetenschappers werden gerekruteerd om oppervlakken in San Diego County uit te nemen om de aanwezigheid van SARS-CoV-2 in de stedelijke omgeving te bemonsteren en te detecteren. De meeste geleverde bemonsteringskits (70%) werden teruggestuurd naar het laboratorium, en daarvan waren bijna alle monsters compleet (91%) (figuur 3A,B en tabel 4). Vrijwilligers konden eenvoudig kitlevering / afhaling aanvragen via het webgebaseerde platform en de software voor het plannen van bezorgroutes bracht burgerwetenschappers op de hoogte van geschatte aankomsttijden, beide waarschijnlijk belangrijke factoren voor het waargenomen succes. De gemiddelde tijd vanaf het moment dat de kit aan de burgerwetenschapper werd geleverd tot het moment dat het naar het laboratorium werd teruggebracht, was 8 dagen, met een mediaan van 3 dagen en een bereik van 1-64 dagen (figuur 3A en tabel 4). Vaker herinneringen aan vrijwilligers zouden deze vertraging waarschijnlijk verminderen.
Het dataverzamelingsplatform werd met succes gebruikt door een grote meerderheid van de gebruikers (73%) (Tabel 4). Hoewel de inspanningen van de burgerwetenschappers niet werden gemeten, toonden veldtests aan dat het platform voor gegevensverzameling de inspanning en tijd die nodig was om de monsterverzameling goed te voltooien, aanzienlijk verminderde. Het verminderen van de hoeveelheid boekhouding stimuleerde dus de betrokkenheid van burgerwetenschappers. Het webgebaseerde platform was bedoeld om demografische beperkingen te overwinnen door een meertalige neurale machinevertalingsservice te bieden en door grafische en audiovisuele protocollen in het Engels en Spaans te bieden. Dit was slechts gedeeltelijk succesvol omdat er minder monsters werden verzameld van zowel de South Bay als North County, waar het grootste deel van de Spaanse / Latino-bevolking van de provincie45woont. Deze gebieden herbergden ook 63% (1.700 gevallen per 100.000) van de totale COVID-19-gevallen in San Diego County met de hoogste prevalentie van de ziekte46 en het aantal ziekenhuisopnames (62%)47,48. Hoewel de meeste monsters afkomstig waren uit Central County, werd een representatief aantal verzameld uit de meest door COVID-19 getroffen districten en slechts een klein deel van de monsters was positief, wat suggereert dat oppervlaktereservoirs van SARS-CoV-2 in de stedelijke omgeving relatief zeldzaam zijn.
Monsterverwerking. Bemonsteringsdoekjes werden bevochtigd met SDS, die het virus activeerde door de envelop te verstoren en het naakte RNA stabiliseerde door RNases32uit te klappen. Handig tijdens het ophalen, het reinigingsmiddel in het wattenstaafje reinigde het bemonsterde oppervlak. Milieumonsters bevatten vaak zeer kleine hoeveelheden RNA. Om het herstel te maximaliseren, werd RNA-isolatie uitgevoerd met behulp van een gitc-gebaseerde, kolomvrije, ruwe extractiemethode. GITC, een sterk chaotropisch middel, verstoort de waterstofbindingen die het vouwen van eiwitten behouden (d.w.z. hydrofoob effect). Deze actie resulteert in de inactivatie van virale deeltjes en het RNA blijft stabiel als gevolg van de remming van RNAses34,35,36. De GITC-oplossing handhaafde de stabiliteit van de RNA-monsters zonder strikte overwegingen van de koelketen, waardoor de burgers de monsters op kamertemperatuur konden houden als er geen vriezer voor de meegeleverde ijsverpakkingen beschikbaar was. Om het potentiële gevaar van dit reagens bij direct contact met de huid of slijmvlies te verminderen, werden burgers op de hoogte gebracht van deze risico's door een materiaalveiligheidsinformatieblad in de kit op te nemen en werd een waarschuwingszegel in de doos met de buizen geplaatst.
De ruwe GITC-chloroform extractiemethode hielp bij het terugwinnen van sporen van RNA uit de swabs, en zoals blijkt uit de versterking van spiked samples, bleven remmers zelden in de monsters aanwezig na extractie. Monsters, die negatief waren voor SARS-CoV-2 en geen RT-LAMP-remming vertoonden, vertegenwoordigden echte negatieven of hadden een lager kopieernummer dan de LOD met een frequentie van 100%. Omgekeerd impliceert de detectie van viraal RNA op een oppervlak niet direct het risico van overdracht door contact, aangezien de infectiviteit van het virus uit positieve monsters moet worden getest. Een snelle screening van het milieu, niet beperkt door de beschikbaarheid van geavanceerde voorraden of hooggekwalificeerd personeel, is van cruciaal belang om te beoordelen of oppervlakken een viraal reservoir vormen en om de inspanningen op het gebied van preventie en insluiting beter te sturen.
RT-LAMP is geselecteerd als de beste methode die geschikt is voor de voorgestelde detectiepijplijn. Het bleek een snelle en goedkope methode te zijn die zeer resistent was tegen de meeste resterende remmers en net zo gevoelig en specifiek was als andere RT-qPCR-methoden. Vanwege het gebruik ervan in klinische omgevingen tijdens de SARS-CoV-2-pandemie, werd de beschikbaarheid van RT-qPCR-kits beïnvloed door de wereldwijde vraag. Bovendien waren RT-qPCR-technieken — zelfs die welke zijn geformuleerd om remmers te weerstaan — gevoelig voor stoffen in de milieumonsters die werden verzameld door een proefcohort van burgerwetenschappers, zelfs na het gebruik van andere gemeenschappelijke strategieën om de concurrentie van remmers voor enzymbinding te verminderen49. Deze bevindingen worden bevestigd door een recente studie die beide methoden vergeleek om SARS-CoV-2 te detecteren op swabmonsters van snoep dat door COVID-19-patiënten werd behandeld en meer dan 83% resultaat concordantie vond, met 25% lagere remming in monsters geanalyseerd door RT-LAMP15. Bovendien verlaagde de GITC-chloroform ruwe extractie, in combinatie met RT-LAMP, de kosten van reagentia en voorraden met 42% in vergelijking met RNA-kitextractie en RT-qPCR (Tabel met materialen).
Deze methode maakte een analyse met hoge doorvoer van duizenden oppervlakteswabmonsters mogelijk. Tot 80 pools, die 640 monsters vertegenwoordigen, werden verwerkt in 2 dagen van RNA-extractie tot SARS-CoV-2-detectie door RT-LAMP. Het voorgestelde protocol is semiquantitative, beperkt tot de detectie van viraal RNA, en wijst niet op de aanwezigheid van besmettelijke virale deeltjes. Verdere analyse is nodig om het risico van overdracht van SARS-CoV-2 van geïnfecteerde fomites aanwezig op de geswabde oppervlakken te beoordelen.
Deze studie presenteert een protocol om snel een teststrategie op te zetten die een effectieve workflow omvat wanneer u wordt geconfronteerd met een gezondheidscrisis met een overdraagbare ziekte. Het voorgestelde bemonsteringsprotocol is eenvoudig en maakt gebruik van benodigdheden die vaak in huishoudens worden aangetroffen, en de virale detectiemethode wordt uitgevoerd op apparatuur die beschikbaar is in basislaboratoriuminstellingen, zoals een waterbad in plaats van een thermocycler. De kosten van RT-LAMP-reagentia zijn aanzienlijk lager dan die welke nodig zijn voor RT-qPCR en zijn minder gevoelig voor scenario's met een hoge wereldwijde vraag. Deze studie dient als kader voor de beoordeling van virale reservoirs in het milieu bij toekomstige epidemie-uitbraken en wereldwijde pandemieën.

Sars-CoV-2 wordt verondersteld hoofdzakelijk via de inademing van besmette aërosolen en druppeltjes van direct contact met besmette individuen1,2,3,4worden overgedragen . Tijdens de eerste fasen van de wereldwijde COVID-19-pandemie waren de inspanningen om de overdracht van SARS-CoV-2 te beheersen echter sterk gericht op het desinfecteren van oppervlakken, handen wassen en ontsmetten. Tegen het einde van 2020 beschouwden transmissierichtlijnen van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO)5 en de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 transmissie in de lucht voornamelijk als een gevaar wanneer ze in nauw contact (<2 m) met een geïnfecteerde persoon of in aanwezigheid van aërosolgenererende medische procedures. Zelfinenting na contact met verontreinigde oppervlakken of inademing van aërosolviëring van fomites moet nog worden uitgesloten als transmissieroute van SARS-CoV-2.
COVID-19-gevallen zijn gemeld waarbij transmissie in de lucht onwaarschijnlijk lijkt7,8. SARS-CoV-2 virionen blijven besmettelijk op koper gedurende maximaal 8 uur, op karton en roestvrij staal gedurende maximaal 24 uur en op plastic voor maximaal 48 uur9. In cruiseschipcabines werd SARS-CoV-2 RNA gedetecteerd 17 dagen nadat de passagiers waren vertrokken7. Lucht - en oppervlaktemonsters van ziekenhuizen en massatransportsystemen zijn positief getest op SARS-CoV-2 en andere coronavirussen8,10,11,12,13,14. Een studie uitgevoerd op de buitenste verpakking van Halloween snoep behandeld door asymptomatische en matige / licht symptomatische COVID-19 patiënten, concludeerde dat de combinatie van handen wassen door de handler en het wassen van het snoep met handzeep SARS-CoV-2 RNA verlaagde tot onder drempelniveaus15.
Verschillende methoden voor SARS-CoV-2-diagnostiek zijn gepubliceerd op basis van real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)16,17, reverse-transcription loop-mediated isotherme amplification (RT-LAMP)11,18,19,20,21en CRISPR-Cas technologies18,19,22,23. De meeste vereisen RNA-extractiekits die vaak schaars zijn tijdens perioden van aanzienlijke wereldwijde vraag, en zeer weinig zijn gebruikt voor milieuscreening van het virus24. De detectie van SARS-CoV-2 RNA met RT-LAMP is aangetoond dat het meer dan 83% concordant is voor het gebruik van RT-qPCR. Bovendien resulteerde RT-LAMP in een vermindering van 25% in onduidelijke resultaten in vergelijking met RT-qPCR15.
RT-LAMP is een eenvoudige techniek die een omgekeerde transcriptase gebruikt om cDNA te synthetiseren uit een RNA-sjabloon25, gevolgd door een DNA-polymerase met sterke strengverplaatsingsactiviteit die DNA synthetiseert bij constante temperatuur (d.w.z. isotherme versterking)26. Hogere specificiteit van virale genoomdetectie wordt bereikt met behulp van vier of zes primers die zes of acht gebieden van het doel-DNA herkennen. Versterking wordt geïnitieerd vanuit een interne primer en levert een semi-dubbelstrengs DNA-structuur op. De voorste streng wordt vervolgens versterkt door een buitenste primer. Deze versterkingen worden herhaald voor de omgekeerde primers. Interne en buitenste primers aan beide uiteinden hebben een interne omgekeerde zelf complementaire plaats die een lus vormt in het versterkingsproduct26,27. Bij isotherme strengverplaatsing genereert asynchrone DNA-synthese grote hoeveelheden versterkt product waarbij continue polymerisatie het signaal van slechts 10 kopieën per reactie11,20,28versterkt . De colorimetrische RT-LAMP mix is zwak gebufferd en gebruikt fenolrood als pH-indicator. Omdat het polymerase een nucleotide bevat, geeft het een proton vrij en zullen voldoende protonen de pH van de oplossing en de kleur ervan veranderen van roze naar geel11,20,28,29.
RT-LAMP is ontwikkeld voor de detectie van door muggen overgedragen ziekten in perifere gezondheidszorgfaciliteiten zonder volledig uitgeruste laboratoria25 en voor de snelle detectie van andere RNA-virussen zoals humaan immunodeficiëntievirus30. De meest kwetsbare bevolkingsgroepen in uitbraken van epidemieën - volgens de definitie van de WHO - beschikken vaak niet over voldoende economische middelen en de juiste apparatuur om detectie uit te voeren (Global Public Health Agenda van de Verenigde Naties). In de huidige SARS-CoV-2-pandemie zijn voorraden zoals medische swabs en reagentia voor RNA-extractiekits niet in staat geweest om aan de wereldwijde vraag te voldoen, vooral in niet-productielanden. Het voorgestelde protocol gebruikte een op guanidinium thiocyanaat (GITC) gebaseerde ruwe RNA-extractie, die het RNA effectief op een koudeketenonafhankelijke manier bewaarde en de persistentie van remmers uit het monster aanzienlijk verminderde. Bovendien is het GITC-chloroform extractieprotocol gebaseerd op de scheiding van RNA van DNA en eiwitten gevolgd door de respectieve neerslag, waardoor het grootste deel van het genetische materiaal kan worden teruggevorderd. Deze voordelen wegen op tegen de potentiële gevaren van burgerwetenschappers die met de chemische stof omgaan als er maatregelen worden genomen om hen op passende wijze te informeren over de risico's.
De voorgestelde werkstroom maakt gebruik van materialen en reagentia die algemeen van nut zijn. Het vereist apparatuur die beschikbaar is in basis, vaak landelijke, laboratoriumomgevingen. Deze methoden zijn goedkoop, zeer resistent tegen remmers die vaak worden aangetroffen in milieumonsters of monsters die niet kunnen worden verwerkt met extractiekits, en elimineren de noodzaak van een zeer nauwkeurige thermocycler. Deze studie presenteert een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs op algemeen aangeraakte en zelden gedesinfecteerde oppervlakken van huishoudens en het stedelijke milieu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

Om de overdracht door de gemeenschap van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) tijdens de wereldwijde pandemie van 2020 te beheersen, hebben de meeste landen strategieën geïmplementeerd op basis van directe menselijke tests, gezichtsbedekking en oppervlaktedesinfectie. In de veronderstelling dat de belangrijkste transmissieroute aerosolen en ademhalingsdruppels omvat, hebben de inspanningen om SARS-CoV-2 bij vijanden te detecteren zich gericht op locaties die worden verdacht van een hoge prevalentie (bijv. ziekenhuisafdelingen, cruiseschepen en massatransportsystemen). Om de aanwezigheid van SARS-CoV-2 te onderzoeken op oppervlakken in de stedelijke omgeving die zelden worden gereinigd en zelden gedesinfecteerd, werden 350 burgers in dienst nemen uit de grotere San Diego County. In totaal verzamelden deze burgerwetenschappers 4.080 monsters. Een online platform werd ontwikkeld om de levering en afhaling van samplingkits te monitoren en om monstergegevens te verzamelen. De bemonsteringskits werden meestal gebouwd op basis van benodigdheden die beschikbaar waren in winkels met pandemieën. Monsters werden verwerkt met reagentia die gemakkelijk toegankelijk waren ondanks het terugkerende aanbodtekort. De gebruikte methoden waren zeer gevoelig en resistent tegen remmers die vaak aanwezig zijn in milieumonsters. De voorgestelde experimentele ontwerp- en verwerkingsmethoden waren succesvol in het betrekken van tal van burgerwetenschappers die effectief monsters uit verschillende oppervlakken verzamelden. De hier beschreven workflow en methoden zijn relevant om de stedelijke omgeving te onderzoeken op andere virussen, die van belang zijn voor de volksgezondheid en een bedreiging vormen voor toekomstige pandemieën.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Een citizen science project is ontworpen om inwoners van San Diego te werven om milieumonsters te verzamelen voor SARS-CoV-2. Er is een meertalig webgebaseerd platform gemaakt voor het indienen van gegevens met behulp van een gebruiksvriendelijke interface voor mobiele apparaten. Een laboratoriuminformatiebeheersysteem vergemakkelijkte het verzamelen van duizenden geografisch diverse monsters met realtime resultaattracking.

Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Deze studie presenteert een nieuwe workflow om SARS-CoV-2 te detecteren op oppervlakken die zelden worden gereinigd in de stedelijke omgeving, zoals gaspompgrepen, speeltuinen en geldautomaten. In een pandemie zijn voorraden schaars. We gebruiken gemakkelijk verkrijgbare materialen en reagentia en apparatuur die beschikbaar zijn in basislaboratoriuminstellingen.We gebruiken een extractiemethode die het RNA behoudt zonder koudeketen en een detectiemethode die bestand is tegen remmers. Dit protocol is van belang voor de volksgezondheid. Het biedt een kader voor de beoordeling van virale reservoirs voor het milieu voor de huidige COVID-19-pandemie en andere infectieuze agentia tijdens toekomstige wereldwijde uitbraken.Rekruteer burgerwetenschappers met behulp van een directe en duidelijke call-to-action die is vrijgegeven via lokale en sociale media. Maak een handvat voor sociale media om het onderwerp te verbinden met inhoud op sociale media. Maak een koppeling naar het SMP en zorg voor een meertalige plug-in waarmee personen in meerdere talen kunnen navigeren om deel te nemen aan de milieubemonsteringsinspanning door bioveiligheidsgerelateerde vragen te beantwoorden die in een online formulier zijn gespecificeerd.Neem in de steekproefsectie grafische en audiovisuele protocollen op in het Engels en Spaans. Visualiseer georuimtelijke gegevens met behulp van een georuimtelijke applicatieprogrammeringsinterface die wordt gefaciliteerd door een cloudcomputerserviceprovider. Sla de gegevens op die via het SMP bij het LIMS worden ingediend om gecentraliseerde opslag, het volgen van verwerkingsworkflows en het beheer van de logistiek te vergemakkelijken.Informatie vooraf laden, zoals voorbeeldkit-ID, voorbeeld-ID, datum, tijd en globale positioneringssysteemcoördinaten om naleving van gegevenstypen mogelijk te maken en de fout te minimaliseren. Voeg een koppeling voor het ophalen van monsters toe voor de deelnemers, die ze kunnen gebruiken zodra ze alle monsters hebben verzameld. Bouw een kit die alle bemonsteringsbenodigdheden bevat, inclusief de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals masker en handschoenen, een bemonsteringsprotocol en bioveiligheidsrelevante informatie.Swab zelden gedesinfecteerde oppervlakken in huishoudens en de stedelijke omgeving door een vierkante polyester absorberende swab van één centimeter te bevochtigen met een wasmiddel en een oppervlak van 10 centimeter in het kwadraat uit te zwabberen. Onderdompel elk monsterdoekje met behulp van een tandenstoker in de voorgelabelde buis met 200 microliter guanidiniumthiocyanaat. Draag het meegeleverde masker en een nieuw paar handschoenen voor het verzamelen van elk monster om kruisbesmetting te voorkomen.Gebruik na het beëindigen van de bemonstering het meegeleverde handdesinfecterend middel. Bewaar de buizen op vier graden Celsius totdat ze naar het laboratorium worden getransporteerd. Zodra de monsters in het laboratorium aankomen, bewaar ze op min 80 graden Celsius.Om de snelheid van de screening te verhogen, verwerkt u de monsters in pools. Als een pool positief is, moet u het RNA van elk monster onafhankelijk extraheren. Combineer de monsters uit elke bemonsteringskit in twee groepen door 50 microliter van elk van de acht monsters in een microcentrifugebuis te bundelen en de resterende monsters op te slaan bij min 80 graden Celsius.Voeg 80 microliter chloroform en vortex toe gedurende 15 seconden. Incubeer vervolgens 20 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer op 13.000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.Breng de waterige laag over in een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar de resterende interface en roze vloeistof in de min 80 graden Celsius vriezer. Deze fracties bevatten DNA en eiwitten.Extracteer RNA uit de teruggewonnen waterige laag met behulp van een op guanidinium thiocyanaat gebaseerd RNA-protocol voor ruwe extractie. Bereid de RT-LAMP reactiemix voor op kamertemperatuur met 10% overtollig volume om het pipetverlies te verklaren. Voeg vijf microliters RNA toe aan de monsterreactie en vijf microliters RNA plus 2,5 microliter synthetisch SARS-CoV-2 RNA aan de piekreactie.Voeg 2,5 microliter synthetische SARS-CoV-2 RNA toe aan de positieve controle en vijf microliter water aan de negatieve controle. Meng goed en draai de reacties naar beneden. Voor colorimetrische waarneming wordt een negatief resultaat aangegeven door roze en een positief resultaat door geel.Voer na RT-LAMP gelelektroforese uit. De verdeling van de sites voor het verzamelen van monsters wordt hier weergegeven. Een meerderheid van de kits was compleet en de bijbehorende gegevens werden geüpload naar het LIMS.De detectielimiet bij een frequentie van 100% was 500 kopieën per 25 microliter reactie. In de colorimetrische RT-LAMP veranderden positieve monsters van kleur van roze naar geel als gevolg van een pH-verschuiving van acht naar 5,5. Bij lage kopieeraantallen werden monsters op een agarosegel uitgevoerd om de positieven te bevestigen met het resulterende ladderachtige patroon.RT QPCR-methoden werden getest met milieumonsters. Alle mastermixen waren gevoelig voor remmers bij lage copy number concentraties van de positieve controle. Bij lage concentraties van de sjabloon vertoonden traditionele RT PCR-methoden valse positieven en valse negatieven.Ten slotte ontdekte een techniek genaamd rolling circle amplification kleine hoeveelheden van de doelvolgorde. Het toonde echter versterking van de sonde bij afwezigheid van een RNA-sjabloon. Het is van vitaal belang om een oproep tot actie uit te brengen die alle sectoren van de gemeenschap bereikt, zodat de steekproef echt het risico van blootstelling van alle leden van die gemeenschap vertegenwoordigt.Dit raamwerk detecteert SARS-CoV-2 genetisch materiaal. Studies om virale levensvatbaarheid te testen zijn de volgende stap.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detectie van numerieke en structurele veranderingen in alle 24 menselijke chromosomen tegelijk met behulp van een roman OctoChrome FISH-test

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Productie van Weefsel Microarrays, Immunohistochemie vlekken en Digitalisering Binnen het menselijke eiwit Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Collection, Isolatie en Verrijking van natuurlijk voorkomende Magnetotactic Bacteriën van het milieu

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Bloedafname van de Lateral staartader van de Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic analyses van Salmonella uit voedsel en milieu voorbeelden

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Een arbeidsbesparende en herhaalbare Touch-Force signalering Mutant screen protocol voor de studie van Thigmomorphogenesis van een model plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...