Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Nous remercions les chercheurs du Viral Information Institute (VII), la Dre Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, le Dr Gregory Peters, le Dr Stuart A. Sandin et la Dre Jennifer Smith d’avoir pris le temps de prélever de nombreux échantillons. Nous remercions également le Dr Rob Knight, le Dr Jack Gilbert, le Dr Pedro Balda-Ferre et la Dre Sarah Allard du département de pédiatrie de l’École de médecine de l’Université de San Diego en Californie (UCSD) d’avoir facilité les contrôles positifs et les commentaires utiles. Nous remercions Stacey Carota (SDSU College of Sciences) et Gina Spidel (SDSU) pour leur soutien logistique et Juan Rodríguez pour l’art et la conception graphique du protocole d’échantillonnage. Nous remercions tous les participants pour leur engagement et leur dévouement à ce projet en ces temps très difficiles. Ce travail a été soutenu par un généreux don de la Dre Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) et de la subvention RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 de la National Science Foundation (numéro de bourse : 2030479).

Consultez la table des matériaux pour obtenir une liste détaillée des réactifs et des fournitures, y compris les numéros de catalogue, le fabricant et les coûts correspondants.
1. Échantillonnage de l’environnement urbain
<ol><li>Sensibilisation des citoyens scientifiques<ol><li>Recruter des citoyens scientifiques à l’aide d’un appel à l’action direct et clair publié via les médias locaux et sociaux. Créez un handle de médias sociaux (par exemple, #swab4corona)pour connecter le sujet à travers le contenu des médias sociaux.</li>
		<li>Créez un compte de messagerie pour une communication directe entre l’équipe du laboratoire et chaque citoyen scientifique, géré par une personne parlant couramment les principales langues de la région d’intérêt (par exemple, l’espagnol et l’anglais pour le comté de San Diego).</li>
		<li>Construire une plateforme web sécurisée de gestion des échantillons (SMP) qui servira de base de données, de système de gestion de l’information de laboratoire (LIMS) et de communication avec les citoyens scientifiques. Remarque : le SMP fournit un emplacement centralisé où les utilisateurs demandent un kit, accèdent aux protocoles de collecte d’échantillons, soumettent des métadonnées d’échantillon et demandent un ramassage pour les kits d’échantillons terminés.</li>
		<li>Créer un lien vers le PSM (p. ex. https://demo.covidsample.org/)(figure 1) pour que les personnes présentent une demande de participation à l’effort d’échantillonnage environnemental en répondant aux questions liées à la biosécurité précisées dans un formulaire en ligne.</li>
		<li>Accès sécurisé au SMP à l’aide d’une interface de programmation d’applications d’authentification facilitée par un fournisseur de services informatiques en nuage. Donnez aux utilisateurs approuvés l’accès au SMP. Remarque : reportez-vous à la documentation pour une description du protocole OAuth 2.031 pour l’authentification et l’autorisation. Il fournit un processus de connexion sans friction pour les citoyens scientifiques bénévoles. Il permet également aux utilisateurs de se connecter avec un compte existant, éliminant ainsi la nécessité de créer une solution de connexion personnalisée et de gérer les informations d’identification de l’utilisateur, ce qui permet de gagner beaucoup de temps et d’encourager la participation. Selon des rapports récents, le service de messagerie gratuit disponible pour le fournisseur de services informatiques cloud choisi compte environ 1,5 milliard d’utilisateurs de messagerie actifs mensuellement; exiger un compte de courriel de ce fournisseur de services pour participer n’est pas considéré comme un facteur décourageant.</li>
		<li>Expliquer l’objectif de l’étude et les considérations en matière de biosécurité aux citoyens scientifiques du SMP avant qu’ils ne demandent leur première trousse. Fournissez un plug-in multilingue pour permettre la navigation dans l’une des langues disponibles à partir d’un service de traduction automatique neuronal multilingue facilité par un fournisseur de services informatiques cloud.</li>
		<li>Inclure dans la section d’échantillonnage des protocoles graphiques et audiovisuels en anglais et en espagnol.</li>
		<li>Attribuez un identificateur unique à chaque kit et concevez l’interface utilisateur pour utiliser des boutons liés à Sample ID afin de rationaliser le processus de saisie des données(Figure 1A).</li>
		<li>Utilisez un logiciel de planification des itinéraires de livraison avec une application pour appareil mobile à utiliser par les chauffeurs afin d’optimiser les itinéraires de livraison et de ramassage et d’informer les citoyens scientifiques des heures d’arrivée estimées avec précision.</li>
		<li>Créez la plate-forme LIMS sur une pile de services Web PHP et hébergez-la sur une plate-forme d’hébergement commerciale (le système d’exploitation suggéré, le logiciel de serveur Web et le logiciel de base de données sont spécifiés dans la table des matériaux).</li>
		<li>Fournir une interface d’application Web sécurisée pour permettre au personnel de laboratoire de gérer les données rapidement et facilement dans le LIMS. Fournir la visualisation des données à l’aide d’une interface de programmation d’applications de cartographie de données facilitée par un fournisseur de services informatiques cloud.</li>
		<li>Visualisez les données géospatiales à l’aide d’une interface de programmation d’applications géospatiales facilitée par un fournisseur de services informatiques cloud. Stocker les données soumises au SGIL par l’intermédiaire du PSM afin de faciliter (1) le stockage centralisé des données du projet; (2) le suivi des flux de travail de traitement des échantillons et des données; et (3) la gestion de la logistique de la distribution des trousses d’échantillons aux citoyens scientifiques.</li>
		<li>Sécuriser les métadonnées soumises à l’aide des meilleures pratiques (p. ex., https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>Informations de préchargement telles que l’ID du kit d’échantillons, l’ID d’échantillon, la date, l’heure et les coordonnées gps (gps) (automatiquement collectées à partir d’une image du site) pour permettre la conformité du type de données et minimiser la soumission de données erronées ou manquantes par l’utilisateur(Figure 1B). Inclure les champs suivants à remplir manuellement et rapidement (<1 min) par le citoyen scientifique : la date et l’heure de la collecte, une brève description de l’emplacement et une photo du site d’échantillonnage.</li>
		<li>Nettoyez toutes les données téléchargées et validez le type de données. Par exemple, validez les données d’image téléchargées par les utilisateurs pour sélectionner des fichiers .jpg, renommez-les avec Sample ID pour une association rapide avec l’exemple et stockez les images téléchargées dans un emplacement sécurisé distinct non accessible aux utilisateurs.</li>
		<li>Activez l’option de demander la livraison et le ramassage du kit lorsque tous les échantillons (16) ont été complétés. De plus, activez l’option permettant de demander la livraison d’un nouveau kit lors du ramassage du précédent(Figure 1A). REMARQUE : Pour les bénévoles qui préfèrent une plateforme non web et pour ceux qui s’inquiètent de divulguer leur position GPS (p. ex., les membres de la communauté préoccupés par leur statut migratoire), les trousses peuvent être livrées à un lieu de réunion convenu et les bénévoles peuvent être invités à enregistrer une version écrite de la collecte de données. Pour la communication entre le laboratoire et chaque citoyen scientifique, avoir un membre bilingue du projet disponible pour les appels téléphoniques et les textos.</li>
	</ol></li>
	<li>Écouvillon pour Corona<ol>
<li>Déterminer une fenêtre de temps pertinente sur le plan épidémiologique pour l’effort d’échantillonnage.</li>
		<li>Construire une trousse qui contient toutes les fournitures d’échantillonnage, y compris l’équipement de protection individuelle nécessaire (c.-à-d. masque, gants), un protocole d’échantillonnage et des renseignements pertinents sur la biosécurité (figure 2). Pré-étiquetez chaque tube avec l’identificateur unique assigné (id d’échantillon).</li>
		<li>Écouvillonner rarement les surfaces désinfectées qui sont exposées à des vecteurs fomites aérosolisés dans les ménages et l’environnement urbain.<ol>
<li>Portez le masque fourni en public et une nouvelle paire de gants pour le prélèvement de chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée. Après avoir terminé l’échantillonnage, utilisez le désinfectant pour les mains fourni.</li>
			<li>Mouiller un écouvillon absorbant le polyester de 1 cm2 (p. ex. tampons de vadrouille) avec un détergent (p. ex. sulfate de dodécyle de sodium (FDS) à 0,5 %) pour inactiver le virus en perturbant son enveloppe et stabiliser l’ARN nu en induisant le dépliage des RNases32.</li>
			<li>Écouvillonner une surface de 10 cm2. Aidé par un cure-dent, submergez complètement chaque écouvillon d’échantillon dans le tube pré-marqué correspondant contenant 200 μL de solution de thiocyanate de guanidinium (GITC). Entreposer les tubes à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient transportés au laboratoire. Une fois les échantillons arrivés au laboratoire, conservez-les à -80 °C. REMARQUE: GITC est un irritant toxique; éviter tout contact avec la peau. La solution GITC est simple à préparer à partir de produits chimiques de laboratoire courants, pour la recette voir33,34. Il inactive le virus, stabilise l’ARN en dénaturant RNases34,35,36et stabilise les échantillons à température ambiante. La trousse, cependant, comprend des blocs réfrigérants pour garder les échantillons au froid sans avoir besoin d’utiliser des réfrigérateurs ménagers pour l’entreposage.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Détection du SARS-CoV-2
<ol><li>Isolement total de l’ARN<ol>
<li>Désinfecter les surfaces, l’équipement et les pipettors avec une solution de sulfate de cuivre à 2 mM et de peroxyde d’hydrogène à 3 %; suivi d’une solution de 10% d’eau de Javel, 90 mM de bicarbonate de sodium, 5% SDS, et 2,5% NaOH. Essuyez soigneusement avec de l’eau distillée suivie d’éthanol à 75%. REMARQUE: Ces solutions sont une alternative aux solutions disponibles dans le commerce.</li>
		<li>Décongeler les échantillons sur la glace. Échantillons de vortex pendant 2 min à vitesse moyenne.</li>
		<li>Pour accélérer le dépistage, traitez les échantillons dans des piscines. Si un pool est positif, extraire l’ARN de chaque échantillon indépendamment pour trouver le ou les échantillons positifs. Combinez les échantillons de chaque trousse d’échantillonnage (16 au total) en 2 bassins de 8 échantillons. REMARQUE: Avoir 8 échantillons par pool signifie que seulement 2 pools doivent être traités par kit. Si un pool est positif, les échantillons individuels sont traités à nouveau pour l’analyse RT-LAMP individuelle. Cela réduit le temps, les coûts et les réactifs.</li>
		<li>Regrouper 50 μL de chacun des 8 échantillons dans un tube à microcentrifugation (volume total de 400 μL); conserver l’échantillon restant à -80 °C. Ajouter 0,2 volume (80 μL) de chloroforme, de vortex pendant 15 s, puis incuber pendant 20 min à 4 °C. Centrifuger à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C.</li>
		<li>Transférer la couche aqueuse (liquide clair) dans un nouveau tube à microcentrifugation. Conserver l’interface restante et le liquide rose dans le congélateur à -80 °C; ces fractions contiennent de l’ADN et des protéines33,36.</li>
		<li>Ajouter un volume égal d’isopropanol (~200 μL) et 2,6 μL de glycogène coprecipitant (15 mg mL-1)37. Bien mélanger et incuber à -20 °C pendant au moins 1 h, puis 4 °C pendant 10 min pour précipiter l’ARN. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici en incubant des échantillons à -20 °C pendant la nuit au lieu de 1 h.</li>
		<li>Centrifuger à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Retirez le surnageant sans déranger la pastille. Ressusciter la pastille dans 50 μL d’eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC) et ajouter un volume égal (50 μL) d’acétate d’ammonium 5 M sans RNase et 2,5 volumes (250 μl) d’éthanol à 100 %7,38. REMARQUE : Les ions ammonium inhibent la polynucléotide kinase s’ils sont utilisés dans un processus en aval38. Le mélange précipite l’ARN tout en laissant des triphosphates désoxynucléosides et des oligosaccharides en solution38.</li>
		<li>Bien mélanger et incuber à -20 °C pendant au moins 1 h, puis 4 °C pendant 10 min pour précipiter l’ARN. REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici en incubant des échantillons à -20 °C pendant la nuit au lieu de 1 h.</li>
		<li>Centrifuger à 13 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Laver le culot avec 1 mL d’éthanol froid (-20 °C), fraîchement fait à 75 %. Centrifuger à 8 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant avec une pipette P10 pour éviter de perturber la pastille.</li>
		<li>Sécher à l’air le culot pendant 10-15 min jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’éthanol. Ressusciter la pastille dans 50 μL d’eau traitée au DEPC, ajouter 5 μL de tampon DNase 10x + 1μL de DNase (2 unités μL-1)et incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
		<li>Ajouter 0,1 volume (5,6 μL) de réactif d’inactivation de la DNase, incuber à température ambiante pendant 5 min et mélanger doucement toutes les minutes. Centrifuger à 13 000 × g pendant 2 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube (~50 μL). Placez immédiatement le tube sur de la glace pendant la préparation des réactions RT-qPCR ou RT-LAMP, ou conservez-le dans un congélateur à -20 °C. REMARQUE: Effectuez l’isolement de l’ARN dans une pièce sans amplicon pour éviter la contamination par le report.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplification isotherme multiplex à médiation par boucle de transcription inverse (RT-LAMP)<ol>
<li>Préparer une solution de mélange d’apprêts 20X (tableau 1) pour chaque ensemble d’apprêts (tableau 2). Préparer le mélange réactionnel RT-LAMP (tableau 3) à température ambiante avec un volume excédentaire de 10 % pour tenir compte de la perte de pipetage. NOTE: Le mélange maître colorimétrique LAMP 2X avec l’uracile thermolabile antarctique-ADN glycosylase (UDG) empêche l’amplification de la contamination de l’ADN des réactions précédentes20,28.</li>
		<li>Vortex et faire tourner le mélange. Distribuer 20 μL du mélange dans chaque tube réactionnel : échantillon, enrichi, témoin positifet témoin négatif. Incuber les réactions dans les tubes à température ambiante pendant 10 min pour permettre à l’UDG d’agir sur la contamination potentielle de report.</li>
		<li>Ajouter 5 μL d’ARN à la réaction de l’échantillon, 5 μL d’ARN + 2,5 μL (450 copies) d’ARN synthétique du SARS-CoV-2 à la réaction enrichie, 2,5 μL (450 copies) d’ARN synthétique du SARS-CoV-2 à la réaction témoin positive et 5 μL deH2O à la réaction témoin négative. Bien mélanger et faire tourner les réactions; décongeler tout l’ARN sur la glace.</li>
		<li>Pendant que le thermocycleur, ou le bain-marie, est chauffé à 65 °C, laissez toutes les réactions rester à température ambiante. L’UDG sera inactivé à >50 °C. Placez les réactions dans le thermocycleur (utilisez un couvercle de chaleur), incuber à 65 °C pendant 40 min et laissez les réactions atteindre la température ambiante (~ 22 °C pendant 5 min) ou refroidir sur de la glace pendant 1 min. Analysez les résultats à l’aide de la fonction colorimétrique (observation simple) ou en exécutant les produits dans un gel d’agarose. REMARQUE : Bien que la limite de détection (LD) soit de 10 copies par réaction, la fréquence de détection augmente à mesure que le nombre de copies approche les 500 copies par réaction(figure 3A). Pour l’observation colorimétrique, notez qu’un résultat négatif est indiqué par le rose (pH = 8,8), tandis qu’un résultat positif est indiqué par le jaune (pH = 5)(Figure 3B). L’option colorimétrique évite l’ouverture des tubes RT-LAMP après amplification, ce qui réduira le volume des produits RT-LAMP dans l’environnement de travail et la contamination par report. Pour l’électrophorèse sur gel, préparez un gel d’agarose à 1,5% avec une coloration de gel d’ADN 1X dans un tampon Tris / Borate / EDTA (TBE) à 0,5%. Chargez 25 μL de la réaction + 5 μL de colorant de chargement 6X dans chaque puits. Faire fonctionner le gel à 100 V pendant 60 min. Un marqueur moléculaire n’est pas nécessaire car les échantillons positifs montrent un motif d’échelle(figure 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Tous les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts concurrents.

Engagement des citoyens scientifiques. Des citoyens scientifiques ont été recrutés pour écouvillonner les surfaces dans tout le comté de San Diego afin d’échantillonner et de détecter la présence du SARS-CoV-2 dans l’environnement urbain. La majorité des trousses d’échantillonnage livrées (70 %) ont été retournés au laboratoire, et de ce nombre, presque tous les échantillons étaient complets (91 %) (Figure 3A,B et Tableau 4). Les bénévoles pouvaient facilement demander la livraison ou le ramassage des trousses par l’entremise de la plateforme Web, et le logiciel de planification des itinéraires de livraison demandait aux citoyens scientifiques d’estimer les heures d’arrivée, deux facteurs probablement importants pour le succès observé. Le délai moyen entre la livraison de la trousse au citoyen scientifique et le moment où elle a été retournée au laboratoire était de 8 jours, avec une médiane de 3 jours et une fourchette de 1 à 64 jours (figure 3A et tableau 4). Des rappels plus fréquents aux bénévoles réduiraient probablement ce délai.
La plateforme de collecte de données a été utilisée avec succès par une grande majorité d’utilisateurs (73 %) (Tableau 4). Bien que les efforts des citoyens scientifiques n’aient pas été mesurés, des tests sur le terrain ont montré que la plate-forme de collecte de données réduisait considérablement les efforts et le temps nécessaires pour mener à bien le prélèvement d’échantillons. Ainsi, la réduction de la quantité de comptabilité a encouragé l’engagement des citoyens scientifiques. La plate-forme Web visait à surmonter les limitations démographiques en fournissant un service de traduction automatique neuronal multilingue et en fournissant des protocoles graphiques et audiovisuels en anglais et en espagnol. Cela n’a été que partiellement réussi, car moins d’échantillons ont été prélevés à la fois dans la baie Sud et dans le comté de North, où réside la majeure partie de la population hispanique / latino ducomté, soit 45personnes. Ces zones abritaient également 63% (1 700 cas pour 100 000) du nombre total de cas de COVID-19 dans le comté de San Diego avec la prévalence la plus élevée de la maladie46 et le taux d’hospitalisations (62%)47,48. Bien que la plupart des échantillons proviennent du comté de Central, un nombre représentatif a été recueilli dans les districts les plus touchés par la COVID-19 et seule une petite fraction des échantillons était positive, ce qui suggère que les réservoirs de surface du SARS-CoV-2 dans l’environnement urbain sont relativement rares.
Traitement des échantillons. Les écouvillons d’échantillonnage ont été mouillés avec des FDS, qui ont désactivé le virus en perturbant son enveloppe et stabilisé l’ARN nu en dépliant RNases32. Idéalement, pendant le prélèvement, le détergent dans l’écouvillon a nettoyé la surface échantillonnée. Les échantillons environnementaux contiennent souvent de très petites quantités d’ARN. Pour maximiser la récupération, l’isolement de l’ARN a été effectué à l’aide d’une méthode d’extraction brute, sans colonne, basée sur GITC. Gitc, un agent chaotrope fort, perturbe les liaisons hydrogène qui maintiennent le repliement des protéines (c.-à-d. effet hydrophobe). Cette action se traduit par l’inactivation des particules virales, et l’ARN reste stable en raison de l’inhibition des RNAses34,35,36. La solution GITC a maintenu la stabilité des échantillons d’ARN sans tenir strictement compte de la chaîne du froid, ce qui a permis aux citoyens de maintenir les échantillons à température ambiante si un congélateur pour les blocs réfrigérants fournis n’était pas disponible. Afin de réduire le danger potentiel que pose ce réactif en cas de contact direct avec la peau ou les muqueuses, les citoyens ont été sensibilisés à ces risques par l’inclusion d’une fiche signalétique fournie dans la trousse et un sceau d’avertissement a été placé dans la boîte contenant les tubes.
La méthode brute d’extraction de GITC-chloroforme a aidé la récupération des traces d’ARN des écouvillons, et comme le montre l’amplification des échantillons enrichis, les inhibiteurs ont rarement persisté dans les échantillons après extraction. Les échantillons, qui étaient négatifs pour le SARS-CoV-2 et ne présentaient aucune inhibition de RT-LAMP, représentaient de vrais négatifs ou avaient un nombre de copies inférieur à celui de la LD à une fréquence de 100 %. Inversement, la détection de l’ARN viral sur une surface n’implique pas directement un risque de transmission par contact, car l’infectiosité du virus à partir d’échantillons positifs doit être testée. Un dépistage rapide de l’environnement, qui n’est pas limité par la disponibilité de fournitures sophistiquées ou de personnel hautement qualifié, est essentiel pour évaluer si les surfaces constituent un réservoir viral et pour mieux orienter les efforts de prévention et de confinement.
RT-LAMP a été choisi pour être la meilleure méthode adaptée au pipeline de détection proposé. Il s’est avéré être une méthode rapide et peu coûteuse qui était fortement résistante à la plupart des inhibiteurs restants et aussi sensible et spécifique que d’autres méthodes RT-qPCR. En raison de leur utilisation en milieu clinique pendant la pandémie de SARS-CoV-2, la disponibilité des kits RT-qPCR a été affectée par la demande mondiale. De plus, les techniques rt-qPCR , même celles formulées pour résister aux inhibiteurs, étaient sensibles aux substances contenues dans les échantillons environnementaux recueillis par une cohorte pilote de citoyens scientifiques, même après l’utilisation d’autres stratégies communes pour réduire la concurrence des inhibiteurs pour la liaison enzymatique49. Ces résultats sont corroborés par une étude récente qui a comparé les deux méthodes pour détecter le SARS-CoV-2 sur des échantillons d’écouvillons de bonbons manipulés par des patients COVID-19 et a trouvé une concordance de résultats de plus de 83%, avec une inhibition inférieure de 25% dans les échantillons analysés par RT-LAMP15. En outre, l’extraction du brut GITC-chloroforme, couplée à RT-LAMP, a réduit le coût des réactifs et des fournitures de 42% par rapport à l’extraction du kit d’ARN et au RT-qPCR (Table des matériaux).
Cette méthode a permis d’analyser à haut débit des milliers d’échantillons d’écouvillonnage de surface. Jusqu’à 80 piscines, représentant 640 échantillons, ont été traitées en 2 jours, de l’extraction de l’ARN à la détection du SARS-CoV-2 par RT-LAMP. Le protocole proposé est semi-quantitative, limité à la détection de l’ARN viral, et n’indique pas la présence de particules virales infectieuses. Une analyse plus approfondie est nécessaire pour évaluer le risque de transmission du SARS-CoV-2 par les vecteurs ennemis infectés présents aux surfaces écouvillonnés.
Cette étude présente un protocole pour mettre en place rapidement une stratégie de test qui comprend un flux de travail efficace face à une urgence sanitaire avec une maladie transmissible. Le protocole d’échantillonnage proposé est simple et utilise des fournitures que l’on trouve couramment dans les ménages, et la méthode de détection virale est effectuée sur de l’équipement disponible dans des laboratoires de base tels qu’un bain d’eau au lieu d’un thermocycleur. Les coûts des réactifs RT-LAMP sont nettement inférieurs à ceux nécessaires pour le RT-qPCR et moins sensibles aux scénarios de demande mondiale élevée. Cette étude sert de cadre à l’évaluation des réservoirs viraux environnementaux lors de futures épidémies et pandémies mondiales.

On pense que le SARS-CoV-2 se transmet principalement par inhalation d’aérosols et de gouttelettes contaminés par contact direct avec des personnes infectées1,2,3,4. Cependant, au cours des phases initiales de la pandémie mondiale de COVID-19, les efforts visant à contrôler la transmission du SARS-CoV-2 se sont fortement concentrés sur la désinfection des surfaces, le lavage des mains et la désinfection. À la fin de 2020, les directives de transmission de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS)5 et des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis6 ont jugé que la transmission par voie aérienne présentait un danger, principalement lorsqu’elle était en contact étroit (<2 m) avec une personne infectée ou en présence d’interventions médicales génératrices d’aérosols. L’auto-inoculation après un contact avec des surfaces contaminées ou l’inhalation de vecteurs fomites aérosolisés n’a pas encore été exclue comme voie de transmission du SARS-CoV-2.
Des cas de COVID-19 ont été signalés où la transmission par voie aérienne semble peu probable7,8. Les virions du SARS-CoV-2 restent infectieux sur le cuivre jusqu’à 8 h, sur le carton et l’acier inoxydable jusqu’à 24 h, et sur le plastique jusqu’à 48 h9. Dans les cabines des navires de croisière, l’ARN du SARS-CoV-2 a été détecté 17 jours après le départ des passagers7. Des échantillons d’air et de surface provenant d’hôpitaux et de systèmes de transport en commun ont été testés positifs pour le SARS-CoV-2 et d’autres coronavirus8,10 , 11,12,13,14. Une étude réalisée sur l’emballage extérieur des bonbons d’Halloween manipulés par des patients COVID-19 asymptomatiques et modérés / légèrement symptomatiques a conclu que la combinaison du lavage des mains par le manipulateur et du lavage des bonbons avec du savon pour les mains réduisait l’ARN du SARS-CoV-2 à des niveaux inférieurs au seuil15.
Plusieurs méthodes de diagnostic du SARS-CoV-2 ont été publiées sur la base de la réaction en chaîne de la polymérase à transcription inverse en temps réel (RT-qPCR)16,17,de l’amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP)11,18,19,20,21et des technologies CRISPR-Cas18,19,22,23. La plupart nécessitent des kits d’extraction d’ARN qui sont souvent en pénurie pendant les périodes de demande mondiale importante, et très peu ont été utilisés pour le dépistage environnemental du virus24. Il a été démontré que la détection de l’ARN du SARS-CoV-2 à l’aide de RT-LAMP est concordante à plus de 83 % avec l’utilisation de RT-qPCR. En outre, RT-LAMP a entraîné une réduction de 25% des résultats non concluants par rapport à RT-qPCR15.
RT-LAMP est une technique simple qui utilise une transcriptase inverse pour synthétiser l’ADNc à partir d’un modèle d’ARN25,suivie d’une ADN polymérase avec une forte activité de déplacement de brin qui synthétise l’ADN à température constante (c’est-à-dire l’amplification isotherme)26. Une plus grande spécificité de la détection du génome viral est obtenue en utilisant quatre ou six amorces qui reconnaissent six ou huit régions de l’ADN cible. L’amplification est initiée à partir d’un apprêt interne et donne une structure d’ADN semi-double brin. Le brin avant est ensuite amplifié par un apprêt extérieur. Ces amplifications sont répétées pour les amorces inverses. Les amorces internes et externes à chaque extrémité ont un site auto-complémentaire inverse interne qui forme une boucle dans le produit d’amplification26,27. Dans le déplacement de brins isothermes, la synthèse asynchrone de l’ADN génère de grandes quantités de produit amplifié où la polymérisation continue amplifie le signal d’aussi peu que 10 copies par réaction11,20,28. Le mélange colorimétrique RT-LAMP est faiblement tamponné et utilise du rouge de phénol comme indicateur de pH. Comme la polymérase incorpore un nucléotide, elle libère un proton, et suffisamment de protons vont changer le pH de la solution ainsi que sa couleur du rose au jaune11,20,28,29.
RT-LAMP a été développé pour la détection des maladies transmises par les moustiques dans les établissements de santé périphériques qui ne disposent pas de laboratoires entièrement équipés25 et pour la détection rapide d’autres virus à ARN comme le virus de l’immunodéficience humaine30. Les populations les plus vulnérables en cas d’épidémie – selon la définition de l’OMS – manquent souvent de ressources économiques suffisantes et de l’équipement approprié pour effectuer la détection (Programme de santé publique mondiale des Nations Unies). Dans la pandémie actuelle de SARS-CoV-2, les fournitures telles que les écouvillons de qualité médicale et les réactifs pour les kits d’extraction d’ARN n’ont pas été en mesure de répondre à la demande mondiale, en particulier dans les pays non manufacturiers. Le protocole proposé utilisait une extraction d’ARN brut à base de thiocyanate de guanidinium (GITC), qui a effectivement préservé l’ARN d’une manière indépendante de la chaîne du froid et a réduit de manière significative la persistance des inhibiteurs de l’échantillon. De plus, le protocole d’extraction gitc-chloroforme est basé sur la séparation de l’ARN de l’ADN et des protéines suivie de la précipitation respective, permettant la récupération de la majeure partie du matériel génétique. Ces avantages l’emportent sur les dangers potentiels des citoyens scientifiques manipulant le produit chimique si des mesures sont prises pour les informer de manière appropriée des risques.
Le flux de travail proposé utilise des matériaux et des réactifs d’utilisation générale. Il nécessite un équipement disponible dans des laboratoires de base, souvent ruraux. Ces méthodes sont peu coûteuses, très résistantes aux inhibiteurs souvent trouvés dans les échantillons environnementaux ou les échantillons qui ne peuvent pas être traités avec des kits d’extraction, et éliminent le besoin d’un thermocycleur de haute précision. Cette étude présente un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 à partir de réservoirs environnementaux sur des surfaces communément touchées et rarement désinfectées des ménages et de l’environnement urbain.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

Pour contrôler la transmission communautaire du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) pendant la pandémie mondiale de 2020, la plupart des pays ont mis en œuvre des stratégies basées sur des tests humains directs, le couvre-visage et la désinfection des surfaces. En supposant que la principale voie de transmission comprend les aérosols et les gouttelettes respiratoires, les efforts pour détecter le SARS-CoV-2 chez les vecteurs ennemis se sont concentrés sur les endroits soupçonnés d’une prévalence élevée (p. ex. les services hospitaliers, les navires de croisière et les systèmes de transport en commun). Pour enquêter sur la présence du SARS-CoV-2 sur des surfaces de l’environnement urbain qui sont rarement nettoyées et rarement désinfectées, 350 citoyens ont été enrôlés du grand comté de San Diego. Au total, ces citoyens scientifiques ont recueilli 4 080 échantillons. Une plateforme en ligne a été mise au point pour surveiller la livraison et le ramassage des trousses d’échantillonnage, ainsi que pour recueillir des données d’échantillons. Les trousses d’échantillonnage ont été principalement construites à partir de fournitures disponibles dans les magasins stressés par la pandémie. Les échantillons ont été traités à l’aide de réactifs faciles d’accès malgré la pénurie récurrente d’approvisionnement. Les méthodes utilisées étaient très sensibles et résistantes aux inhibiteurs couramment présents dans les échantillons environnementaux. La conception expérimentale et les méthodes de traitement proposées ont réussi à mobiliser de nombreux citoyens scientifiques qui ont recueilli efficacement des échantillons dans diverses zones de surface. Le flux de travail et les méthodes décrits ici sont pertinents pour étudier l’environnement urbain à la recherche d’autres virus, qui sont préoccupants pour la santé publique et constituent une menace pour de futures pandémies.

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Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Un projet de science citoyenne a été conçu pour recruter des résidents de San Diego afin de recueillir des échantillons environnementaux pour le SARS-CoV-2. Une plate-forme Web multilingue a été créée pour la soumission de données à l’aide d’une interface conviviale pour les appareils mobiles. Un système de gestion de l’information de laboratoire a facilité la collecte de milliers d’échantillons géographiquement diversifiés grâce au suivi des résultats en temps réel.

Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Cette étude présente un nouveau flux de travail pour détecter le SARS-CoV-2 sur des surfaces qui sont rarement nettoyées en milieu urbain, telles que les poignées de pompe à essence, les terrains de jeux et les distributeurs automatiques de billets. En cas de pandémie, les approvisionnements sont rares. Nous utilisons des matériaux, des réactifs et des équipements facilement accessibles disponibles dans des laboratoires de base.Nous utilisons une méthode d’extraction qui préserve l’ARN sans chaîne du froid, et une méthode de détection résistante aux inhibiteurs. Ce protocole présente un intérêt pour la santé publique. Il fournit un cadre pour l’évaluation des réservoirs viraux environnementaux pour la pandémie actuelle de COVID-19 et d’autres agents infectieux lors de futures épidémies mondiales.Recruter des citoyens scientifiques à l’aide d’un appel à l’action direct et clair publié via les médias locaux et sociaux. Créez un handle de médias sociaux pour connecter le sujet à travers le contenu des médias sociaux. Créer un lien vers le PSM, en fournissant un plug-in multilingue pour permettre la navigation dans plusieurs langues pour que les personnes demandent à participer à l’effort d’échantillonnage environnemental en répondant aux questions liées à la biosécurité spécifiées dans un formulaire en ligne.Inclure dans la section d’échantillonnage des protocoles graphiques et audiovisuels en anglais et en espagnol. Visualisez les données géospatiales à l’aide d’une interface de programmation d’applications géospatiales facilitée par un fournisseur de services informatiques cloud. Stocker les données soumises au SGIL par l’intermédiaire du SMP pour faciliter le stockage centralisé, le suivi des flux de travail de traitement et la gestion de la logistique.Informations de préchargement telles que l’ID du kit d’échantillons, l’ID d’échantillon, la date, l’heure et les coordonnées du système de positionnement global pour permettre la conformité des types de données et minimiser l’erreur. Incluez un lien de demande de ramassage d’échantillons pour les participants, qu’ils peuvent utiliser une fois qu’ils ont recueilli tous les échantillons. Construire une trousse qui contient toutes les fournitures d’échantillonnage, y compris l’équipement de protection individuelle nécessaire, comme un masque et des gants, un protocole d’échantillonnage et des renseignements pertinents en matière de biosécurité.L’écouvillonnage désinfecte rarement les surfaces des ménages et de l’environnement urbain en mouillant un écouvillon absorbant le polyester carré d’un centimètre avec un détergent et en écouvillonnant une surface de 10 centimètres au carré. Aidé par un cure-dent, submergez chaque écouvillon d’échantillon dans le tube pré-marqué contenant 200 microlitres de thiocyanate de guanidinium. Portez le masque fourni et une nouvelle paire de gants pour le prélèvement de chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée.Après avoir terminé l’échantillonnage, utilisez le désinfectant pour les mains fourni. Conservez les tubes à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient transportés au laboratoire. Une fois que les échantillons arrivent en laboratoire, conservez-les à moins 80 degrés Celsius.Pour accélérer le dépistage, traitez les échantillons dans des piscines. Si un pool est positif, extraire l’ARN de chaque échantillon indépendamment. Combinez les échantillons de chaque trousse d’échantillonnage en deux bassins en regroupant 50 microlitres de chacun des huit échantillons dans un tube de microcentrifugation et en économisant les échantillons restants à moins 80 degrés Celsius.Ajouter 80 microlitres de chloroforme et de vortex pendant 15 secondes. Incuber ensuite pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger à 13 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Transférer la couche aqueuse dans un nouveau tube à microcentrifugation. Conservez le reste de l’interface et le liquide rose dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ces fractions contiennent de l’ADN et des protéines.Extraire l’ARN de la couche aqueuse récupérée à l’aide d’un protocole d’extraction brute d’ARN à base de thiocyanate de guanidinium. Préparer le mélange réactionnel RT-LAMP à température ambiante avec un volume excédentaire de 10% pour tenir compte de la perte de pipetage. Ajouter cinq microlitres d’ARN à la réaction de l’échantillon et cinq microlitres d’ARN plus 2,5 microlitres d’ARN synthétique SARS-CoV-2 à la réaction enrichie.Ajouter 2,5 microlitres d’ARN synthétique sars-CoV-2 au témoin positif et cinq microlitres d’eau au témoin négatif. Mélangez bien et faites tourner les réactions vers le bas. Pour l’observation colorimétrique, un résultat négatif est indiqué par le rose et un résultat positif est indiqué par le jaune.Après RT-LAMP, effectuez une électrophorèse sur gel. La répartition des sites de prélèvement d’échantillons est présentée ici. La majorité des trousses étaient complètes, et les données correspondantes ont été téléchargées dans le SGIL.La limite de détection à une fréquence de 100% était de 500 copies par 25 microlitres de réaction. Dans le RT-LAMP colorimétrique, les échantillons positifs ont changé de couleur du rose au jaune en raison d’un décalage du pH de huit à 5,5. À faible nombre de copies, des échantillons ont été exécutés sur un gel d’agarose pour confirmer les points positifs avec le modèle en forme d’échelle résultant.Les méthodes RT QPCR ont été testées avec des échantillons environnementaux. Tous les mélanges maîtres étaient sensibles aux inhibiteurs à de faibles concentrations de nombre de copies du témoin positif. À de faibles concentrations du modèle, les méthodes traditionnelles de RT PCR ont montré des faux positifs et des faux négatifs.Enfin, une technique appelée amplification en cercle roulant a détecté de petites quantités de la séquence cible. Cependant, il a montré l’amplification de la sonde en l’absence d’un modèle d’ARN. Il est essentiel de publier un appel à l’action qui atteint tous les secteurs de la communauté afin que l’échantillonnage représente vraiment le risque d’exposition de tous les membres de cette communauté.Ce cadre détecte le matériel génétique du SARS-CoV-2. Les études visant à tester la viabilité virale sont la prochaine étape.

Research

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Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Une technique non invasive cheveux d&#39;échantillonnage pour obtenir l&#39;ADN de haute qualité provenant Elusive petits mammifères

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

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