Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

אנו מודים לחוקרי מכון המידע הוויראלי (VII), ד"ר אנקה מ. סגל, ווילו סגל, פטרישיה ל. רוהוור, גארי רוהוור, קארי ל. רוהוור, מגדה סילביה פינטה, אליזבת קרוז קאנו, ד"ר גרגורי פיטרס, ד"ר סטיוארט סנדין וד"ר ג'ניפר סמית' על שהקדשו את הזמן לאיסוף דגימות רבות. אנו מודים גם לד"ר רוב נייט, ד"ר ג'ק גילברט, ד"ר פדרו באלדה-פרה וד"ר שרה אלארד מהמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת סן דייגו קליפורניה (UCSD) על הקלת בקרות חיוביות ומשוב שימושי. אנו מודים לסטייסי קארוטה (SDSU College of Sciences) וג'ינה ספידדל (SDSU) על התמיכה הלוגיסטית ולחואן רודריגז על האמנות והעיצוב הגרפי של פרוטוקול הדגימה. אנו מודים לכל המשתתפים על מחויבותם ומסירותם לפרויקט בתקופות קשות מאוד. עבודה זו נתמכה על ידי תרומה נדיבה של ד"ר ג'ו אן ליין (SDSU המכללה למדעים) ואת הקרן הלאומית למדעים RAPID: מאגרים סביבתיים של מענק SARS-CoV-2 (מספר הפרס: 2030479).

עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מפורטת של ריאגנטים וחומרים מתכלים, כולל מספרי קטלוג, יצרן ועלויות תואמות.
1. דגימת הסביבה העירונית
<ol><li>סיוע למדען אזרחי<ol><li>לגייס מדענים אזרחיים באמצעות קריאה ישירה וברורה לפעולה שפורסמו באמצעות מדיה מקומית וחברתית. צור מזהה ייחודי (למשל, #swab4corona)כדי לחבר את הנושא בין תוכן מדיה חברתית.</li>
		<li>צור חשבון דוא"ל לתקשורת ישירה בין צוות המעבדה לבין כל מדען אזרחי, המנוהל על ידי אדם דובר את השפות העיקריות של אזור העניין (למשל, ספרדית ואנגלית עבור מחוז סן דייגו).</li>
		<li>בנה פלטפורמת ניהול מדגם מבוססת אינטרנט מאובטחת (SMP) שתשמש כמסד נתונים, מערכת לניהול מידע במעבדה (LIMS) ותתקשר עם מדענים אזרחיים. הערה: ה- SMP מספק מיקום מרכזי שבו משתמשים מבקשים ערכה, ניגשים לפרוטוקולי איסוף לדוגמה, שולחים מטה-נתונים לדוגמה ומבקשים איסוף עבור ערכות לדוגמה שהושלמו.</li>
		<li>צור קישור ל- SMP (לדוגמה, https://demo.covidsample.org/) (איור 1) כדי שאנשים יגישו בקשה להשתתף במאמץ הדגימה הסביבתית על-ידי מענה לשאלות הקשורות ל-biosafety שצוינו בטופס מקוון.</li>
		<li>גישה מאובטחת ל- SMP באמצעות ממשק אימות תיכנות יישומים המתאפשר על-ידי ספק שירותי מחשב בענן. הענק למשתמשים שאושרו גישה ל- SMP. הערה: עיין בספרות לקבלת תיאור של פרוטוקול OAuth 2.031 לצורך אימות ואישור. הוא מספק תהליך כניסה ללא חיכוך למתנדבי מדען אזרחי. היא גם מאפשרת למשתמשים להיכנס באמצעות חשבון קיים, ומבטלת את הצורך ליצור פתרון כניסה מותאם אישית ולנהל אישורי משתמש, דבר החוסך זמן רב ומעודד השתתפות. על פי הדיווחים האחרונים, לשירות הדוא"ל החינמי הזמין עבור ספקית שירותי המחשבים בענן שנבחרה יש כ-1.5 מיליארד משתמשי דוא"ל פעילים מדי חודש; דרישת חשבון דואר אלקטרוני מספק שירות זה להשתתפות אינה נחשבת לגורם מרתיע.</li>
		<li>הסבר את מטרת המחקר ושיקולי ההסתעפות הביולוגית למדענים האזרחיים ב- SMP לפני שהם מבקשים את הערכה הראשונה שלהם. ספק תוסף רב לשוני כדי לאפשר ניווט בכל אחת מהשפות הזמינות משירות תרגום מכונה עצבי רב לשוני בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן.</li>
		<li>כלול במקטע הדגימה פרוטוקולים גרפיים ושמעיים באנגלית ובספרדית.</li>
		<li>הקצה מזהה ייחודי לכל ערכה ועצב את ממשק המשתמש כך שישתמש בלחצנים המקושרים למזהה לדוגמה כדי לייעל את תהליך הזנת הנתונים (איור 1A).</li>
		<li>השתמש בתוכנת תכנון נתיב מסירה עם יישום מכשיר נייד שישמש נהגים כדי לייעל את נתיבי המסירה / איסוף ולהודיע למדענים אזרחיים על זמני הגעה משוערים מדויקים.</li>
		<li>בנה את פלטפורמת LIMS על מחסנית של שירות אינטרנט PHP, וארח אותה בפלטפורמת אירוח מסחרית (מערכת הפעלה מוצעת, תוכנת שרת אינטרנט ותוכנות מסד נתונים מפורטות בטבלת החומרים).</li>
		<li>ספק ממשק יישומים מאובטח מבוסס אינטרנט כדי לאפשר לאנשי המעבדה לנהל נתונים במהירות ובקלות ב- LIMS. ספק תצוגה חזותית של נתונים באמצעות ממשק תיכנות יישומים של יצירת תרשימים של נתונים המתאפשר על-ידי ספק שירותי מחשב בענן.</li>
		<li>דמיין נתונים גאו-מרחביים באמצעות ממשק תכנות יישומים גאו-מרחבי בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן. אחסן את הנתונים שנשלחו ל- LIMS באמצעות ה- SMP כדי להקל (1) על אחסון מרכזי של נתוני פרוייקט; (2) מעקב אחר זרימות עבודה לדוגמה/עיבוד נתונים; ו-(3) ניהול הלוגיסטיקה של הפצת ערכות מדגם למדענים אזרחיים.</li>
		<li>מטה-נתונים שנשלחו מאובטחים באמצעות שיטות עבודה מומלצות (למשל, https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>טען מראש מידע כגון מזהה ערכת לדוגמה, מזהה לדוגמה, תאריך, שעה וקואורדינטות של מערכת מיקום גלובלית (GPS) (שנאסף באופן אוטומטי מתמונה של האתר) כדי לאפשר תאימות של סוגי נתונים ולמזער את השליחה של נתונים שגויים או חסרים על-ידי המשתמש (איור 1B). כלול את השדות הבאים שיש למלא באופן ידני ומהיר (<1 דקות) על ידי המדען האזרחי: תאריך ושבת איסוף, תיאור קצר של המיקום ותמונה של אתר הדגימה.</li>
		<li>תחטא את כל הנתונים שהועלו ואמת עבור סוג נתונים. לדוגמה, אמת נתוני תמונה שהועלו על-ידי משתמשים כדי לבחור קבצי .jpg, לשנות את שמם עם מזהה לדוגמה לצורך שיוך מהיר לדוגמה ולאחסן תמונות שהועלו במיקום מאובטח נפרד שאינו נגיש למשתמשים.</li>
		<li>הפעל את האפשרות לבקש מסירה ואיסוף של ערכות לאחר השלמת כל הדגימות (16). בנוסף, הפעל את האפשרות לבקש מסירת ערכה חדשה בעת איסוף הערכה הקודמת (איור 1A). הערה: עבור מתנדבים המעדיפים פלטפורמה שאינה מבוססת אינטרנט ועבור אלה המודאגים מחשיפת מיקום ה- GPS שלהם (למשל, חברי הקהילה המודאגים ממצבם הנודד), ניתן לספק ערכות במיקום מפגש מוסכם ומתנדבים התבקשו להקליט גרסה כתובה של איסוף הנתונים. לתקשורת בין המעבדה לבין כל מדען אזרח, יש חבר דו לשוני בפרויקט זמין לשיחות טלפון וטקסטים.</li>
	</ol></li>
	<li>ספוגית לקורונה<ol>
<li>זהה חלון זמן רלוונטי מבחינה אפידמיולוגית למאמץ הדגימה.</li>
		<li>בנה ערכה המכילה את כל ציוד הדגימה, כולל ציוד המגן האישי הדרוש (כלומר, מסכה, כפפות), פרוטוקול דגימה ומידע רלוונטי לאבטחה ביולוגית(איור 2). קדם-תווית לכל צינור עם המזהה הייחודי שהוקצה (מזהה לדוגמה).</li>
		<li>ספוגית לעתים רחוקות חיטוי משטחים החשופים fomites אירוסולים במשקי בית ובסביבה העירונית.<ol>
<li>לבשו את המסכה שסופקה בפומבי וזוג כפפות חדש לאיסוף כל דגימה כדי למנוע זיהום צולב. לאחר סיום הדגימה, השתמש בחיטוי הידיים שסופק.</li>
			<li>רטוב 1 ס"מ2 ספוג פוליאסטר סופג (למשל, רפידות מגב) עם חומר ניקוי (למשל, 0.5% נתרן דודקיל סולפט (SDS)) כדי לנטרל את הנגיף על ידי שיבוש המעטפה שלה כדי לייצב את RNA עירום על ידי גרימת נפרשות של RNases32.</li>
			<li>ספוגית משטח של 10 ס"מ2. בסיוע קיסם, להטביע לחלוטין כל דגימת דגימה בצינור שכותרתו מראש המתאים המכיל 200 μL של פתרון guanidinium thiocyanate (GITC). לאחסן צינורות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם מועברים למעבדה. ברגע שהדגימות מגיעות למעבדה, אחסנו אותן ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: GITC הוא מגרה רעיל; יש להימנע ממגע עם העור. פתרון GITC הוא פשוט להכין מכימיקלים במעבדה נפוצים, עבור המתכון לראות33,34. זה משבית את הנגיף, מייצב RNA על ידי denaturing RNases34,35,36, ומייצב דגימות בטמפרטורת החדר. הערכה, לעומת זאת, כוללת חבילות קרח כדי לשמור על הדגימות קרות ללא צורך להשתמש במקררים ביתיים לאחסון.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. זיהוי SARS-CoV-2
<ol><li>בידוד RNA כולל<ol>
<li>לחטא משטחים, ציוד, ו pipettors עם פתרון של 2 מ"מ נחושת גופרתי ו 3% מי חמצן; ואחריו פתרון של 10% אקונומיקה, 90 מ"מ נתרן ביקרבונט, 5% SDS, ו 2.5% NaOH. לנגב ביסודיות עם מים מזוקקים ואחריו 75% אתנול. הערה: פתרונות אלה הם חלופה לפתרונות המסחריים הזמינים.</li>
		<li>להפשיר דגימות על קרח. דגימות וורטקס למשך 2 דקות במהירות בינונית.</li>
		<li>כדי להגביר את מהירות ההקרנה, לעבד את הדגימות בבריכות. אם מאגר הוא חיובי, לחלץ את RNA של כל מדגם באופן עצמאי כדי למצוא את המדגם החיובי /s. שלב את הדגימות מכל ערכת דגימה (16 בסך הכל) לתוך 2 בריכות של 8 דגימות. הערה: לאחר 8 דגימות לכל בריכה אומר כי רק 2 בריכות צריך להיות מעובד לכל ערכה. אם מאגר הוא חיובי, דגימות בודדות מעובדים מחדש עבור ניתוח RT-LAMP בודדים. פעולה זו מפחיתה את הזמן, העלויות והריאגנטים.</li>
		<li>בריכה 50 μL של כל אחד 8 דגימות לתוך צינור microcentrifuge (נפח כולל 400 μL); שמור את הדגימה הנותרת ב- -80 °C (60 °F). הוסף 0.2 כרכים (80 μL) של כלורופורם, מערבולת במשך 15 s, ולאחר מכן דגירה במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>מעבירים את שכבת המים (נוזל שקוף) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. לאחסן את הממשק הנותר ונוזל ורוד במקפיא -80 מעלות צלזיוס; שברים אלה מכילים DNA וחלבונים33,36.</li>
		<li>הוסף נפח שווה של איזופרופנול (~ 200 μL) ו 2.6 μL של coprecipitant גליקוגן (15 מ"ג מ"ל-1)37. מערבבים היטב, ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לזרז RNA. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי דגירה דגימות ב -20 °C (60 °F) לילה במקום 1 שעה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה. Resuspend את גלולה ב 50 μL של diethylpyrocarbonate (DEPC)-מטופלים מים, ולהוסיף נפח שווה (50 μL) של RNase חינם 5 M אמוניום אצטט ו 2.5 כרכים (250 μl) של 100% אתנול7,38. שים לב: יוני אמוניום לעכב קינאז polynucleotide אם נעשה שימוש בתהליך במורד הזרם38. התערובת מזרזת RNA תוך השארת טריפוספטים ו אוליגוסכרידים בתמיסה38.</li>
		<li>מערבבים היטב, ודגרים ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 1 שעות, ואחריו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לזרז RNA. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן על ידי דגירה דגימות ב -20 °C (60 °F) לילה במקום 1 שעה.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את גלולה עם 1 מ"ל של קור (-20 מעלות צלזיוס), טרי עשה 75% אתנול. צנטריפוגה ב 8,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה P10 כדי למנוע הפרעה גלולה.</li>
		<li>אוויר לייבש את גלולה במשך 10-15 דקות עד שאין אתנול שנותר. Resuspend את גלולה ב 50 μL של מים שטופלו DEPC, להוסיף 5 μL של 10x מאגר DNase + 1μL של DNase (2 יחידות μL-1),ואת הדגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 30 דקות.</li>
		<li>הוסף 0.1 כרכים (5.6 μL) של מגיב השבתת DNase, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, ומערבבים בעדינות כל דקה. צנטריפוגה ב 13,000 × g במשך 2 דקות, ולהעביר supernatant לצינור חדש (~ 50 μL). מניחים את הצינור על הקרח מיד בעת הכנת תגובות RT-qPCR או RT-LAMP, או לאחסן במקפיא -20 מעלות צלזיוס. הערה: בצע בידוד RNA בחדר ללא אמפליפון כדי למנוע זיהום נשיאה.</li>
	</ol></li>
	<li>הגברה איסותרמית בתיווך לולאה הפוכה מולטיפלקס (RT-LAMP)<ol>
<li>הכן פתרון ערבוב פריימר 20X (טבלה 1) עבור כל קבוצה של פריימרים (טבלה 2). הכינו את תערובת התגובה RT-LAMP (טבלה 3) בטמפרטורת החדר עם נפח עודף של 10% כדי להסביר את אובדן הצינור. הערה: תערובת אמן מנורה צבעונית 2X עם אנטארקטיקה תרמולבילה uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) מונע הגברה של זיהום DNA מתגובותקודמות 20,28.</li>
		<li>וורטקס ולסובב את התערובת. לוותר על 20 μL של התערובת לתוך כל צינור תגובה: מדגם, זינק, שליטה חיובית, ושליטה שלילית. דגירה את התגובות בצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לאפשר UDG לפעול על זיהום לשאת מעל פוטנציאלי.</li>
		<li>הוסף 5 μL של RNA לתגובת המדגם, 5 μL של RNA + 2.5 μL (450 עותקים) של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובה הממוסמרת, 2.5 μL (450 עותקים) של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובת הבקרה החיובית, ו 5 μL של H2O לתגובת הבקרה השלילית. מערבבים היטב, ומסובבים את התגובות; להפשיר את כל RNA על קרח.</li>
		<li>בעוד התרמוציקלר, או אמבט המים, מחומם ל 65 מעלות צלזיוס, לאפשר לכל התגובות להישאר בטמפרטורת החדר. ה-UDG יופעל ב->50 מעלות צלזיוס. מניחים את התגובות תרמוציקלר (להשתמש במכסה חום), דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, ולתת את התגובות להגיע לטמפרטורת החדר (~ 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות), או להתקרר על קרח במשך 1 דקות. לנתח את התוצאות באמצעות התכונה colorimetric (תצפית פשוטה) או על ידי הפעלת המוצרים בג'ל agarose. הערה: למרות שמגבלת הזיהוי (LOD) היא 10 עותקים לתגובה, תדירות הזיהוי גדלה ככל שמספר העותק מתקרב ל-500 עותקים לתגובה (איור 3A). לתצפית צבעונית, שים לב שתוצאה שלילית מסומנת בוורוד (pH = 8.8), ואילו תוצאה חיובית מסומנת על-ידי צהוב (pH = 5) (איור 3B). האפשרות הצבעונית נמנעת מפתיחת צינורות RT-LAMP לאחר הגברה, אשר יפחיתו את נפח מוצרי RT-LAMP בסביבת העבודה וזיהום נשיאה. עבור אלקטרופורזה ג'ל, להכין 1.5% ג'ל agarose עם כתם ג'ל DNA 1X ב 0.5% טריס / Borate / EDTA (TBE) חוצץ. טען 25 μL של התגובה + 5 μL של צבע טעינה 6X בכל באר. הפעל את הג'ל ב 100 V במשך 60 דקות. אין צורך בסמן מולקולרי שכן דגימות חיוביות מראות תבנית סולם (איור 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

מעורבות מדען אזרחי. מדענים אזרחיים גויסו למשטחי ספוגית ברחבי מחוז סן דייגו כדי לדגום ולזהות את נוכחותם של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית. רוב ערכות הדגימה שנמסרו (70%) הוחזרו למעבדה, ומתואם כמעט כל הדגימות הושלמו (91%) (איור3א,B וטבלה 4). מתנדבים יכולים בקלות לבקש מסירה/איסוף של ערכות דרך הפלטפורמה מבוססת האינטרנט, ותוכנת תכנון מסלולי המסירה הודיעה למדענים אזרחיים על זמני ההגעה המשוערים, שניהם ככל הנראה גורמים משמעותיים להצלחה שנצפתה. הזמן הממוצע ממועד מסירת הערכה למדען האזרחי ועד להחזרתה למעבדה היה 8 ימים, עם חציון של 3 ימים וטווח של 1-64 ימים (איור 3A וטבלה 4). תזכורות תכופות יותר למתנדבים צפויות לקצר את זמן ההשהיה הזה.
פלטפורמת איסוף הנתונים שימשה בהצלחה את רוב המשתמשים (73%) (שולחן4). בעוד המאמצים של המדענים האזרחיים לא נמדדו, בדיקות שדה הראו כי פלטפורמת איסוף הנתונים צמצמה באופן משמעותי את המאמץ והזמן הנדרשים להשלמת איסוף מדגם כראוי. לפיכך, הפחתת כמות הנהלת החשבונות עודדה מעורבות של מדען אזרחי. הפלטפורמה מבוססת האינטרנט נועדה להתגבר על מגבלות דמוגרפיות על ידי מתן שירות תרגום מכונה עצבי רב לשוני ועל ידי מתן פרוטוקולים גרפיים אורקוליים באנגלית ובספרדית. זה היה מוצלח רק באופן חלקי כמו פחות דגימות נאספו הן סאות' ביי ומחוז צפון שבו רוב האוכלוסייה ההיספנית / לטינו של המחוז מתגוררים45. אזורים אלה גם היו 63% (1,700 מקרים לכל 100,000) מכלל מקרי COVID-19 במחוז סן דייגו עם השכיחות הגבוהה ביותר של המחלה46 ושיעור האשפוזים(62%) 47,48. למרות שרוב הדגימות הגיעו ממחוז סנטרל, מספר מייצג נאסף מהמחוזות המושפעים ביותר מ- COVID-19 ורק חלק קטן מהדגימות היה חיובי, מה שמרמז כי מאגרי פני השטח של SARS-CoV-2 בסביבה העירונית הם נדירים יחסית.
עיבוד לדוגמה. ספוגיות דגימה היו רטובות עם SDS, אשר השבית את הנגיף על ידי שיבוש המעטפה שלה וייצב את RNA עירום על ידי נפרש RNases32. בנוחות במהלך האיסוף, חומר הניקוי בספוגית ניקה את המשטח שנדגם. דגימות סביבתיות מכילות לעתים קרובות כמויות קטנות מאוד של RNA. כדי למקסם את ההתאוששות, בידוד RNA בוצע בשיטת מיצוי גולמי מבוססת GITC, נטולת טורים. GITC, סוכן צ'אוטרופי חזק, משבש את קשרי המימן השומרים על קיפול חלבונים (כלומר, אפקט הידרופובי). פעולה זו גורמת להשבתה של חלקיקים ויראליים, ואת RNA נשאר יציב עקב עיכוב של RNAses34,35,36. פתרון GITC שמר על יציבות דגימות ה- RNA ללא שיקולים קפדניים של שרשרת קרה, מה שאיפשר לאזרחים לשמור על הדגימות בטמפרטורת החדר אם מקפיא לחפיסות הקרח שסופקו לא היה זמין. כדי להפחית את הסיכון הפוטנציאלי ריאגנט זה מהווה כאשר עור ישיר או מגע רירית מתרחשת, האזרחים היו מודעים לסיכונים אלה על ידי הכללת גיליון נתונים בטיחות חומר שסופק בערכה חותם אזהרה הונח בתיבה המכילה את הצינורות.
שיטת החילוץ הגולמית GITC-chloroform סייעה להתאוששות עקבות של RNA מהמטליות, וכפי שמוצג על ידי הגברה של דגימות ממוסמרות, מעכבים לעתים רחוקות התעקשו בדגימות לאחר החילוץ. דגימות, שהיו שליליות עבור SARS-CoV-2 ולא הראו עיכוב RT-LAMP, ייצגו תשלילים אמיתיים או היה מספר עותק נמוך יותר מאשר LOD בתדר 100%. לעומת זאת, זיהוי של RNA ויראלי על משטח אינו מרמז ישירות על הסיכון של שידור באמצעות מגע כמו הדבקות של הנגיף מדגימות חיוביות צריך להיבדק. סינון מהיר של הסביבה, לא מוגבל על ידי הזמינות של אספקה מתוחכמת או כוח אדם מוסמך מאוד, הוא חיוני כדי להעריך אם משטחים מהווים מאגר ויראלי כדי לשפר את מאמצי מניעה והכלה ישירה.
RT-LAMP נבחרה להיות השיטה הטובה ביותר המתאימה לצינור הזיהוי המוצע. זה הוכיח להיות שיטה מהירה וזולה כי היה עמיד מאוד לרוב המעכבים הנותרים רגיש וספציפי כמו שיטות אחרות RT-qPCR. בשל השימוש בהם בהגדרות קליניות במהלך מגפת SARS-CoV-2, הזמינות של ערכות RT-qPCR הושפעה מהביקוש העולמי. יתר על כן, טכניקות RT-qPCR - אפילו אלה שנוסחו כדי להתנגד למעכבים - היו רגישות לחומרים הכלולים בדגימות הסביבתיות שנאספו על ידי קבוצת פיילוט של מדענים אזרחיים, גם לאחר שימוש באסטרטגיות נפוצות אחרות להפחתת התחרות המעכבת על כריכתאנזימים 49. ממצאים אלה מאומתים על ידי מחקר שנערך לאחרונה שהשווה את שתי השיטות לגילוי SARS-CoV-2 על דגימות ספוגית מממתקים שטופלו על ידי חולי COVID-19 ומצא מעל 83% קונקורדנציה תוצאה, עם עיכוב נמוך ב -25% בדגימות שנותחו על ידי RT-LAMP15. יתר על כן, מיצוי גולמי GITC-כלורופורם, יחד עם RT-LAMP, הפחית את העלות של ריאגנטים ואספקה על ידי 42% לעומת מיצוי ערכת RNA ו RT-qPCR (שולחן החומרים).
שיטה זו אפשרה ניתוח תפוקה גבוהה של אלפי דגימות ספוגית פני השטח. עד 80 בריכות, המייצגות 640 דגימות, עובדו תוך יומיים מיצוי RNA לגילוי SARS-CoV-2 על ידי RT-LAMP. הפרוטוקול המוצע הוא חצי שוויוני, מוגבל לגילוי של RNA ויראלי, ואינו מצביע על נוכחות של חלקיקים נגיפיים זיהומיות. ניתוח נוסף נדרש כדי להעריך את הסיכון של העברת SARS-CoV-2 מ fomites נגוע נוכח על משטחים מנוקב.
מחקר זה מציג פרוטוקול כדי להגדיר במהירות אסטרטגיית בדיקה הכוללת זרימת עבודה יעילה כאשר מתמודדים עם מצב חירום בריאותי עם מחלה מדבקת. פרוטוקול הדגימה המוצע הוא פשוט ומשתמש באספקה הנפוצה במשקי בית, ושיטת הגילוי הנגיפית מתבצעת על ציוד הזמין בהגדרות מעבדה בסיסיות כגון אמבט מים במקום תרמוציקלר. העלויות של ריאגנטים RT-LAMP נמוכות משמעותית מאלה הדרושות עבור RT-qPCR ופחות רגישות לתרחישי ביקוש גלובליים גבוהים. מחקר זה משמש מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים בהתפרצויות מגיפות עתידיות ומגפות עולמיות.

SARS-CoV-2 הוא חשב להיות מועבר בעיקר באמצעות שאיפה של אירוסולים מזוהמים טיפות ממגע ישיר עם אנשים נגועים1,2,3,4. עם זאת, בשלבים הראשונים של מגפת COVID-19 העולמית, המאמצים לשלוט בהעברת SARS-CoV-2 התמקדו מאוד בחיטוי משטחים, שטיפת ידיים וחיטוי. עד סוף 2020, הנחיות שידור מארגון הבריאות העולמי (WHO)5 והמרכזים האמריקניים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC)6 נחשבים שידור מוטס סכנה בעיקר כאשר במגע הדוק (<2 מ ') עם אדם נגוע או בנוכחות הליכים רפואיים מייצרי תרסיס. חיסון עצמי לאחר מגע עם משטחים מזוהמים או שאיפה של fomites תרסיס עדיין לא נשללו כמסלול של שידור של SARS-CoV-2.
דווח על מקרי COVID-19 שבהם שידור מוטס נראה לא סביר7,8. SARS-CoV-2 virions להישאר זיהומיות על נחושת עד 8 שעות, על קרטון ופלדת אל-חלד עד 24 שעות, ועל פלסטיק עד 48 שעות9. בבקתות ספינות תענוגות, SARS-CoV-2 RNA זוהה 17 ימים לאחר שהנוסעים יצאו7. דגימות אוויר ומשטח מבתי חולים ומערכות הסעת המונים נמצאו חיוביות לסארס-CoV-2 ולנגיף קורונה אחר8,10,11,12,13,14. מחקר שנערך על האריזה החיצונית של ממתקי ליל כל הקדושים שטופלו על ידי חולי COVID-19 אסימפטומטיים ומתונים/סימפטומטיים במקצת, הגיע למסקנה כי השילוב של שטיפת ידיים על ידי המטפל ושטיפת הממתקים עם סבון ידיים הפחית את ה- SARS-CoV-2 RNA לרמותסף נמוכות יותר 15.
מספר שיטות לאבחון SARS-CoV-2 פורסמו בהתבסס על תגובת שרשרת פולימראז הפוכה בזמן אמת (RT-qPCR)16,17, הגברה איזותרמית בתיווך לולאה הפוכה (RT-LAMP)11,18,19,20,21, ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 , 19 , 22 , 22 , 20 , ו CRISPR-Cas טכנולוגיות 18 ,19,22,22 , 20,ו CRISPR-Cas טכנולוגיות18, רובם דורשים ערכות מיצוי RNA שלעתים קרובות נמצאות במחסור בתקופות של ביקוש עולמי משמעותי, ומעט מאוד שימשו לבדיקה סביבתית של הנגיף24. הגילוי של SARS-CoV-2 RNA באמצעות RT-LAMP הוכח להיות מעל 83% קונקורדנטי לשימוש RT-qPCR. יתר על כן, RT-LAMP הביאה לירידה של 25% בתוצאות חד משמעיות בהשוואה ל- RT-qPCR15.
RT-LAMP היא טכניקה פשוטה המשתמשת שעתוק הפוך לסנתז cDNA מתבנית RNA25, ואחריו פולימראז DNA עם פעילות עקירת גדילים חזקה כי מסנתז DNA בטמפרטורה קבועה (כלומר, הגברה isothermal)26. ספציפיות גבוהה יותר של גילוי גנום ויראלי מושגת באמצעות ארבעה או שישה פרייומרים המזהים שישה או שמונה אזורים של ה- DNA היעד. הגברה מתחילה מפריימר פנימי ומניבה מבנה דנ"א דו-גדילי למחצה. הגדיל המוביל מוגבר לאחר מכן על ידי פריימר חיצוני. הגברות אלה חוזרות על עצמן עבור פריימרים הפוכים. פריימרים פנימיים וחיצוניים משני הקצה יש אתר פנימי הפוך משלים עצמי היוצר לולאה במוצר הגברה26,27. בתזוזת גדילים איסותרמית, סינתזת DNA אסינכרונית מייצרת כמויות גבוהות של מוצר מוגבר שבו פולמור מתמשך מגביר את האות של כמה 10 עותקים לכלתגובה 11,20,28. תערובת RT-LAMP הצבעונית היא מאגר חלש ומשתמשת באדום פנול כמחוון pH. כמו פולימראז משלב נוקלאוטידים, הוא משחרר פרוטון, מספיק פרוטונים ישנו את ה- pH של הפתרון, כמו גם את צבעו מוורוד לצהוב11,20,28,29.
RT-LAMP פותחה לגילוי מחלות המועברות על ידי יתושים במתקני בריאות היקפיים שאין בהם מעבדות מאובזרות25 ולזיהוי מהיר של נגיפי RNA אחרים כמו וירוס כשל חיסוני אנושי30. האוכלוסיות הפגיעות ביותר בהתפרצויות מגיפה – לפי הגדרת ארגון הבריאות העולמי – חסרות לעתים קרובות מספיק משאבים כלכליים ואת הציוד המתאים לביצוע איתור (סדר היום של האו"ם לבריאות הציבור העולמית). במגפת SARS-CoV-2 הנוכחית, אספקה כגון ספוגיות ברמה רפואית ריאגנטים עבור ערכות מיצוי RNA לא הצליחו לענות על הביקוש העולמי, במיוחד במדינות שאינן ייצור. הפרוטוקול המוצע השתמש בחילוץ RNA גולמי מבוסס guanidinium thiocyanate (GITC), אשר למעשה שימר את ה- RNA באופן עצמאי בשרשרת קרה והפחית באופן משמעותי את ההתמדה של מעכבים מהמדגם. יתר על כן, פרוטוקול החילוץ GITC-chloroform מבוסס על הפרדת RNA מ- DNA וחלבונים ואחריו המשקעים המתאימים, המאפשר התאוששות של רוב החומר הגנטי. יתרונות אלה עולים על הסיכונים הפוטנציאליים של מדענים אזרחיים המטפלים בכימיקל אם ננקטים אמצעים כדי ליידע אותם כראוי על הסיכונים.
זרימת העבודה המוצעת משתמשת בחומרים ובריאגנטים הנמצאים בשימוש כללי. זה דורש ציוד זמין בסיסי, לעתים קרובות כפרי, הגדרות מעבדה. שיטות אלה הן זולות, עמידות מאוד מעכבים נמצא לעתים קרובות דגימות סביבתיות או דגימות שלא ניתן לעבד עם ערכות החילוץ, ולחסל את הצורך תרמוציקלר דיוק גבוה. מחקר זה מציג צינור לדגימה וגילוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים על משטחים נפוצים שנגעו בהם ורק לעתים רחוקות מחוטאים של משקי הבית והסביבה העירונית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

כדי לשלוט בהעברת הקהילה של תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) במהלך המגפה העולמית 2020, רוב המדינות יישמו אסטרטגיות המבוססות על בדיקות אנושיות ישירות, כיסוי פנים וחיטוי משטחים. תחת ההנחה כי נתיב השידור העיקרי כולל אירוסולים וטיפות נשימה, המאמצים לאתר SARS-CoV-2 ב fomites התמקדו במקומות החשודים בשכיחות גבוהה (למשל, מחלקות בית חולים, ספינות שייט, ומערכות הסעת המונים). כדי לחקור את נוכחותם של SARS-CoV-2 על משטחים בסביבה העירונית כי הם לעתים רחוקות ניקה ורק לעתים רחוקות חיטוי, 350 אזרחים גויסו ממחוז סן דייגו רבתי. בסך הכל, מדענים אזרחיים אלה אספו 4,080 דגימות. פלטפורמה מקוונת פותחה כדי לפקח על משלוח ערכת דגימה ואיסוף, כמו גם לאסוף נתונים לדוגמה. ערכות הדגימה נבנו ברובן מאספקה הזמינה בחנויות לחוצות מגפה. דגימות עובדו באמצעות ריאגנטים שהיו קלים לגישה למרות המחסור החוזר ונשנה באספקה. השיטות בהן נעשה שימוש היו רגישות מאוד ועמידות בפני מעכבים הנמצאים בדרך כלל בדגימות סביבתיות. שיטות התכנון והעיבוד הניסיוניות המוצעות הצליחו לערב מדענים אזרחיים רבים שאספו ביעילות דגימות משטחים מגוונים. זרימת העבודה והשיטות המתוארות כאן רלוונטיות לסקר את הסביבה העירונית עבור וירוסים אחרים, אשר מהווים דאגה לבריאות הציבור ומהווים איום למגפות עתידיות.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

מחקר זה מציג זרימת עבודה חדשנית לגילוי SARS-CoV-2 על משטחים המנקים לעתים רחוקות בסביבה העירונית, כגון ידיות משאבת גז, גני שעשועים וכספומטים. במגיפה, האספקה נדירה. אנו משתמשים בחומרים הניתנים להשגה בקלות ריאגנטים וציוד זמין בהגדרות מעבדה בסיסיות.אנו משתמשים בשיטת מיצוי המשמרת את ה- RNA ללא שרשרת קרה, ושיטת זיהוי עמידה בפני מעכבים. פרוטוקול זה הוא אינטרס בריאות הציבור. הוא מספק מסגרת להערכת מאגרים ויראליים סביבתיים למגפת COVID-19 הנוכחית וסוכנים זיהומיים אחרים במהלך התפרצויות עולמיות עתידיות.לגייס מדענים אזרחיים באמצעות קריאה ישירה וברורה לפעולה שפורסמה באמצעות מדיה מקומית וחברתית. צור מזהה ייחודי (handle) של מדיה חברתית כדי לחבר את הנושא בין תוכן מדיה חברתית. צור קישור ל- SMP, המספק תוסף רב-לשוני כדי לאפשר ניווט בשפות מרובות עבור אנשים להגיש בקשה להשתתף במאמץ הדגימה הסביבתית על-ידי מענה על שאלות הקשורות ל- biosafety שצוינו בטופס מקוון.כלול במקטע הדגימה פרוטוקולים גרפיים ושמעיים באנגלית ובספרדית. דמיין נתונים גאו-מרחביים באמצעות ממשק תכנות יישומים גאו-מרחבי בהנחיית ספק שירותי מחשב בענן. אחסן את הנתונים שנשלחו ל- LIMS באמצעות SMP כדי להקל על אחסון מרכזי, מעקב אחר תהליכי עבודה של עיבוד וניהול הלוגיסטיקה.טען מראש מידע כגון מזהה ערכה לדוגמה, מזהה לדוגמה, תאריך, שעה וקואורדינטות מערכת מיקום כלליות כדי לאפשר תאימות של סוגי נתונים ולמזער את השגיאה. כלול קישור לדוגמה לבקשת איסוף עבור המשתתפים, שבו הם יכולים להשתמש לאחר שאספו את כל הדגימות. בנה ערכה המכילה את כל ציוד הדגימה, כולל ציוד המגן האישי הדרוש, כגון מסכה וכפפות, פרוטוקול דגימה ומידע רלוונטי לאבטחה ביולוגית.ספוגית לעתים רחוקות חיטוי משטחים במשקי הבית ובסביבה העירונית על ידי הרטבת ספוגית פוליאסטר מרובע סנטימטר אחד סופג עם חומר ניקוי וניקוי משטח של 10 ס"מ בריבוע. בעזרת קיסם, להטביע כל דגימת דגימה בצינור שכותרתו מראש המכיל 200 microliters של guanidinium thiocyanate. ללבוש את המסכה שסופקה זוג חדש של כפפות עבור האוסף של כל מדגם, כדי למנוע זיהום צולב.לאחר סיום הדגימה, השתמש בחיטוי הידיים שסופק. לאחסן את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מועברים למעבדה. ברגע שהדגימות מגיעות למעבדה, אחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי להגביר את מהירות ההקרנה, לעבד את הדגימות בבריכות. אם מאגר הוא חיובי, לחלץ את ה-RNA של כל מדגם באופן עצמאי. שלב את הדגימות מכל ערכת דגימה לשתי בריכות על ידי איגום 50 מיקרוליטרים של כל אחת משמונה הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה ושמירת הדגימות הנותרות במינוס 80 מעלות צלזיוס.הוסף 80 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת במשך 15 שניות. ואז דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את השכבה המ מימית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. אחסנו את שאר הממשק והנוזל הוורוד במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. שברים אלה מכילים DNA וחלבונים.לחלץ RNA משכבת מימית התאושש באמצעות פרוטוקול מיצוי גולמי RNA מבוסס guanidinium. הכינו את תערובת התגובה RT-LAMP בטמפרטורת החדר עם נפח עודף של 10% כדי להסביר את אובדן הצינור. הוסף חמישה מיקרוליטרים של RNA לתגובת המדגם וחמישה מיקרוליטרים של RNA בתוספת 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 RNA סינתטי לתגובה הממוסמרת.הוסף 2.5 מיקרוליטרים של SARS-CoV-2 סינתטי RNA לשליטה חיובית וחמישה microliters של מים לשליטה שלילית. מערבבים היטב ומסובבים את התגובות. עבור התבוננות עיוורת, תוצאה שלילית מסומנת על ידי ורוד ותוצאה חיובית מסומנת על ידי צהוב.לאחר RT-LAMP, בצע אלקטרופורזה ג'ל. ההפצה של אתרי איסוף לדוגמה מוצגת כאן. רוב הערכות הושלמו, והנתונים המתאימים הועלו ל- LIMS.מגבלת הגילוי בתדר של 100% הייתה 500 עותקים לכל 25 מיקרוליטרים של תגובה. ב- RT-LAMP הצבעוני, דגימות חיוביות שינו צבע מוורוד לצהוב עקב שינוי pH משמונה ל- 5.5. במספרי עותק נמוך, דגימות היו לרוץ על ג'ל agarose כדי לאשר את החיוביות עם דפוס דמוי סולם וכתוצאה מכך.שיטות QPCR RT נבדקו עם דגימות סביבתיות. כל תערובות האב היו רגישות למעכבים בריכוזי מספר עותק נמוך של השליטה החיובית. בריכוזים נמוכים של התבנית, שיטות PCR RT מסורתיות הראו תוצאות חיוביות שגויות ותשלילים כוזבים.לבסוף, טכניקה הנקראת הגברה מעגלית מתגלגלת זיהתה כמויות קטנות של רצף היעד. עם זאת, זה הראה הגברה של החללית בהיעדר תבנית RNA. חיוני לשחרר קריאה לפעולה שמגיעה לכל המגזרים בקהילה כך שהדגימה באמת מייצגת את הסיכון לחשיפה של כל חברי הקהילה.מסגרת זו מזהה חומר גנטי SARS-CoV-2. מחקרים לבדיקת כדאיות נגיפית הם השלב הבא.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...