Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

우리는 바이러스 정보 연구소 (VII) 조사관, 박사 앙카 M. 세갈, 윌로우 세갈, 패트리샤 L. 로워, 게리 로워, 캐리 L. 로워, 막다 실비아 피네타, 엘리자베스 크루즈 카노, 박사 그레고리 피터스, 박사 스튜어트 A. 샌딘, 박사 제니퍼 스미스에게 많은 샘플을 수집하기 위해 시간을 복용. 우리는 또한 긍정적인 통제 및 유용한 피드백을 촉진하기위한 샌디에고 캘리포니아 의과 대학 (UCSD)의 소아과부에서 박사 롭 나이트, 잭 길버트 박사, 페드로 발다 - 페레 박사, 박사 사라 알라드 감사합니다. 스테이시 카로타(SDSU 과학대학)와 지나 스피델(SDSU)에게 물류 지원에 감사드리며, 후안 로드리게스는 샘플링 프로토콜의 예술과 그래픽 디자인에 감사드립니다. 우리는 매우 어려운 시기에이 프로젝트에 대한 헌신과 헌신에 대한 모든 참가자들에게 감사드립니다. 이 작품은 조 앤 레인 박사 (SDSU 과학 대학)와 국립 과학 재단 RAPID : SARS-CoV-2 보조금의 환경 저수지 (상 번호 : 2030479)의 관대 한 기부에 의해 지원되었다.

카탈로그 번호, 제조업체 및 해당 비용을 포함한 자세한 시약 및 소모품 목록은 재료 표를 참조하십시오.
1. 도시 환경 샘플링
<ol><li>시민 과학자 봉사 활동<ol><li>지역 및 소셜 미디어를 통해 발표 된 직접적이고 명확한 행동을 사용하여 시민 과학자를 모집하십시오. 소셜 미디어 핸들(예: #swab4corona)을만들어 주제를 소셜 미디어 콘텐츠에 연결합니다.</li>
		<li>관심 지역의 주요 언어(예: 샌디에이고 카운티의 스페인어 및 영어)에 능통하는 사람이 관리하는 실험실 팀과 각 시민 과학자 간의 직접 통신을 위한 이메일 계정을 만듭니다.</li>
		<li>데이터베이스, 실험실 정보 관리 시스템(LIMS) 역할을 하고 시민 과학자들과 통신할 수 있는 안전한 웹 기반 샘플 관리 플랫폼(SMP)을 구축합니다. 참고: SMP는 사용자가 키트를 요청하고, 샘플 수집 프로토콜에 액세스하고, 샘플 메타데이터를 제출하고, 완성된 샘플 키트에 대한 픽업을 요청하는 중앙 집중식 위치를 제공합니다.</li>
		<li>온라인 형태로 지정된 생물안전 관련 질문에 답하여 개인이 환경 샘플링 활동에 참여할 수 있도록 SMP(예: https://demo.covidsample.org/)(그림1)에대한 링크를 만듭니다.</li>
		<li>클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 인증 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 사용하여 SMP에 안전하게 액세스할 수 있습니다. 승인된 사용자에게 SMP에 대한 액세스 권한을 부여합니다. 참고: 인증 및 권한 부여를 위해 OAuth 2.0 프로토콜31에 대한 설명은 문헌을 참조하십시오. 그것은 시민 과학자 자원 봉사자를위한 마찰없는 로그인 프로세스를 제공합니다. 또한 사용자가 기존 계정으로 로그인할 수 있으므로 사용자 지정 로그인 솔루션을 만들고 사용자 자격 증명을 관리할 필요가 없으므로 상당한 시간을 절약하고 참여를 유도합니다. 최근 보고서에 따르면 선택한 클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 사용할 수 있는 무료 이메일 서비스에는 매월 약 15억 명의 활성 이메일 사용자가 있습니다. 참여를 위해 이 서비스 제공업체의 이메일 계정을 요구하는 것은 실망스러운 요인으로 간주되지 않습니다.</li>
		<li>첫 번째 키트를 요청하기 전에 SMP의 시민 과학자들에게 연구 및 생물 안전 고려 사항의 목적을 설명하십시오. 다국어 플러그인을 제공하여 클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 다국어 신경 기계 번역 서비스에서 사용할 수 있는 모든 언어로 탐색할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>영어와 스페인어로 샘플링 섹션 그래픽 및 시청각 프로토콜을 포함합니다.</li>
		<li>각 키트에 고유 식별자를 할당하고 샘플 ID에 연결된 단추를 사용하여 데이터 입력프로세스(그림 1A)를간소화하도록 사용자 인터페이스를 설계합니다.</li>
		<li>배달/픽업 경로를 최적화하고 시민 과학자들에게 정확한 예상 도착 시간을 알리기 위해 운전자가 사용하는 모바일 장치 응용 프로그램과 함께 배달 경로 계획 소프트웨어를 사용합니다.</li>
		<li>PHP 웹 서비스 스택에서 LIMS 플랫폼을 구축하고 상용 호스팅 플랫폼에서 호스팅합니다(제안된 운영 체제, 웹 서버 소프트웨어 및 데이터베이스 소프트웨어는 재료 표에지정됨).</li>
		<li>LIMS에서 랩 직원이 데이터를 빠르고 쉽게 관리할 수 있도록 안전한 웹 기반 응용 프로그램 인터페이스를 제공합니다. 클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 데이터 차트 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 사용하여 데이터 시각화를 제공합니다.</li>
		<li>클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 지리 공간 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 사용하여 지리 공간 데이터를 시각화합니다. 프로젝트 데이터의 중앙 집중식 저장을 용이하게 하기 위해 SMP를 통해 LIMS에 제출된 데이터를 저장합니다. (2) 샘플/데이터 처리 워크플로우 추적; (3) 시민 과학자들에게 샘플 키트 배포물류의 관리.</li>
		<li>모범 사례(예: https://demo.covidsample.org/)를사용하여 제출된 메타데이터를 보호합니다.</li>
		<li>샘플 키트 ID, 샘플 ID, 날짜, 시간 및 글로벌 포지셔닝 시스템(GPS)과 같은 사전 로드 정보는 데이터 유형 준수를 가능하게 하고 사용자가 잘못하거나 누락된 데이터의 제출을 최소화하기 위해(사이트의 사진에서 자동으로 수집)를 조정합니다(그림1B). 시민 과학자가 입력한 다음 필드(<1분)를 수집 날짜와 시간, 위치 설명 및 샘플링 사이트의 그림과 같은 다음 필드를 포함합니다.</li>
		<li>업로드된 모든 데이터를 소독하고 데이터 형식의 유효성을 검사합니다. 예를 들어 사용자가 업로드한 이미지 데이터의 유효성을 검사하여 파일을 .jpg 선택하고, 샘플과 빠르게 연결하기 위해 샘플 ID로 이름을 변경하고, 업로드된 이미지를 사용자가 액세스할 수 없는 별도의 보안 위치에 저장합니다.</li>
		<li>모든 샘플(16)이 완료되었을 때 키트 배달 및 픽업을 요청하는 옵션을 활성화합니다. 또한 이전 키트를 픽업할 때 새 키트를 배달하도록 요청하는 옵션을 활성화합니다(그림1A). 참고: 비웹 기반 플랫폼을 선호하는 자원봉사자와 GPS 위치 공개에 대해 걱정하는 자원봉사자(예: 철새 상태에 대해 우려하는 커뮤니티 회원)의 경우 합의된 모임 위치에서 키트를 배달할 수 있으며 자원 봉사자는 데이터 수집의 서면 버전을 기록하도록 요청합니다. 실험실과 각 시민 과학자 사이의 통신을 위해, 전화 및 문자에 사용할 수있는 프로젝트의 이중 언어 구성원이있다.</li>
	</ol></li>
	<li>코로나를 위한 면봉<ol>
<li>샘플링 노력에 대한 역학적으로 관련된 시간 창을 식별합니다.</li>
		<li>필요한 개인 보호 장비(즉, 마스크, 장갑), 샘플링 프로토콜 및 생물 안전 관련정보(그림 2)를포함하여 모든 샘플링 소모품을 포함하는 키트를 작성합니다. 할당된 고유 식별자(샘플 ID)로 각 튜브에 미리 레이블을 지정합니다.</li>
		<li>Swab은 가정과 도시 환경에서 에어로졸화 된 포미트에 노출되는 거의 소독되지 않습니다.<ol>
<li>제공된 마스크와 각 시료의 수집을 위한 새로운 장갑을 착용하여 교차 오염을 방지합니다. 샘플링을 마친 후 제공된 손 소독제를 사용하십시오.</li>
			<li>1cm2 폴리에스테르 흡수성 면봉(예를 들어, 걸프 패드)을 세제(예를 들어, 0.5% 나트륨 도데실 황산염(SDS)로 적어 봉투를 방해하여 바이러스를 비활성화하고 RNases32의전개를 유도하여 알몸 RNA를 안정화한다.</li>
			<li>10cm2의표면을 면봉. 이쑤시개에 의해 지원, 완전히 구니디늄 티오야네이트 용액 (GITC)의 200 μL을 포함하는 해당 사전 라벨 튜브에 각 샘플 면봉을 침수. 튜브를 실험실로 운반할 때까지 4°C로 저장합니다. 샘플이 실험실에 도착하면 -80 °C에 보관하십시오. 참고: GITC는 독성 자극제입니다. 피부와의 접촉을 피하십시오. GITC 솔루션은 일반적인 실험실 화학 물질에서 준비하는 것이 간단합니다, 조리법은33,34를참조하십시오. 그것은 바이러스를 비활성화하고, RNases34,35,36을데스팅하여 RNA를 안정시키고, 실온에서 샘플을 안정화시. 그러나 이 키트에는 가정용 냉장고를 보관할 필요 없이 샘플을 차갑게 유지하기 위한 아이스 팩이 포함되어 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. SARS-CoV-2 감지
<ol><li>총 RNA 격리<ol>
<li>2mM 구리 황산염 및 3% 과산화수소의 용액으로 표면, 장비 및 파이펫토를 소독하는 단계; 다음으로 표백제 10%, 중탄산나트륨 90m, SDS 5%, NaOH 2.5% 용액이 그 뒤를 이었다. 증류수로 철저히 닦아, 75% 에탄올이 뒤따릅니다. 참고: 이러한 솔루션은 시판되는 솔루션의 대안입니다.</li>
		<li>얼음에 샘플을 해동. 중간 속도로 2 분 동안 소용돌이 샘플을 채취한다.</li>
		<li>스크리닝 속도를 높이려면 풀에서 샘플을 처리합니다. 풀이 양성인 경우, 양수 시료/s를 찾기 위해 각 샘플의 RNA를 독립적으로 추출한다. 각 샘플링 키트(총 16개)의 샘플을 8개의 샘플 2개의 풀에 결합합니다. 참고: 풀당 8개의 샘플을 보유하면 키트당 2개의 풀만 처리해야 합니다. 풀이 양수인 경우 개별 RT-LAMP 분석을 위해 개별 샘플을 다시 처리합니다. 이렇게 하면 시간, 비용 및 시약이 줄어듭니다.</li>
		<li>8개의 샘플 각각의 풀 50 μL을 미세 원심분리기 튜브로 넣습니다(총 부피 400 μL); 나머지 샘플을 -80°C에서 저장합니다. 클로로폼의 0.2부부(80μL)를 추가한 다음, 15초 동안 소용돌이를 한 다음 4°C에서 20분 동안 배양합니다. 원심분리기는 13,000 × g에서 4°C에서 20분 동안.</li>
		<li>수성(투명 액체) 층을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기다. -80°C 냉동고에 남은 인터페이스와 분홍색 액체를 저장; 이러한 분획은 DNA및단백질(33,36)을함유하고 있다.</li>
		<li>동일한 부피량의 이소프로판올(~200 μL)과 글리코겐 계수(15mg mL-1)37의2.6 μL을 추가한다. 잘 섞고 -20°C에서 적어도 1시간 동안 배양하고, RNA를 침전시키기 위해 10분 동안 4°C가 뒤따릅니다. 참고: 프로토콜은 1h 대신 하룻밤 -20°C의 샘플을 배양하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
		<li>원심분리기는 13,000 × g에서 4°C에서 20분 동안. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거합니다. 50 μL의 디틸피로카보네이트(DEPC)처리된 물로 펠릿을 재연하고, RNase 가 없는 5M 암모늄 아세테이트의 동일한 부피(50 μL)와 100% 에탄올7,38의2.5부피량(250 μl)을 첨가한다. 참고: 암모늄 이온은 하류공정(38)에사용되는 경우 폴리뉴클레오티드 키나아제억제한다. 혼합은 탈옥뉴클레오사이드 삼중산염및 올리고당(38)을 방치하면서 RNA를침전시한다.</li>
		<li>잘 섞고 -20°C에서 적어도 1시간 동안 배양하고, RNA를 침전시키기 위해 10분 동안 4°C가 뒤따릅니다. 참고: 프로토콜은 1h 대신 하룻밤 -20°C의 샘플을 배양하여 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
		<li>원심분리기는 13,000 × g에서 4°C에서 20분 동안. 펠릿을 1mL의 감기(-20°C)로 씻어내고, 갓 만든 75% 에탄올을 만들어 낸다. 원심분리기는 8,000 × g에서 4°C에서 5분 동안. 펠릿을 방해하지 않도록 P10 파이펫으로 상체를 제거합니다.</li>
		<li>남은 에탄올이 없을 때까지 10-15분 동안 펠릿을 공기 건조시키십시오. DEPC 처리된 물의 50 μL에서 펠릿을 재연하고, 10배 DNase 버퍼 + 1μL의 5μL을 DNase(2단위μL-1)로추가하고 30분 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
		<li>DNase 비활성화 시약의 0.1 부피 (5.6 μL)를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하고 분마다 부드럽게 섞습니다. 원심분리기는 13,000 × g에서 2분 동안, 새로운 튜브(~50 μL)로 상류체를 전송합니다. RT-qPCR 또는 RT-LAMP 반응을 준비하는 동안 튜브를 얼음 에 즉시 놓거나 -20 °C 냉동고에 보관하십시오. 참고: 이월 오염을 방지하기 위해 앰플리턴이 없는 방에서 RNA 격리를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>멀티플렉스 역전사 루프-중재된 이더피 증폭(RT-LAMP)<ol>
<li>프라이머의 각 세트에 대해 20X 프라이머 믹스 솔루션(표 1)을 준비한다(표 2) 피펫팅 손실을 고려하여 10%의 초과 부피로 실온에서 RT-LAMP 반응 믹스(표 3)를 준비합니다. 참고: 남극 열람실 우라실-DNA 글리코슬라제(UDG)와 컬러메트릭 램프 2X 마스터 믹스는 이전 반응20,28로부터DNA 오염의 증폭을 방지한다.</li>
		<li>소용돌이와 혼합물을 아래로 회전. 각 반응 튜브에 믹스의 20 μL을 분배 : 샘플, 스파이크, 긍정적 인 제어,및 음의 제어. UDG가 잠재적인 이월 오염에 작용할 수 있도록 실온에서 10분 동안 튜브의 반응을 배양합니다.</li>
		<li>샘플 반응에 RNA 5μL, RNA 5μL + 합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 μL(450부) 및 합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 μL(450카피) 양성 대조군 반응에,H2O의 5μL을 첨가하여 음의 대조반응을 일으킨다. 잘 섞어서 반응을 줄입니다. 얼음에 모든 RNA를 해동.</li>
		<li>열순환기 또는 수조는 65°C로 가열되는 동안 모든 반응이 실온에서 유지되도록 합니다. UDG는 >50°C에서 비활성화됩니다. 체온사이클러(열 뚜껑 사용) 반응을 65°C에서 40분 동안 배양하고, 반응이 실온(~22°C 5분)에 도달하도록 하거나, 얼음위에서 1분간 식힙니다. 착색 기능(간단한 관찰)을 사용하거나 아가로즈 젤로 제품을 실행하여 결과를 분석합니다. 참고: 검출 제한(LOD)은 반응당 10부이지만, 복사 수가 반응당 500부(그림3A)에가까워지면서 검출 빈도가 증가합니다. 색색 관찰의 경우 음수 결과가 분홍색(pH = 8.8)으로 표시되는 반면, 양수 결과는 노란색(pH = 5)(도3B)으로표시됩니다. 색상 옵션은 증폭 후 RT-LAMP 튜브의 개방을 방지하여 작업 환경에서 RT-LAMP 제품의 부피를 줄이고 이월 오염을 방지합니다. 젤 전기 전도의 경우, 0.5 % 트리스 / Borate / EDTA (TBE) 버퍼에 1X DNA 젤 얼룩으로 1.5 % 아가로즈 젤을 준비하십시오. 반응의 25 μL + 각 우물에 6X 로딩 염료의 5 μL을 로드합니다. 젤을 100 V에서 60분 동안 실행합니다. 양극 시료가 사다리패턴(도 3C)을나타내기 때문에 분자 마커가 필요하지 않다.</li>
	</ol></li>
</ol>

모든 저자는 경쟁적인 이해관계가 존재하지 않는다고 선언합니다.

시민 과학자 참여. 시민 과학자들은 도시 환경에서 SARS-CoV-2의 존재를 샘플링하고 감지하기 위해 샌디에고 카운티 전역의 면봉 표면에 모집되었습니다. 배달된 샘플링 키트의 대부분(70%) 실험실로 반환되었고, 그 중 거의 모든 샘플이 완료되었습니다 (91%) (그림3A,B 및 표 4). 자원 봉사자는 웹 기반 플랫폼을 통해 키트 배달 / 픽업을 쉽게 요청할 수 있으며 배달 경로 계획 소프트웨어는 시민 과학자들에게 예상 도착 시간을 통보했으며, 관찰 된 성공에 중요한 요소가 될 수 있습니다. 키트가 시민 과학자에게 전달되었을 때실험실로 반환된 시점까지의 평균 시간은 8일, 중앙값은 3일, 1-64일(그림 3A 및 표 4)이었다. 자원봉사자들에게 더 자주 알림이 더 자주 주어질수록 이 지연 시간이 단축될 수 있습니다.
데이터 수집 플랫폼은 대다수의 사용자(73%)가 성공적으로 사용했습니다. (표4). 시민 과학자들의 노력은 측정되지 않았지만, 현장 테스트결과 데이터 수집 플랫폼은 샘플 수집을 제대로 완료하는 데 필요한 노력과 시간을 크게 줄였습니다. 따라서, 부기의 양을 줄이는 것은 시민 과학자참여를 장려했다. 웹 기반 플랫폼은 다국어 신경 기계 번역 서비스를 제공하고 영어와 스페인어로 그래픽 및 시청각 프로토콜을 제공함으로써 인구 통계학적 한계를 극복하기 위한 것입니다. 이것은 카운티의 히스패닉 / 라틴계 인구의 대부분이거주하는사우스 베이와 노스 카운티 모두에서 수집 된 샘플수가 적기 때문에 부분적으로만 성공했습니다. 이 지역은 또한 샌디에고 카운티에서 총 COVID-19 케이스의 63%(100,000명 당 1,700례)를 수용했으며, 질병46의 가장 높은 보급률과 입원률(62%)47,48. 대부분의 샘플은 센트럴 카운티에서 나왔지만, 가장 COVID-19에 영향을 받은 지역에서 대표적인 숫자를 수집했으며 샘플의 극히 일부만 양성으로 도시 환경에서 SARS-CoV-2의 표면 저수지가 상대적으로 드물다는 것을 시사합니다.
샘플 처리. 샘플링 면봉은 SDS로 젖어 봉투를 방해하여 바이러스를 활성화하고 RNases32를전개하여 알몸 RNA를 안정화시켰습니다. 수거 중 편리하게 면봉의 세제는 샘플링된 표면을 세척했습니다. 환경 샘플은 종종 매우 소량의 RNA를 함유하고 있습니다. 회복을 극대화하기 위해, RNA 절연은 GITC 기반, 컬럼 프리, 조잡한 추출 방법을 사용하여 수행되었다. GITC, 강한 chaotropic 에이전트, 단백질 접이식 유지 하는 수소 결합을 방해 (즉, 소수 성 효과). 이러한 작용은 바이러스 성 입자의 불활성화를 초래하고, RNA는RNA(34),35,36의억제로 인해 안정적으로 유지된다. GITC 용액은 엄격한 콜드 체인 고려 없이 RNA 샘플의 안정성을 유지하여 제공된 얼음 팩용 냉동고를 사용할 수 없는 경우 시민들이 실온에서 시료를 유지할 수 있도록 했습니다. 직접적인 피부 나 점막 접촉이 발생할 때 이 시약이 발생할 때 이러한 위험 위험을 줄이기 위해 시민들은 키트에 제공된 재료 안전 데이터 시트를 포함시킴으로써 이러한 위험을 인식하고 튜브를 포함하는 상자에 경고 씰을 배치했습니다.
조잡한 GITC-클로로폼 추출 방법은 면봉에서 RNA의 흔적의 회복을 도왔으며, 스파이크 샘플의 증폭에 의해 도시된 바와 같이, 억제제는 추출 후 샘플에서 거의 지속되지 않습니다. SARS-CoV-2에 대해 부정적이고 RT-LAMP 억제가 나타나지 않은 샘플은 진정한 네거티브를 나타내거나 100% 주파수에서 LOD보다 낮은 복사 번호를 가졌다. 반대로, 표면에서 바이러스 RNA의 검출은 양성 샘플에서 바이러스의 감염성을 테스트해야 하기 때문에 접촉을 통한 전염위험을 직접적으로 의미하지는 않는다. 정교한 공급품또는 고도의 자격을 갖춘 인력의 가용성에 의해 제한되지 않는 환경의 신속한 선별은 표면이 바이러스 성 저수지를 구성하는지 여부를 평가하고 보다 직접적인 예방 및 봉쇄 노력을 하는 데 매우 중요합니다.
RT-LAMP는 제안된 검출 파이프라인에 적합한 최상의 방법으로 선택되었다. 그것은 나머지 억제제의 대부분에 매우 저항 하고 다른 RT-qPCR 방법으로 민감 하 고 특정 신속 하 고 저렴 한 방법 입증. SARS-CoV-2 전염병 동안 임상 설정에서 사용했기 때문에 RT-qPCR 키트의 가용성은 글로벌 수요에 의해 영향을 받았습니다. 더욱이, RT-qPCR 기술은 억제제에 저항하기 위하여 공식화된 그조차 - 효소 결합에 대한 억제제 경쟁을 감소시키기 위하여 그밖 일반적인 전략의 사용 후에도 시민 과학자의 파일럿 코호트에 의해 집합된 환경 견본에 포함된 물질에 민감했습니다49. 이러한 사실 인정은 COVID-19 환자에 의해 취급된 사탕에서 면봉 견본에 SARS-CoV-2를 검출하는 두 가지 방법을 비교하고 RT-LAMP15에의해 분석된 견본에 있는 25% 더 낮은 억제와 더불어 83% 결과 일치를 찾아낸 최근 연구 결과에 의해 확증됩니다. 또한, GITC-클로로폼 원유 추출은 RT-LAMP와 결합되어 RNA 키트 추출 및 RT-qPCR(재료 표)에 비해 시약 및 공급 비용을 42% 절감하였다.
이 방법을 사용하면 수천 개의 표면 면봉 샘플에 대한 높은 처리량 분석을 허용했습니다. 640개의 샘플을 나타내는 최대 80개의 풀은 RNA 추출에서 RT-LAMP에 의한 SARS-CoV-2 검출까지 2일 동안 처리되었습니다. 제안된 프로토콜은 반정성, 바이러스 RNA의 검출에 국한되고, 감염성 바이러스 입자의 존재를 나타내지 않는다. 추가 분석은 swabbed 표면에 존재하는 감염된 포미트에서 SARS-CoV-2의 전송의 리스크를 평가하기 위하여 요구됩니다.
이 연구는 전염성 질환으로 건강 비상 사태에 직면 했을 때 효과적인 워크플로우를 포함 하는 테스트 전략을 신속 하 게 설정 하는 프로토콜을 제시 합니다. 제안된 샘플링 프로토콜은 간단하고 가정에서 흔히 발견되는 소모품을 사용하며, 바이러스 검출 방법은 열사이클기 대신 수조와 같은 기본 실험실 환경에서 사용할 수 있는 장비에서 수행됩니다. RT-LAMP 시약의 비용은 RT-qPCR에 필요한 비용보다 현저히 낮으며 높은 글로벌 수요 시나리오에 덜 취약합니다. 이 연구는 미래의 전염병 발병과 글로벌 전염병에 환경 바이러스 성 저수지의 평가를위한 프레임 워크 역할을합니다.

SARS-CoV-2는 감염된개인1,2,3,4와직접 접촉하여 오염된 에어로졸및 물방울의 흡입을 통해 주로 전염되는 것으로 생각된다. 그러나, 글로벌 COVID-19 전염병의 초기 단계에서 SARS-CoV-2의 전송을 통제하기 위한 노력은 표면 소독, 손씻기 및 살균에 강하게 집중했습니다. 2020년 말까지 세계보건기구(WHO)5와 미국 질병통제예방센터(CDC)의 전송 지침은 감염된 사람과 가까운 접촉(<2m)에 있거나 에어로졸 생성 의료 절차가 있을 때 주로 공중 전염위험이 있다고 판단했습니다. 오염된 표면과의 접촉 또는 에어로졸화 된 포미트의 흡입 과 접촉 한 후 자가 접종은 SARS-CoV-2의 전송 경로로 아직 배제되지 않았습니다.
COVID-19 케이스는 공중 전송이 가능성이 보인다보고되었습니다 7,8. SARS-CoV-2 virions는 최대 8시간 동안 구리, 골판지 및 스테인리스 스틸에서 최대 24시간 동안, 최대 48h9의플라스틱에 전염성을 유지합니다. 유람선 선빈에서 SARS-CoV-2 RNA는 승객이7번출발한 지 17일 후에 검출되었습니다. 병원 및 대중 교통 시스템에서 공기 및 표면 샘플SARS-CoV-2 및 기타 코로나바이러스8,10, 11,12,13,14에대해 양성 반응을 보이고 있다. 무증상 및 중등/경미한 증상 COVID-19 환자에 의해 처리된 할로윈 사탕의 외부 포장에 수행된 연구는 손잡이에 의한 손 세척과 손비누로 사탕을 세척하는 조합으로 SARS-CoV-2 RNA를 임계값 수준15이하로 감소시키는 것으로 결론을 내렸다.
SARS-CoV-2 진단에 대한 여러 가지 방법은 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR)16,17,역전사 루프 매개 이소성 증폭(RT-LAMP)11,18,19,20,21, 및 CRISPR-Cas 기술 18, 19, 19, 20, 21, 및 CRISPR-Cas 기술18, 19,19, 19, 20, 21 및 CRISPR-Cas 기술 18, 19, 19, 20, 21 및 CRISPR-Cas 기술 18,19, 19, 19,20, 21, 및 CRISPR-Cas 기술18, 19, 19,20,21,및 CRISPR-Cas 기술 18, 19,293을기반으로 발표되었습니다. 대부분은 상당한 글로벌 수요기간 동안 공급이 부족한 RNA 추출 키트를 필요로 하며,바이러스(24)의환경 검진에는 거의 사용되지 않았다. RT-LAMP를 사용하여 SARS-CoV-2 RNA의 검출은 RT-qPCR을 사용하는 데 83% 이상의 일치하는 것으로 입증되었습니다. 또한 RT-LAMP는 RT-qPCR 15에 비해 결정적인 결과를25%감소시켰습니다.
RT-LAMP는 RNA템플릿(25)으로부터cDNA를 합성하기 위해 역실을 사용하는 간단한 기술이며, 이어서 일정한 온도(즉, 이더스피증폭)에서DNA를 합성하는 강한 가닥 변위 활성을 가진 DNA 중합체를 이룬다. 바이러스 게놈 검출의 높은 특이성은 표적 DNA의 6 개 또는 8개의 지구를 인식하는 4개 또는 6개의 프라이머를 사용하여 달성됩니다. 증폭은 내부 프라이머에서 시작되고 반 이중 가닥 DNA 구조를 산출합니다. 선행 가닥은 바깥 쪽 프라이머에 의해 증폭됩니다. 이러한 증폭은 역 프라이머에 대해 반복됩니다. 양쪽 끝에 내부 및 외부 프라이머는 증폭제품(26)및27에서루프를 형성하는 내부 역방향 자체 보완 부위를 가지고 있다. 비등형 가닥 변위에서 비동기 DNA 합성은 연속 중합이 반응 당 10부로 적은 신호를 증폭하는 증폭된 제품의다량(11,20,28)을생성한다. 색수정 RT-LAMP 믹스는 약하게 버퍼링되고 페놀 레드를 pH 표시기로 사용합니다. 중합체는 뉴클레오티드를 통합함에 따라 양성자를 방출하고, 충분한 양성자는 용액의 pH뿐만 아니라 분홍색에서 노란색11,20,28,29로색상을 변경합니다.
RT-LAMP는 완전히 갖춰진실험실(25)이 부족한 주변 의료 시설에서 모기 매개 질병의 검출을 위해 개발되었으며, 인간 면역결핍바이러스(30)와같은 다른 RNA 바이러스의 신속한 검출을 위해 개발되었다. WHO 정의에 따라 전염병 발병에서 가장 취약한 인구는 종종 충분한 경제적 자원과 탐지를 수행하기위한 적절한 장비가 부족합니다 (유엔 글로벌 공중 보건 의제). 현재 SARS-CoV-2 전염병에서는 RNA 추출 키트에 대한 의료급 면봉 및 시약과 같은 공급이 특히 비제조 국가에서 는 글로벌 수요를 충족할 수 없었습니다. 제안된 프로토콜은 구안디늄 틸오카네이트(GITC)기반의 원유 RNA 추출을 사용하여, 이는 효과적으로 콜드 체인 독립적 인 방식으로 RNA를 보존하고 샘플에서 억제제의 지속성을 현저히 감소시키는. 더욱이, GITC-클로로폼 추출 프로토콜은 DNA와 단백질로부터의 RNA 분리를 기반으로 하며, 그 다음에는 각각의 강수량이 뒤따르며, 대부분의 유전 물질을 회수할 수 있다. 이러한 장점은 위험을 적절하게 알리기 위한 조치를 취하면 화학 물질을 취급하는 시민 과학자의 잠재적 위험보다 큽니다.
제안된 워크플로우는 일반적인 용도의 재료 및 시약을 사용합니다. 그것은 기본, 종종 시골, 실험실 설정에서 사용할 수있는 장비가 필요합니다. 이러한 방법은 추출 키트로 처리할 수 없는 환경 샘플이나 샘플에서 발견되는 억제제에 대한 고도로 저항력이 뛰어나며 고정밀 열순환기의 필요성을 제거합니다. 이 연구는 가정과 도시 환경의 일반적으로 만지고 드물게 감염된 표면에 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을위한 파이프 라인을 제시한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

2020년 글로벌 전염병 중 중 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 지역 사회 전염을 제어하기 위해 대부분의 국가는 직접적인 인간 검사, 얼굴 덮개 및 표면 소독에 기반한 전략을 구현했습니다. 전송의 주요 경로는 에어로졸과 호흡 물방울을 포함한다는 가정하에, fomites에서 SARS-CoV-2를 검출하는 노력은 높은 보급의 의심 되는 위치 (예를 들어, 병원 병동, 유람선, 및 대량 운송 시스템)에 초점을 맞추고있다. 거의 청소되지 않는 도시 환경의 표면에 SARS-CoV-2의 존재를 조사하기 위해, 350 시민은 더 큰 샌디에고 카운티에서 입대했다. 이 시민 과학자들은 총 4,080개의 샘플을 수집했습니다. 샘플링 키트 배달 및 픽업을 모니터링하고 샘플 데이터를 수집하기 위해 온라인 플랫폼이 개발되었습니다. 샘플링 키트는 대부분 전염병 스트레스 매장에서 사용할 수 있는 소모품으로 제작되었습니다. 시료는 재발공급 부족에도 불구하고 쉽게 접근할 수 있는 시약을 사용하여 처리되었습니다. 사용된 방법은 환경 견본에 일반적으로 존재하는 억제제에 높게 민감하고 저항했습니다. 제안된 실험 설계 및 처리 방법은 다양한 표면 영역에서 샘플을 효과적으로 수집한 수많은 시민 과학자들을 참여시키는 데 성공했습니다. 여기에 설명된 워크플로우와 방법은 공중 보건에 관한 것이고 미래의 전염병에 위협이 되는 다른 바이러스에 대한 도시 환경을 조사하는 데 관련이 있습니다.

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Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

이 연구는 가스 펌프 핸들, 놀이터 및 ATM과 같은 도시 환경에서 거의 청소되지 않는 표면에서 SARS-CoV-2를 감지하는 새로운 워크플로우를 제공합니다. 전염병에서, 공급은 부족합니다. 우리는 기본 실험실 설정에서 사용할 수있는 쉽게 얻을 수있는 재료와 시약 및 장비를 사용합니다.우리는 콜드 체인없이 RNA를 보존하는 추출 방법과 억제제에 내성 검출 방법을 사용합니다. 이 프로토콜은 공중 보건의 관심사입니다. 그것은 미래의 글로벌 발발 도중 현재 COVID-19 전염병 및 그밖 전염하는 에이전트를 위한 환경 바이러스성 저수지의 평가를 위한 틀을 제공합니다.지역 및 소셜 미디어를 통해 발표 된 직접적이고 명확한 행동을 촉구하여 시민 과학자를 모집하십시오. 소셜 미디어 핸들을 만들어 소셜 미디어 콘텐츠에 주제를 연결합니다. SMP에 대한 링크를 생성하여 개인이 온라인 형식으로 지정된 생물 안전 관련 질문에 답하여 환경 샘플링 노력에 참여할 수 있도록 여러 언어로 탐색할 수 있도록 다국어 플러그인을 제공합니다.영어와 스페인어로 샘플링 섹션 그래픽 및 시청각 프로토콜을 포함합니다. 클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 지리 공간 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 사용하여 지리 공간 데이터를 시각화합니다. 중앙 집중식 저장, 처리 워크플로우 추적 및 물류 관리를 용이하게 하기 위해 SMP를 통해 LIMS에 제출된 데이터를 저장합니다.샘플 키트 ID, 샘플 ID, 날짜, 시간 및 글로벌 위치 지정 시스템 좌표와 같은 사전 로드 정보를 사용하여 데이터 형식 준수를 가능하게 하고 오류를 최소화합니다. 참가자에 대한 샘플 픽업 요청 링크를 포함하며, 모든 샘플을 수집한 후에사용할 수 있습니다. 마스크와 장갑, 샘플링 프로토콜 및 생물 안전 관련 정보와 같은 필요한 개인 보호 장비를 포함하여 모든 샘플링 소모품이 포함된 키트를 작성합니다.스와브는 1센티미터 정사각형 폴리에스테르 흡수제 면봉을 세제로 적시고 10센티미터 의 표면을 헤빙하여 가정과 도시 환경에서 거의 소독되지 않습니다. 이쑤시개에 의해, 구안디늄 티오야네이트의 200 마이크로 리터를 포함하는 미리 표지 된 튜브에 각 샘플을 잠수. 교차 오염을 방지하기 위해 제공된 마스크와 각 샘플 의 수집을 위한 새로운 장갑을 착용하십시오.샘플링을 마친 후 제공된 손 소독제를 사용하십시오. 튜브를 실험실로 운반할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 샘플이 실험실에 도착하면 영하 80도에서 보관하십시오.스크리닝 속도를 높이려면 풀에서 샘플을 처리합니다. 풀이 양성인 경우 각 샘플의 RNA를 독립적으로 추출합니다. 각 샘플링 키트의 샘플을 8개의 샘플 각각 50마이크로리터를 마이크로센심심분리기 튜브로 풀링하고 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 절약하여 두 개의 풀로 결합합니다.15초 동안 80마이크로리터의 클로로폼과 소용돌이를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 배양하십시오. 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 000배 G의 원심분리기.수성 층을 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기십시오. 나머지 인터페이스와 분홍색 액체를 영하 80도 냉동고에 보관하십시오. 이 분수는 DNA와 단백질을 포함합니다.구니디늄 티오시야네이트 계 RNA 원유 추출 프로토콜을 사용하여 회수된 수성 층으로부터 RNA를 추출한다. 파이펫팅 손실을 고려하여 10%의 초과 부피로 실온에서 RT-LAMP 반응 믹스를 준비합니다. 샘플 반응에 RNA 5마이크로리터와 RNA 5마이크로리터를 플러스 합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 마이크로리터에 첨가하여 스파이크 된 반응에 넣습니다.합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 마이크로리터를 음수 대조군에 양성 제어 및 5마이크로리터의 물을 첨가합니다. 잘 섞어서 반응을 줄입니다. 색색 관찰의 경우 음의 결과가 분홍색으로 표시되고 긍정적 인 결과가 노란색으로 표시됩니다.RT-LAMP 후 젤 전기 전도를 수행합니다. 샘플 수집 사이트의 분포는 여기에 표시됩니다. 키트의 대부분이 완료되었고 해당 데이터가 LIMS에 업로드되었습니다.100%의 주파수에서 검출의 한계는 반응의 25 마이크로리터 당 500 사본이었습니다. 색색 RT-LAMP에서, 양수 샘플은 8에서 5.5로 pH 이동으로 인해 분홍색에서 노란색으로 색상을 변경했습니다. 낮은 복사 번호에서, 샘플은 결과 사다리와 같은 패턴으로 긍정을 확인하기 위해 아가로즈 젤에 실행되었다.RT QPCR 방법은 환경 샘플로 테스트되었습니다. 모든 마스터 믹스는 양극 대조군의 낮은 카피 수 농도에서 억제제에 민감했다. 템플릿의 낮은 농도에서, 전통적인 RT PCR 방법은 거짓 긍정과 거짓 네거티브를 보여 주었다.마지막으로, 롤링 원 증폭이라는 기술은 표적 시퀀스의 소량을 검출했다. 그러나, RNA 템플릿이 없는 상태에서 프로브의 증폭을 보였다. 샘플링이 진정으로 해당 지역 사회의 모든 구성원의 노출 위험을 나타내도록 지역 사회의 모든 부문에 도달하는 행동 촉구를 발표하는 것이 중요합니다.이 프레임워크는 SARS-CoV-2 유전 물질을 검출합니다. 바이러스 성 생존가능성을 테스트하는 연구가 다음 단계입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

연구

생물학

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics : 수치과 구조 변경의 탐지는 모두 24 인간의 염색체로 동시에 소설 OctoChrome 생선 분석을 사용

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

당연히 환경에서 Magnetotactic 박테리아를 발생의 수집, 절연 및 강화

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

쥐의 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

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음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 준 metagenomic 분석

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

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모델 식물 애기장대 의 Thigmomorphogenesis의 연구를 위한 노동 절약 및 반복 가능한 터치 포스 신호 돌연변이 스크린 프로토콜

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...