Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Agradecemos aos investigadores do Instituto de Informações Virais (VII), Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin, e Dr. Jennifer Smith por tirarem o tempo para coletar inúmeras amostras. Agradecemos também ao Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre e Dr. Sarah Allard do departamento de Pediatria da Universidade de Medicina de San Diego Califórnia (UCSD) por facilitar controles positivos e feedback útil. Agradecemos a Stacey Carota (Faculdade de Ciências da SDSU) e Gina Spidel (SDSU) pelo apoio logístico e a Juan Rodríguez pelo design artístico e gráfico do protocolo amostral. Agradecemos a todos os participantes pelo empenho e dedicação a este projeto em tempos muito difíceis. Este trabalho foi apoiado por uma generosa doação do Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) e da National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Número de Prêmio: 2030479).

Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista detalhada de reagentes e suprimentos, incluindo números de catálogo, fabricante e custos correspondentes.
1. Amostragem do ambiente urbano
<ol><li>Divulgação cientista cidadã<ol><li>Recrute cientistas cidadãos usando um chamado direto e claro lançado através de mídias locais e sociais. Crie uma alça de mídia social (por exemplo, #swab4corona) para conectar o tópico através do conteúdo das mídias sociais.</li>
		<li>Crie uma conta de e-mail para comunicação direta entre a equipe do laboratório e cada cientista cidadão, gerenciada por uma pessoa fluente nas principais línguas da região de interesse (por exemplo, espanhol e inglês para o condado de San Diego).</li>
		<li>Construa uma plataforma segura de gerenciamento de amostras baseada na Web (SMP) para servir como banco de dados, um sistema de gerenciamento de informações laboratorial (LIMS) e para se comunicar com cientistas cidadãos. NOTA: O SMP fornece um local centralizado onde os usuários solicitam um kit, acessam protocolos de coleta de amostras, enviam metadados de amostra e solicitam uma coleta para kits de amostra concluídos.</li>
		<li>Crie um link para o SMP (por exemplo, https://demo.covidsample.org/)(Figura 1) para que os indivíduos se inscrevam para participar do esforço de amostragem ambiental, respondendo perguntas relacionadas à biossegurança especificadas de forma online.</li>
		<li>Acesso seguro ao SMP usando uma interface de programação de aplicativos de autenticação facilitada por um provedor de serviços de computador em nuvem. Dê aos usuários aprovados acesso ao SMP. NOTA: Consulte a literatura para obter uma descrição do protocolo OAuth 2.031 para autenticação e autorização. Ele fornece um processo de login sem atrito para voluntários cientistas cidadãos. Ele também permite que os usuários façaem login com uma conta existente, eliminando a necessidade de criar uma solução de login personalizada e gerenciar credenciais do usuário, o que economiza uma quantidade significativa de tempo e incentiva a participação. De acordo com relatórios recentes, o serviço de e-mail gratuito disponível para o provedor de serviços de computador em nuvem escolhido tem aproximadamente 1,5 bilhão de usuários de e-mail ativos mensais; exigir uma conta de e-mail deste provedor de serviços para participação não é considerado um fator desanimador.</li>
		<li>Explique o objetivo do estudo e considerações de biossegurança aos cientistas cidadãos do SMP antes de solicitarem seu primeiro kit. Forneça um plugin multilíngue para permitir a navegação em qualquer um dos idiomas disponíveis a partir de um serviço de tradução de máquina neural multilíngue facilitado por um provedor de serviços de computador em nuvem.</li>
		<li>Inclua na seção de amostragem protocolos gráficos e audiovisuais em inglês e espanhol.</li>
		<li>Atribua um identificador exclusivo a cada kit e projete a interface do usuário para utilizar botões vinculados ao Sample ID para agilizar o processo de entrada de dados (Figura 1A).</li>
		<li>Use um software de planejamento de rota de entrega com um aplicativo de dispositivo móvel para ser usado pelos motoristas para otimizar rotas de entrega/coleta e notificar os cientistas cidadãos dos tempos estimados precisos de chegada.</li>
		<li>Construa a plataforma LIMS em uma pilha de serviços web PHP e hospede-a em uma plataforma de hospedagem comercial (sistema operacional sugerido, software de servidor web e software de banco de dados são especificados na Tabela de Materiais).</li>
		<li>Forneça uma interface de aplicativo baseada na Web segura para permitir que o pessoal do laboratório gerencie dados de forma rápida e fácil no LIMS. Forneça visualização de dados usando uma interface de programação de aplicativos de mapeamento de dados facilitada por um provedor de serviços de computador em nuvem.</li>
		<li>Visualize dados geoespaciais usando uma interface de programação de aplicativos geoespacial facilitada por um provedor de serviços de computador em nuvem. Armazenar os dados enviados ao LIMS através do SMP para facilitar (1) o armazenamento centralizado dos dados do projeto; (2) rastreamento dos fluxos de trabalho de processamento de amostras/dados; e (3) gestão da logística de distribuição de kits de amostras para cientistas cidadãos.</li>
		<li>Garantir metadados enviados usando as melhores práticas (por exemplo, https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>As coordenadas de Pré-carga, como ID do Kit de Amostra, ID de amostra, data, hora e GPS (coletados automaticamente a partir de uma imagem do site) para permitir a conformidade do tipo de dados e minimizar o envio de dados errôneos ou ausentes pelo usuário(Figura 1B). Inclua os seguintes campos a serem manualmente e rapidamente (<1 min) preenchidos pelo cientista cidadão: data e hora da coleta, uma breve descrição do local e uma foto do local de amostragem.</li>
		<li>Higienize todos os dados carregados e valide para o tipo de dados. Por exemplo, valide os dados de imagem carregados pelos usuários para selecionar .jpg arquivos, renomeá-los com Sample ID para rápida associação com a amostra e armazenar imagens carregadas em um local seguro separado não acessível aos usuários.</li>
		<li>Ative a opção de solicitar a entrega e a coleta do kit quando todas as amostras (16) tiverem sido concluídas. Além disso, ative a opção de solicitar um novo kit a ser entregue no momento da retirada do anterior (Figura 1A). NOTA: Para voluntários que preferem uma plataforma não baseada na Web e para aqueles preocupados em divulgar sua localização gps (por exemplo, membros da comunidade preocupados com seu status migratório), os kits podem ser entregues em um local de reunião acordado e os voluntários solicitados a gravar uma versão por escrito da coleta de dados. Para comunicação entre o laboratório e cada cientista cidadão, tenha um membro bilíngue do projeto disponível para chamadas telefônicas e textos.</li>
	</ol></li>
	<li>Cotonete para Corona<ol>
<li>Identificar uma janela de tempo epidemiologicamente relevante para o esforço amostral.</li>
		<li>Construa um kit que contenha todos os suprimentos de amostragem, incluindo os equipamentos de proteção individual necessários (ou seja, máscara, luvas), um protocolo de amostragem e informações relevantes de biossegurança(Figura 2). Pré-rotule cada tubo com o identificador único atribuído (Sample ID).</li>
		<li>O swab raramente desinfetou superfícies expostas a fomites aerossolizadas em domicílios e no ambiente urbano.<ol>
<li>Use a máscara fornecida em público e um novo par de luvas para a coleta de cada amostra para evitar contaminação cruzada. Após o término da amostragem, use o desinfetante para as mãos fornecido.</li>
			<li>Molhe um cotonete absorvente de poliésterde 1 cm 2 (por exemplo, pastilhas de esfregão) com um detergente (por exemplo, sulfato de dodecyl de sódio de 0,5% (SDS)) para inativar o vírus interrompendo seu envelope e estabilizando o RNA nu induzindo o desdobramento de RNases32.</li>
			<li>Swab uma superfície de 10 cm2. Auxiliado por um palito, submerga completamente cada amostra no tubo pré-rotulado correspondente contendo 200 μL de solução de tiocianato de guanidinium (GITC). Armazene os tubos a 4 °C até serem transportados para o laboratório. Assim que as amostras chegarem ao laboratório, armazene-as a -80 °C. NOTA: O GITC é um irritante tóxico; evite o contato com a pele. Solução GITC é simples de preparar a partir de produtos químicos de laboratório comuns, para a receita ver33,34. Inativa o vírus, estabiliza o RNA desnaturando RNases34,35,36e estabiliza amostras à temperatura ambiente. O kit, no entanto, inclui blocos de gelo para manter as amostras frias sem a necessidade de usar geladeiras domésticas para armazenamento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Detecção de SARS-CoV-2
<ol><li>Isolamento total do RNA<ol>
<li>Superfícies desinfetante, equipamentos e pipettors com solução de sulfato de cobre de 2 mM e peróxido de hidrogênio de 3%; seguido por uma solução de 10% alvejante, 90 mM de bicarbonato de sódio, 5% SDS e 2,5% NaOH. Limpe bem com água destilada seguida de 75% de etanol. NOTA: Essas soluções são uma alternativa às soluções disponíveis comercialmente.</li>
		<li>Descongelar amostras no gelo. Amostras de vórtice por 2 minutos em velocidade média.</li>
		<li>Para aumentar a velocidade da triagem, processe as amostras em piscinas. Se um pool for positivo, extraia o RNA de cada amostra independentemente para encontrar a amostra/s positivo. Combine as amostras de cada kit amostral (16 total) em 2 piscinas de 8 amostras. NOTA: Ter 8 amostras por piscina significa que apenas 2 piscinas precisam ser processadas por kit. Se um pool for positivo, as amostras individuais ão reprocessadas para análise individual de RT-LAMP. Isso reduz o tempo, os custos e os reagentes.</li>
		<li>Piscina 50 μL de cada uma das 8 amostras em um tubo de microcentrífuga (volume total 400 μL); salvar a amostra restante a -80 °C. Adicione 0,2 volumes (80 μL) de clorofórmio, vórtice para 15 s e, em seguida, incubar por 20 min a 4 °C. Centrifugar a 13.000 × g por 20 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfira a camada aquosa (líquido claro) para um novo tubo de microcentrífuga. Armazenar a interface restante e o líquido rosa no congelador -80 °C; essas frações contêm DNA e proteínas33,36.</li>
		<li>Adicione um volume igual de isopropanol (~200 μL) e 2,6 μL de coprecipitante glicogênio (15 mg mL-1)37. Misture bem e incubar a -20 °C por pelo menos 1 h, seguido de 4 °C por 10 min para precipitar o RNA. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui incubando amostras a -20 °C durante a noite em vez de 1h.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 × g por 20 min a 4 °C. Remova o supernatante sem perturbar a pelota. Resuspenque a pelota em 50 μL de água tratada com dietilpiroto (DEPC) e adicione um volume igual (50 μL) de acetato de amônio sem RNase 5 M e 2,5 volumes (250 μl) de 100% de etanol7,38. NOTA: Íons de amônio inibem a quinase de polinucleotídeo se usado em um processo a jusante38. A mistura precipita o RNA ao deixar triphosfatos e oligossacarídeos desoxicomíno na solução38.</li>
		<li>Misture bem e incubar a -20 °C por pelo menos 1 h, seguido de 4 °C por 10 min para precipitar o RNA. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui incubando amostras a -20 °C durante a noite em vez de 1h.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 × g por 20 min a 4 °C. Lave a pelota com 1 mL de frio (-20 °C), recém-feito 75% de etanol. Centrifugar a 8.000 × g por 5 min a 4 °C. Remova o supernatante com uma pipeta P10 para evitar perturbar a pelota.</li>
		<li>Aeródromo secou a pelota por 10-15 min até que não haja etanol restante. Resuspenque a pelota em 50 μL de água tratada com DEPC, adicione 5 μL de 10x DNase tampão + 1μL de DNase (2 Unidades μL-1), e incubar a 37 °C por 30 min.</li>
		<li>Adicione 0,1 volumes (5,6 μL) de reagente de inativação DNase, incubar à temperatura ambiente por 5 minutos e misturar suavemente a cada minuto. Centrifugar a 13.000 × g por 2 min, e transferir supernante para um novo tubo (~50 μL). Coloque o tubo no gelo imediatamente durante o preparo das reações RT-qPCR ou RT-LAMP, ou armazene em um congelador de -20 °C. NOTA: Realize o isolamento do RNA em uma sala livre de amplicon para evitar contaminação por atropelamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa multiplex (RT-LAMP)<ol>
<li>Prepare uma solução de mix de primer 20X (Tabela 1) para cada conjunto de primers (Tabela 2). Prepare a mistura de reação RT-LAMP (Tabela 3) à temperatura ambiente com volume de 10% de excesso para explicar a perda de tubulação. NOTA: A mistura colorimétrica LAMP 2X master com uracil-DNA termolabile antártico-DNA glicosylase (UDG) impede a amplificação da contaminação do DNA de reações anteriores20,28.</li>
		<li>Vórtice e gire a mistura. Dispense 20 μL da mistura em cada tubo de reação: amostra, pico, controle positivoe controle negativo. Incubar as reações nos tubos à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que o UDG aja sobre uma possível contaminação por atropelamento.</li>
		<li>Adicione 5 μL de RNA à reação amostral, 5 μL de RNA + 2,5 μL (450 cópias) de RNA SARS-CoV-2 sintético à reação cravada, 2,5 μL (450 cópias) de RNA SARS-CoV-2 sintético à reação de controle positivo, e 5 μL de H2O à reação de controle negativo. Misture bem, e gire as reações; descongelar todo o RNA no gelo.</li>
		<li>Enquanto o termociclador, ou o banho de água, é aquecido a 65 °C, permita que todas as reações permaneçam à temperatura ambiente. O UDG será inativado a >50 °C. Coloque as reações no termociclador (use tampa de calor), incubar a 65 °C por 40 min e deixe as reações atingirem a temperatura ambiente (~22 °C por 5 min) ou esfrie no gelo por 1 min. Analise os resultados utilizando o recurso colorimétrico (observação simples) ou executando os produtos em um gel de agarose. NOTA: Embora o limite de detecção (LOD) seja de 10 cópias por reação, a frequência de detecção aumenta à medida que o número de cópia se aproxima de 500 cópias por reação(Figura 3A). Para observação colorimétrica, observe que um resultado negativo é indicado por rosa (pH = 8,8), enquanto um resultado positivo é indicado por amarelo (pH = 5) (Figura 3B). A opção colorimétrica evita a abertura dos tubos RT-LAMP após a amplificação, o que reduzirá o volume dos produtos RT-LAMP no ambiente de trabalho e a contaminação por transporte. Para eletroforese de gel, prepare um gel de 1,5% de agarose com mancha de gel de DNA 1X em 0,5% Tampão Tris/Borate/EDTA (TBE). Carregar 25 μL da reação + 5 μL de corante de carregamento 6X em cada poço. Execute o gel a 100 V por 60 min. Um marcador molecular não é necessário, pois amostras positivas mostram um padrão de escada(Figura 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Todos os autores declaram que não existem interesses concorrentes.

Engajamento de cientistas cidadãos. Cientistas cidadãos foram recrutados para limpar superfícies em todo o condado de San Diego para amostrar e detectar a presença de SARS-CoV-2 no ambiente urbano. A maioria dos kits de amostragem entregues (70%) foram devolvidas ao laboratório, e dessas, quase todas as amostras foram completas (91%) (Figura 3A, B e Tabela 4). Os voluntários poderiam facilmente solicitar a entrega/coleta de kits através da plataforma baseada na Web, e o software de planejamento de rotas de entrega notificou os cientistas cidadãos dos tempos estimados de chegada, ambos provavelmente fatores significativos para o sucesso observado. O tempo médio de quando o kit foi entregue ao cientista cidadão para quando foi devolvido ao laboratório foi de 8 dias, com mediana de 3 dias e intervalo de 1 a 64 dias (Figura 3A e Tabela 4). Lembretes mais frequentes para os voluntários provavelmente reduziriam esse tempo de atraso.
A plataforma de coleta de dados foi usada com sucesso pela grande maioria dos usuários (73%) (Tabela 4). Embora os esforços dos cientistas cidadãos não tenham sido medidos, testes de campo mostraram que a plataforma de coleta de dados reduziu significativamente o esforço e o tempo necessários para completar adequadamente a coleta de amostras. Assim, reduzir a quantidade de escrituração incentivou o engajamento dos cientistas cidadãos. A plataforma baseada na Web pretendia superar as limitações demográficas, fornecendo um serviço multilíngue de tradução de máquinas neurais e fornecendo protocolos gráficos e audiovisuais em inglês e espanhol. Isso só foi parcialmente bem sucedido, pois menos amostras foram coletadas tanto da Baía do Sul quanto do Condado do Norte, onde a maioria da população hispânica/latina do condado reside45. Essas áreas também abrigavam 63% (1.700 casos por 100.000) do total de casos de COVID-19 no condado de San Diego com a maior prevalência da doença46 e taxa de internações (62%)47,48. Embora a maioria das amostras tenha vindo do Condado Central, um número representativo foi coletado dos distritos mais impactados pelo COVID-19 e apenas uma pequena fração das amostras foi positiva, o que sugere que os reservatórios superficiais de SARS-CoV-2 no ambiente urbano são relativamente raros.
Processamento de amostras. Amostras de amostras foram molhadas com SDS, que inativaram o vírus interrompendo seu envelope e estabilizando o RNA nu desdobrando RNases32. Convenientemente durante a coleta, o detergente no cotonete limpou a superfície amostrada. Amostras ambientais geralmente contêm quantidades muito pequenas de RNA. Para maximizar a recuperação, o isolamento do RNA foi realizado usando um método de extração bruta baseado em COLUNAs, sem colunas. O GITC, um agente chaotrópico forte, interrompe as ligações de hidrogênio que mantêm a dobra de proteínas (ou seja, efeito hidrofóbico). Esta ação resulta na inativação de partículas virais, e o RNA permanece estável devido à inibição de RNAses34,35,36. A solução GITC manteve a estabilidade das amostras de RNA sem considerações rigorosas da cadeia fria, o que permitiu aos cidadãos manter as amostras à temperatura ambiente se um freezer para as bolsas de gelo fornecidas não estivesse disponível. Para reduzir o risco potencial que este reagente representa quando ocorre contato direto da pele ou mucosa, os cidadãos foram informados desses riscos pela inclusão de uma folha de dados de segurança material fornecida no kit e um selo de advertência foi colocado na caixa contendo os tubos.
O método bruto de extração gitc-clorofórmio auxiliou na recuperação de traços de RNA dos cotonetes, e como mostrado pela amplificação de amostras cravadas, os inibidores raramente persistiam nas amostras após a extração. As amostras, que foram negativas para SARS-CoV-2 e não mostraram inibição de LÂMPADA-RT, representaram verdadeiros negativos ou apresentaram um número de cópia menor do que o LOD em 100% de frequência. Por outro lado, a detecção de RNA viral em uma superfície não implica diretamente o risco de transmissão através do contato, pois a infectividade do vírus a partir de amostras positivas precisa ser testada. A triagem rápida do ambiente, não limitada pela disponibilidade de suprimentos sofisticados ou pessoal altamente qualificado, é crucial para avaliar se as superfícies constituem um reservatório viral e para melhor direcionar os esforços de prevenção e contenção.
O RT-LAMP foi selecionado para ser o melhor método adequado para o pipeline de detecção proposto. Provou ser um método rápido e barato que era altamente resistente à maioria dos inibidores restantes e tão sensível e específico quanto outros métodos RT-qPCR. Devido ao seu uso em ambientes clínicos durante a pandemia SARS-CoV-2, a disponibilidade de kits RT-qPCR foi impactada pela demanda global. Além disso, as técnicas de RT-qPCR — mesmo aquelas formuladas para resistir aos inibidores — eram sensíveis às substâncias contidas nas amostras ambientais coletadas por uma coorte piloto de cientistas cidadãos, mesmo após o uso de outras estratégias comuns para reduzir a concorrência inibidora para a ligação enzimático49. Esses achados são corroborados por um estudo recente que comparou ambos os métodos para detectar SARS-CoV-2 em amostras de swab de doces manuseadas por pacientes COVID-19 e encontraram mais de 83% de concordância de resultados, com inibição 25% menor em amostras analisadas pela RT-LAMP15. Além disso, a extração de petróleo bruto GITC-clorofórmio, juntamente com a RT-LAMP, reduziu o custo dos reagentes e suprimentos em 42% em comparação com a extração do kit RNA e RT-qPCR (Tabela de Materiais).
Este método permitiu a análise de alto rendimento de milhares de amostras de swab de superfície. Até 80 piscinas, representando 640 amostras, foram processadas em 2 dias desde a extração de RNA até a detecção de SARS-CoV-2 pela RT-LAMP. O protocolo proposto é semiquantitativo, limitado à detecção de RNA viral, e não indica a presença de partículas virais infecciosas. É necessária uma análise mais aprofundada para avaliar o risco de transmissão de SARS-CoV-2 de fomitas infectadas presentes nas superfícies limpas.
Este estudo apresenta um protocolo para configurar rapidamente uma estratégia de teste que inclua um fluxo de trabalho eficaz ao enfrentar uma emergência de saúde com uma doença transmissível. O protocolo de amostragem proposto é simples e utiliza suprimentos comumente encontrados em domicílios, e o método de detecção de viral é realizado em equipamentos disponíveis em ambientes básicos de laboratório, como um banho de água em vez de um termciclista. Os custos dos reagentes RT-LAMP são significativamente menores do que os necessários para o RT-qPCR e menos suscetíveis a cenários de alta demanda global. Este estudo serve como um marco para a avaliação de reservatórios virais ambientais em futuros surtos epidêmicos e pandemias globais.

Acredita-se que o SARS-CoV-2 seja transmitido principalmente através da inalação de aerossóis contaminados e gotículas de contato direto com indivíduos infectados1,2,3,4. No entanto, durante as fases iniciais da pandemia GLOBAL COVID-19, os esforços para controlar a transmissão do SARS-CoV-2 se concentraram fortemente na desinfecção de superfícies, lavagem das mãos e higienização. Até o final de 2020, as diretrizes de transmissão da Organização Mundial da Saúde (OMS)5 e dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC)6 consideraram a transmissão aérea um perigo principalmente quando em contato próximo (<2 m) com uma pessoa infectada ou na presença de procedimentos médicos geradores de aerossol. A auto-inoculação após o contato com superfícies contaminadas ou inalação de fomites aerossolizadas ainda não foram descartadas como uma rota de transmissão de SARS-CoV-2.
Os casos COVID-19 foram relatados onde a transmissão aérea parece improvável7,8. Os virions SARS-CoV-2 permanecem infecciosos em cobre por até 8h, em papelão e aço inoxidável por até 24 h, e em plástico por até 48 h9. Nas cabines de navios de cruzeiro, o SARS-CoV-2 RNA foi detectado 17 dias após os passageiros terem partido7. Amostras de ar e superfície de hospitais e sistemas de transporte coletivo deram positivo para SARS-CoV-2 e outros coronavírus8,10,11,12,13,14. Um estudo realizado na embalagem externa de doces de Halloween manuseados por pacientes assintomáticos e moderados/levemente sintomáticos COVID-19, concluiu que a combinação de lavagem das mãos pelo manipulador e lavagem dos doces com sabão manual reduziu sars-cov-2 RNA para níveis inferioresa 15.
Vários métodos para diagnóstico sars-cov-2 foram publicados com base na reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR)16,17, amplificação isotéria mediada por loop reverso (RT-LAMP)11,18,19,20,21, e tecnologias CRISPR-Cas18,19,22,23. A maioria exige kits de extração de RNA que muitas vezes estão em escassez durante períodos de demanda global significativa, e muito poucos têm sido usados para a triagem ambiental do vírus24. A detecção de RNA SARS-CoV-2 usando RT-LAMP demonstrou ser mais de 83% concordante com o uso de RT-qPCR. Além disso, o RT-LAMP resultou em redução de 25% nos resultados inconclusivos em comparação com o RT-qPCR15.
RT-LAMP é uma técnica simples que usa uma transcriptase reversa para sintetizar cDNA a partir de um modelo RNA25, seguido por uma polimerase de DNA com forte atividade de deslocamento de fios que sintetiza o DNA em temperatura constante (ou seja, amplificação isotemal)26. A maior especificidade da detecção do genoma viral é alcançada usando quatro ou seis primers que reconhecem seis ou oito regiões do DNA alvo. A amplificação é iniciada a partir de uma cartilha interna e produz uma estrutura de DNA semi-duplamente encalhada. A linha principal é então amplificada por uma cartilha externa. Essas amplificações são repetidas para os primers invertidos. Primers internos e externos em ambos os lados possuem um site interno reverso auto-complementar que forma um loop no produto de amplificação26,27. No deslocamento isoteérmico da vertente, a síntese de DNA assíncrono gera altas quantidades de produto amplificado onde a polimerização contínua amplifica o sinal de apenas 10 cópias por reação11,20,28. A mistura RT-LAMP colorimétrica é fracamente tamponada e usa o vermelho fenol como indicador de pH. Como a polimerase incorpora um nucleotídeo, ele libera um próton, e prótons suficientes mudarão o pH da solução, bem como sua cor de rosa para amarelo11,20,28,29.
O RT-LAMP foi desenvolvido para a detecção de doenças transmitidas por mosquitos em unidades de saúde periféricas que não possuem laboratórios totalmente equipados25 e para a detecção rápida de outros vírus de RNA, como o vírus da imunodeficiência humana30. As populações mais vulneráveis em surtos epidêmicos — de acordo com a definição da OMS — muitas vezes não têm recursos econômicos suficientes e equipamentos apropriados para realizar a detecção (Agenda Global de Saúde Pública das Nações Unidas). Na atual pandemia SARS-CoV-2, os suprimentos como cotonetes de grau médico e reagentes para kits de extração de RNA não foram capazes de atender à demanda global, especialmente em países não manufaturados. O protocolo proposto utilizou uma extração de RNA bruta baseada em guanidinium (GITC), que efetivamente preservou o RNA de forma independente da cadeia fria e reduziu significativamente a persistência dos inibidores da amostra. Além disso, o protocolo de extração gitc-clorofórmio baseia-se na separação do RNA do DNA e proteínas seguida pela respectiva precipitação, permitindo a recuperação da maior parte do material genético. Essas vantagens superam os perigos potenciais dos cientistas cidadãos que lidam com o produto químico se forem tomadas medidas para informá-los adequadamente dos riscos.
O fluxo de trabalho proposto utiliza materiais e reagentes de uso geral. Requer equipamentos disponíveis em ambientes básicos, muitas vezes rurais, laboratoriais. Esses métodos são baratos, altamente resistentes a inibidores frequentemente encontrados em amostras ambientais ou amostras que não podem ser processadas com kits de extração, e eliminam a necessidade de um termociclador de alta precisão. Este estudo apresenta um pipeline para amostragem e detecção de SARS-CoV-2 de reservatórios ambientais em superfícies comumente tocadas e raramente desinfetadas das residências e do ambiente urbano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

Para controlar a transmissão comunitária da síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) durante a pandemia global de 2020, a maioria dos países implementou estratégias baseadas em testes humanos diretos, cobertura facial e desinfecção da superfície. Sob o pressuposto de que a principal rota de transmissão inclui aerossóis e gotículas respiratórias, os esforços para detectar SARS-CoV-2 em fomites se concentraram em locais suspeitos de alta prevalência (por exemplo, enfermarias hospitalares, navios de cruzeiro e sistemas de transporte de massa). Para investigar a presença de SARS-CoV-2 em superfícies no ambiente urbano que raramente são limpas e raramente desinfetadas, 350 cidadãos foram alistados do grande condado de San Diego. No total, esses cientistas cidadãos coletaram 4.080 amostras. Uma plataforma online foi desenvolvida para monitorar a entrega e coleta do kit de amostragem, bem como para coletar dados amostrais. Os kits de amostragem foram construídos principalmente a partir de suprimentos disponíveis em lojas com estresse pandêmico. As amostras foram processadas com reagentes de fácil acesso, apesar da recorrente escassez de oferta. Os métodos utilizados foram altamente sensíveis e resistentes aos inibidores comumente presentes em amostras ambientais. Os métodos experimentais de design e processamento propostos foram bem sucedidos em envolver numerosos cientistas cidadãos que efetivamente coletaram amostras de diversas áreas de superfície. O fluxo de trabalho e os métodos aqui descritos são relevantes para o levantamento do ambiente urbano para outros vírus, que são de interesse da saúde pública e representam uma ameaça para futuras pandemias.

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Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Um projeto de ciência cidadã foi projetado para recrutar residentes de San Diego para coletar amostras ambientais para sars-cov-2. Uma plataforma multilíngue baseada na Web foi criada para envio de dados usando uma interface de dispositivo móvel fácil de usar. Um sistema de gerenciamento de informações laboratorial facilitou a coleta de milhares de amostras geograficamente diversas com rastreamento de resultados em tempo real.

Limpando o Ambiente Urbano - Um Pipeline para Amostragem e Detecção de SARS-CoV-2 de Reservatórios Ambientais

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Este estudo apresenta um novo fluxo de trabalho para detectar SARS-CoV-2 em superfícies raramente limpas no ambiente urbano, como alças de bomba de gás, playgrounds e caixas eletrônicos. Em uma pandemia, os suprimentos são escassos. Utilizamos materiais e reagentes facilmente obtidos e equipamentos disponíveis em ambientes básicos de laboratório.Usamos um método de extração que preserva o RNA sem uma cadeia fria, e um método de detecção resistente aos inibidores. Este protocolo é de interesse da saúde pública. Fornece uma estrutura para a avaliação dos reservatórios virais ambientais para a atual pandemia COVID-19 e outros agentes infecciosos durante futuros surtos globais.Recrute cientistas cidadãos usando uma chamada direta e clara para a ação liberada através de mídias locais e sociais. Crie uma alça de mídia social para conectar o assunto através do conteúdo das mídias sociais. Crie um link para o SMP, fornecendo um plug-in multilíngue para permitir a navegação em vários idiomas para que os indivíduos se inscrevam para participar do esforço de amostragem ambiental, respondendo perguntas relacionadas à biossegurança especificadas de forma online.Inclua na seção de amostragem protocolos gráficos e audiovisuais em inglês e espanhol. Visualize dados geoespaciais usando uma interface de programação de aplicativos geoespacial facilitada por um provedor de serviços de computador em nuvem. Armazene os dados enviados ao LIMS através do SMP para facilitar o armazenamento centralizado, o acompanhamento dos fluxos de trabalho de processamento e o gerenciamento da logística.Informações de pré-carga, como ID do kit de amostra, ID de amostra, data, hora e coordenadas do sistema de posicionamento global para permitir a conformidade do tipo de dados e minimizar o erro. Inclua um link de solicitação de coleta de amostras para os participantes, que eles podem usar depois de coletar todas as amostras. Construa um kit que contenha todos os suprimentos de amostragem, incluindo os equipamentos de proteção individual necessários, como máscara e luvas, um protocolo de amostragem e informações relevantes de biossegurança.Swab raramente desinfetou superfícies em domicílios e no ambiente urbano, molhando um cotonete absorvente de poliéster quadrado de um centímetro quadrado com um detergente e limpando uma superfície de 10 centímetros ao quadrado. Auxiliado por um palito, submergir cada amostra no tubo pré-rotulado contendo 200 microliters de tiocianato de guanidinium. Use a máscara fornecida e um novo par de luvas para a coleta de cada amostra para evitar contaminação cruzada.Após o término da amostragem, use o desinfetante para as mãos fornecido. Armazene os tubos a quatro graus Celsius até que sejam transportados para o laboratório. Uma vez que as amostras chegam ao laboratório, armazene-as a menos 80 graus Celsius.Para aumentar a velocidade da triagem, processe as amostras em piscinas. Se uma piscina for positiva, extraia o RNA de cada amostra de forma independente. Combine as amostras de cada kit de amostragem em duas piscinas, agrupando 50 microlitadores de cada uma das oito amostras em um tubo de microcentrifuuge e salvando as amostras restantes a menos 80 graus Celsius.Adicione 80 microliters de clorofórmio e vórtice por 15 segundos. Em seguida, incubar por 20 minutos a quatro graus Celsius. Centrífuga a 13.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius.Transfira a camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga. Armazene a interface restante e o líquido rosa no congelador de menos 80 graus Celsius. Estas frações contêm DNA e proteínas.Extrair RNA da camada aquosa recuperada usando um protocolo de extração bruta de RNA à base de guanidinium. Prepare a mistura de reação RT-LAMP à temperatura ambiente com volume de 10% em excesso para explicar a perda de tubulação. Adicione cinco microliters de RNA à reação amostral e cinco microliters de RNA mais 2,5 microliters de RNA SARS-CoV-2 sintéticos à reação cravada.Adicione 2,5 microliters de RNA SARS-CoV-2 sintéticos ao controle positivo e cinco microliters de água ao controle negativo. Misture bem e gire as reações. Para observação colorimétrica, um resultado negativo é indicado pelo rosa e um resultado positivo é indicado pelo amarelo.Depois de RT-LAMP, realize a eletroforese de gel. A distribuição dos locais de coleta de amostras é mostrada aqui. A maioria dos kits estava completa, e os dados correspondentes foram enviados para o LIMS.O limite de detecção em uma frequência de 100% foi de 500 cópias por 25 microliters de reação. Na RT-LAMP colorimétrica, as amostras positivas mudaram de cor de rosa para amarelo devido a uma mudança de pH de oito para 5,5. Em números baixos de cópia, as amostras foram executadas em um gel de agarose para confirmar os positivos com o padrão resultante da escada.Os métodos RT QPCR foram testados com amostras ambientais. Todas as misturas mestras eram sensíveis aos inibidores em baixas concentrações numérias de cópia do controle positivo. Em baixas concentrações do modelo, os métodos tradicionais de RT PCR mostraram falsos positivos e falsos negativos.Por fim, uma técnica chamada amplificação do círculo de rolamento detectou pequenas quantidades da sequência de destino. No entanto, mostrou amplificação da sonda na ausência de um modelo de RNA. É fundamental lançar um chamado à ação que atinja todos os setores da comunidade para que a amostragem represente verdadeiramente o risco de exposição de todos os membros dessa comunidade.Esta estrutura detecta material genético SARS-CoV-2. Estudos para testar a viabilidade viral são o próximo passo.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biologia

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Produção de Microarrays Tecido, de coloração imuno-histoquímica e de digitalização Dentro do Atlas proteína humana

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Isolamento, coleta e Enriquecimento de bactérias naturais magnetotáticas do Meio Ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Células de mamíferos autonomamente bioluminescentes para monitoramento contínuo e em tempo real de citotoxicidade

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic análise de Salmonella de alimentos e amostras ambientais

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Um trabalho-economia e repetível Touch-Force sinalização mutante Screen Protocol para o estudo de Thigmomorphogenesis de uma planta modelo Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...