Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Мы благодарим исследователей Института вирусной информации (VII), доктора Анку М. Сегалл, Уиллоу Сегалл, Патрисию Л. Роуэр, Гэри Роуэра, Кэри Л. Роуэра, Магду Сильвию Пинетту, Элизабет Круз Кано, доктора Грегори Питерса, доктора Стюарта А. Сандина и доктора Дженнифер Смит за то, что они нашли время для сбора многочисленных образцов. Мы также благодарим д-ра Роба Найта, д-ра Джека Гилберта, д-ра Педро Балда-Ферре и д-ра Сару Аллард из отделения педиатрии Медицинского факультета Университета Сан-Диего, Калифорния (UCSD) за содействие положительному контролю и полезную обратную связь. Мы благодарим Стейси Кароту (SDSU College of Sciences) и Джину Спидель (SDSU) за материально-техническую поддержку и Хуана Родригеса за художественное и графическое оформление протокола отбора проб. Мы благодарим всех участников за их приверженность и преданность этому проекту в очень трудные времена. Эта работа была поддержана щедрым пожертвованием от доктора Джо Энн Лейн (Колледж наук SDSU) и гранта Национального научного фонда RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 (номер награды: 2030479).

Все авторы заявляют, что конкурирующих интересов не существует.

Участие гражданского ученого. Гражданские ученые были привлечены для мазка поверхностей по всему округу Сан-Диего, чтобы взять пробы и обнаружить присутствие SARS-CoV-2 в городской среде. Большинство поставляемых комплектов для отбора проб (70%) были возвращены в лабораторию, и из них почти все образцы были полными (91%) (Рисунок 3А,В и Таблица 4). Добровольцы могли легко запросить доставку / получение комплекта через веб-платформу, а программное обеспечение для планирования маршрута доставки уведомляло гражданских ученых о предполагаемом времени прибытия, что, вероятно, является значительным фактором для наблюдаемого успеха. Среднее время с момента доставки комплекта гражданскому ученому до момента его возвращения в лабораторию составляло 8 дней, со средним значением 3 дня и диапазоном 1-64 дня (рисунок 3А и таблица 4). Более частые напоминания добровольцам, вероятно, сократят это время задержки.
Платформой сбора данных успешно пользовалось подавляющее большинство пользователей (73%) (Таблица 4). Хотя усилия гражданских ученых не были измерены, полевые испытания показали, что платформа сбора данных значительно сократила усилия и время, необходимые для надлежащего завершения сбора образцов. Таким образом, сокращение объема бухгалтерского учета стимулировало участие гражданских ученых. Веб-платформа предназначена для преодоления демографических ограничений путем предоставления многоязычной службы нейронного машинного перевода и предоставления графических и аудиовизуальных протоколов на английском и испанском языках. Это было лишь частично успешным, поскольку было собрано меньше образцов как из Южного залива, так и из Северного округа, где проживает большая часть испаноязычного / латиноамериканского населения округа- 45 человек. В этих районах также зарегистрировано 63% (1 700 случаев на 100 000) от общего числа случаев COVID-19 в округе Сан-Диего с самой высокой распространенностью заболевания46 и уровнем госпитализаций (62%)47,48. Хотя большинство образцов поступило из Центрального округа, репрезентативное число было собрано из районов, наиболее пострадавших от COVID-19, и только небольшая часть образцов была положительной, что говорит о том, что поверхностные резервуары SARS-CoV-2 в городских условиях относительно редки.
Обработка образцов. Мазки для отбора проб смачивали SDS, который инактивировал вирус, нарушая его оболочку, и стабилизировал голую РНК путем развертывания RNases32. Удобно во время сбора моющее средство в тампоне очищало отобранную поверхность. Образцы окружающей среды часто содержат очень малые количества РНК. Чтобы максимизировать восстановление, выделение РНК было выполнено с использованием метода экстракции сырой экстракции на основе GITC без колонн. GITC, сильный хаотропный агент, разрушает водородные связи, которые поддерживают сворачивание белка (т. Е. Гидрофобный эффект). Это действие приводит к инактивации вирусных частиц, и РНК остается стабильной за счет ингибирования RNAses34,35,36. Решение GITC поддерживало стабильность образцов РНК без строгих соображений холодовой цепи, что позволяло гражданам поддерживать образцы при комнатной температуре, если морозильная камера для предоставленных пакетов со льдом была недоступна. Чтобы уменьшить потенциальную опасность, которую этот реагент представляет при прямом контакте с кожей или слизистой оболочкой, граждане были осведомлены об этих рисках путем включения паспорта безопасности материала, предоставленного в комплект, и предупреждающего уплотнения было помещено в коробку, содержащую трубки.
Сырой метод экстракции GITC-хлороформа помог восстановить следы РНК из тампонов, и, как показало усиление шипованных образцов, ингибиторы редко сохранялись в образцах после экстракции. Образцы, которые были отрицательными на SARS-CoV-2 и не показали ингибирования RT-LAMP, представляли собой истинные отрицательные результаты или имели более низкое число копий, чем LOD на 100% частоте. И наоборот, обнаружение вирусной РНК на поверхности напрямую не подразумевает риск передачи через контакт, поскольку необходимо проверить инфекционность вируса из положительных образцов. Оперативный скрининг окружающей среды, не ограничиваемый наличием современных материалов или высококвалифицированного персонала, имеет решающее значение для оценки того, являются ли поверхности вирусным резервуаром, и для более целенаправленных усилий по профилактике и сдерживанию.
RT-LAMP был выбран в качестве наилучшего метода, подходящего для предлагаемого трубопровода обнаружения. Это оказалось быстрым и недорогим методом, который был высокоустойчив к большинству оставшихся ингибиторов и столь же чувствителен и специфичн, как и другие методы RT-qPCR. Из-за их использования в клинических условиях во время пандемии SARS-CoV-2 на доступность наборов RT-qPCR повлиял мировой спрос. Более того, методы RT-qPCR — даже те, которые были разработаны для сопротивления ингибиторам — были чувствительны к веществам, содержащимся в образцах окружающей среды, собранных пилотной когортой гражданских ученых, даже после использования других общих стратегий для снижения конкуренции ингибиторов за связывание ферментов49. Эти результаты подтверждаются недавним исследованием, в котором сравнивались оба метода обнаружения SARS-CoV-2 на образцах мазков из конфет, обработанных пациентами с COVID-19, и было обнаружено более 83% конкордантности результатов, с 25% более низким ингибированием в образцах, проанализированных RT-LAMP15. Кроме того, экстракция сырой нефти GITC-хлороформа в сочетании с RT-LAMP снизила стоимость реагентов и поставок на 42% по сравнению с экстракцией набора РНК и RT-qPCR (Таблица материалов).
Этот метод позволил пролить высокопроизводительный анализ тысяч образцов поверхностного тампона. До 80 пулов, представляющих 640 образцов, были обработаны за 2 дня от экстракции РНК до обнаружения SARS-CoV-2 с помощью RT-LAMP. Предлагаемый протокол является полуквалифициативным, ограничивается обнаружением вирусной РНК, и не указывает на наличие инфекционных вирусных частиц. Необходим дальнейший анализ для оценки риска передачи SARS-CoV-2 от инфицированных фомитов, присутствующих на мазаемых поверхностях.
В этом исследовании представлен протокол для быстрой настройки стратегии тестирования, которая включает в себя эффективный рабочий процесс при столкновении с чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения с инфекционным заболеванием. Предлагаемый протокол отбора проб прост и использует расходные материалы, обычно встречающиеся в домашних хозяйствах, а метод обнаружения вируса осуществляется на оборудовании, доступном в основных лабораторных условиях, таких как водяная баня вместо термоциклера. Затраты на реагенты RT-LAMP значительно ниже, чем те, которые необходимы для RT-qPCR, и менее восприимчивы к сценариям высокого глобального спроса. Это исследование служит основой для оценки экологических вирусных резервуаров в будущих эпидемических вспышках и глобальных пандемиях.

Считается, что SARS-CoV-2 в основном передается при вдыхании загрязненных аэрозолей и капель при прямом контакте с инфицированными лицами1,2,3,4. Однако на начальных этапах глобальной пандемии COVID-19 усилия по борьбе с передачей SARS-CoV-2 были сосредоточены на дезинфекции поверхностей, мытье рук и санитарной обработке. К концу 2020 года руководящие принципы по передаче инфекции Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)5 и Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC)6 считали передачу инфекции воздушно-капельным путем опасной главным образом при тесном контакте (<2 м) с инфицированным человеком или в присутствии аэрозольных медицинских процедур. Самопрививка после контакта с загрязненными поверхностями или вдыхания аэрозольных фомитов еще не исключена в качестве пути передачи SARS-CoV-2.
Были зарегистрированы случаи COVID-19, когда передача по воздуху кажется маловероятной7,8. Вирионы SARS-CoV-2 остаются заразными на меди до 8 ч, на картоне и нержавеющей стали до 24 ч, а на пластике до 48 ч9. В каютах круизных судов РНК SARS-CoV-2 была обнаружена через 17 дней после того, как пассажиры вылетеличерез 7. Пробы воздуха и поверхности из больниц и систем общественного транспорта дали положительный результат на SARS-CoV-2 и другие коронавирусы8,10,11,12,13,14. Исследование, проведенное на внешней упаковке конфет на Хэллоуин, обработанных бессимптомными и умеренными / умеренно симптоматическими пациентами с COVID-19, показало, что сочетание мытья рук обработчиком и мытья конфет с мылом для рук снижает РНК SARS-CoV-2 ниже пороговых уровней15.
Опубликовано несколько методов диагностики SARS-CoV-2 наосновеполимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR)16,17,петлево-опосредоопосредоования с обратной транскрипцией изотермической амплификации (RT-LAMP)11, 18, 19,20, 21и CRISPR-Cas18,19,22,23. Большинство из них нуждаются в наборах для экстракции РНК, которые часто находятся в дефиците в периоды значительного глобального спроса, и очень немногие из них использовались для экологического скрининга вируса24. Было продемонстрировано, что обнаружение РНК SARS-CoV-2 с использованием RT-LAMP более чем на 83% согласуется с использованием RT-qPCR. Кроме того, RT-LAMP привел к снижению неубедительных результатов на 25% по сравнению с RT-qPCR15.
RT-LAMP представляет собой простую технику, которая использует обратную транскриптазу для синтеза кДНК из шаблонаРНК 25,за которой следует ДНК-полимераза с сильной активностью смещения нитей, которая синтезирует ДНК при постоянной температуре (т.е. изотермическая амплификация)26. Более высокая специфичность обнаружения вирусного генома достигается за счет использования четырех или шести праймеров, которые распознают шесть или восемь областей целевой ДНК. Амплификация инициируется из внутреннего праймера и дает полудвоцепочечную структуру ДНК. Затем ведущая нить усиливается внешней грунтовой. Эти усиления повторяются для обратных праймеров. Внутренние и внешние грунтовки на любом конце имеют внутренний обратный саморепломплементарный участок, образующий петлю в продукте усиления26,27. При изотермическом смещении нитей асинхронный синтез ДНК генерирует большие количества амплифицированного продукта, где непрерывная полимеризация усиливает сигнал всего лишь 10 копий на реакцию11,20,28. Колориметрическая смесь RT-LAMP слабо буферизована и использует фенол-красный в качестве индикатора pH. Поскольку полимераза включает нуклеотид, она высвобождает протон, и достаточное количество протонов изменит рН раствора, а также его цвет с розового на желтый11,20,28,29.
RT-LAMP был разработан для выявления заболеваний, переносимых комарами, в периферических медицинских учреждениях, в которые отсутствуют полностью оборудованные лаборатории25, и для быстрого обнаружения других РНК-вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека30. Наиболее уязвимые группы населения во время эпидемических вспышек — в соответствии с определением ВОЗ — часто не имеют достаточных экономических ресурсов и соответствующего оборудования для проведения обнаружения (Глобальная повестка дня Организации Объединенных Наций в области общественного здравоохранения). В условиях нынешней пандемии SARS-CoV-2 такие поставки, как медицинские мазки и реагенты для наборов для экстракции РНК, не смогли удовлетворить глобальный спрос, особенно в непроизводственных странах. В предлагаемом протоколе использовалась экстракция сырой РНК на основе гуанидиния тиоцианата (GITC), которая эффективно сохраняла РНК независимо от холодовой цепи и значительно уменьшала стойкость ингибиторов из образца. Кроме того, протокол экстракции GITC-хлороформа основан на отделении РНК от ДНК и белков с последующим осаждением, что позволяет восстановить большую часть генетического материала. Эти преимущества перевешивают потенциальные опасности гражданских ученых, работающих с химическим веществом, если будут приняты меры для надлежащего информирования их о рисках.
В предлагаемом рабочем процессе используются материалы и реагенты, которые имеют общее применение. Для этого требуется оборудование, которое доступно в базовых, часто сельских, лабораторных условиях. Эти методы недороги, очень устойчивы к ингибиторам, часто встречаемым в образцах окружающей среды или образцах, которые не могут быть обработаны экстракционными наборами, и устраняют необходимость в высокоточном термоциклере. В настоящем исследовании представлен трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров на часто затрагиваемых и редко дезинфицируемых поверхностях домашних хозяйств и городской среды.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

Для контроля за передачей коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) во время глобальной пандемии 2020 года большинство стран внедрили стратегии, основанные на прямом тестировании на людях, покрытии лица и дезинфекции поверхности. Исходя из предположения, что основной путь передачи включает аэрозоли и респираторные капли, усилия по обнаружению SARS-CoV-2 в фомитах были сосредоточены на местах с подозрением на высокую распространенность (например, больничные палаты, круизные суда и системы общественного транспорта). Чтобы исследовать присутствие SARS-CoV-2 на поверхностях в городской среде, которые редко очищаются и редко дезинфицируются, 350 граждан были привлечены из округа Сан-Диего. Всего эти гражданские ученые собрали 4080 образцов. Была разработана онлайн-платформа для контроля за доставкой и получением комплектов для отбора проб, а также для сбора данных о пробах. Наборы для отбора проб были в основном построены из материалов, доступных в магазинах, испытывая стресс в условиях пандемии. Образцы обрабатывались с использованием реагентов, к которым было легко получить доступ, несмотря на периодический дефицит поставок. Используемые методы были высокочувствительными и устойчивыми к ингибиторам, которые обычно присутствуют в образцах окружающей среды. Предложенные экспериментальные методы проектирования и обработки были успешными в привлечении многочисленных гражданских ученых, которые эффективно собирали образцы с различных площадей поверхности. Рабочий процесс и методы, описанные здесь, имеют отношение к обследованию городской среды на наличие других вирусов, которые представляют интерес для общественного здравоохранения и представляют угрозу для будущих пандемий.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Гражданский научный проект был разработан для привлечения жителей Сан-Диего для сбора образцов окружающей среды для SARS-CoV-2. Многоязычная веб-платформа была создана для отправки данных с использованием удобного интерфейса мобильного устройства. Система управления лабораторной информацией облегчила сбор тысяч географически разнообразных образцов с отслеживанием результатов в режиме реального времени.

Анализ городской среды - трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

В этом исследовании представлен новый рабочий процесс для обнаружения SARS-CoV-2 на поверхностях, которые редко очищаются в городской среде, таких как ручки газовых насосов, игровые площадки и банкоматы. В условиях пандемии поставки ограничены. Мы используем легкодоступные материалы, реагенты и оборудование, доступные в основных лабораторных условиях.Мы используем метод экстракции, который сохраняет РНК без холодовой цепи, и метод обнаружения, устойчивый к ингибиторам. Этот протокол представляет интерес для общественного здравоохранения. Он обеспечивает основу для оценки экологических вирусных резервуаров для текущей пандемии COVID-19 и других инфекционных агентов во время будущих глобальных вспышек.Привлеките гражданских ученых, используя прямой и четкий призыв к действию, опубликованный через местные и социальные сети. Создайте дескриптор социальных сетей, чтобы связать тему с контентом социальных сетей. Создайте ссылку на SMP, предоставляя многоязычный плагин для обеспечения навигации на нескольких языках для отдельных лиц, чтобы подать заявку на участие в усилиях по отбору проб окружающей среды, ответив на вопросы, связанные с биобезопасностью, указанные в онлайн-форме.Включите в раздел выборки графические и аудиовизуальные протоколы на английском и испанском языках. Визуализируйте геопространственные данные с помощью интерфейса геопространственного прикладного программирования, облегчаемого поставщиком облачных компьютерных услуг. Храните данные, отправленные в LIMS через SMP, чтобы облегчить централизованное хранение, отслеживание рабочих процессов обработки и управление логистикой.Информация о предварительной загрузке, такая как идентификатор комплекта образцов, идентификатор образца, дата, время и координаты глобальной системы позиционирования, обеспечивает соответствие типам данных и сводит к минимуму ошибку. Включите ссылку запроса на получение образца для участников, которую они могут использовать после того, как они собрали все образцы. Создайте комплект, который содержит все материалы для отбора проб, включая необходимые средства индивидуальной защиты, такие как маска и перчатки, протокол отбора проб и информацию, относящуюся к биобезопасности.Тампон редко дезинфицировал поверхности в домашних хозяйствах и городской среде, смачивая один сантиметр квадратного полиэфирового абсорбирующего тампона моющим средством и смазывая поверхность площадью 10 сантиметров в квадрате. С помощью зубочистки погрузьте каждый образец мазка в предварительно маркированную трубку, содержащую 200 микролитров тиоцианата гуанидиния. Наденьте предоставленную маску и новую пару перчаток для сбора каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения.После завершения отбора проб используйте предоставленное дезинфицирующее средство для рук. Храните трубки при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока они не будут доставлены в лабораторию. Как только образцы поступят в лабораторию, храните их при минус 80 градусах Цельсия.Чтобы увеличить скорость скрининга, обработайте образцы в бассейнах. Если пул положительный, извлеките РНК каждого образца независимо. Объедините образцы из каждого набора для отбора проб в два бассейна, объединив 50 микролитров каждого из восьми образцов в микроцентрифужную трубку и сохранив оставшиеся образцы при минус 80 градусах Цельсия.Добавьте 80 микролитров хлороформа и вихря в течение 15 секунд. Затем инкубировать в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Центрифуга в 13 000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.Перенесите водный слой в новую микроцентрифужную трубку. Храните оставшуюся часть раздела и розовую жидкость в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Эти фракции содержат ДНК и белки.Экстрагировать РНК из восстановленного водного слоя с использованием протокола экстракции РНК на основе гуанидиния тиоцианата. Приготовьте реакционную смесь RT-LAMP при комнатной температуре с избыточным объемом 10% для учета потерь при пипете. Добавьте пять микролитров РНК к реакции образца и пять микролитров РНК плюс 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к шиповидной реакции.Добавьте 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к положительному контролю и пять микролитров воды к отрицательному контролю. Хорошо перемешайте и раскрутите реакции. Для колориметрического наблюдения отрицательный результат обозначается розовым цветом, а положительный результат обозначается желтым.После RT-LAMP выполняют гель-электрофорез. Распределение образцов сайтов сбора показано здесь. Большинство комплектов были полными, и соответствующие данные были загружены в LIMS.Предел обнаружения на частоте 100% составлял 500 копий на 25 микролитр реакции. В колориметрическом RT-LAMP положительные образцы изменили цвет с розового на желтый из-за сдвига рН с восьми до 5,5. При низких числах копий образцы были запущены на агарозном гелевом для подтверждения положительных результатов с результирующим лестничным рисунком.Методы RT QPCR были опробованы на образцах окружающей среды. Все мастер-миксы были чувствительны к ингибиторам при низких концентрациях числа копий положительного контроля. При низких концентрациях шаблона традиционные методы ОТ-ПЦР показывали ложноположительные и ложноотрицательные результаты.Наконец, метод, называемый усилением скользящего круга, обнаружил небольшие количества целевой последовательности. Тем не менее, он показал усиление зонда в отсутствие шаблона РНК. Крайне важно выпустить призыв к действию, который охватил бы все слои общества, чтобы выборка действительно представляла риск воздействия на всех членов этого сообщества.Эта структура обнаруживает генетический материал SARS-CoV-2. Исследования для проверки вирусной жизнеспособности являются следующим шагом.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Неинвазивный метод отбора проб волос для получения высоких ДНК Качество от Неуловимый мелких млекопитающих

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Определение численного и структурные изменения во всех 24 хромосом человека одновременно, используя Роман OctoChrome Анализ FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Сбор, выделение и обогащение природного происхождения магнитотактических бактерий из окружающей среды

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Забор крови из боковой хвостовой вены крыс

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional межклеточной коммуникации: Функциональная биомаркеров для оценки неблагоприятного воздействия токсикантов и токсинами, и Польза для здоровья натуральных продуктов

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Квази метагеномных анализ сальмонеллы от пищевых продуктов и экологические пробы

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Трудосберегающий и повторяемый сенсорный сигнализирующего мутантного протокола для изучения тигморогенеза модельного завода Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...