Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Agradecemos a los investigadores del Instituto de Información Viral (VII), la Dra. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, el Dr. Gregory Peters, el Dr. Stuart A. Sandin y la Dra. Jennifer Smith por tomarse el tiempo para recolectar numerosas muestras. También agradecemos al Dr. Rob Knight, al Dr. Jack Gilbert, al Dr. Pedro Balda-Ferre y a la Dra. Sarah Allard del departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de San Diego California (UCSD) por facilitar controles positivos y comentarios útiles. Agradecemos a Stacey Carota (SDSU Facultad de Ciencias) y Gina Spidel (SDSU) por el apoyo logístico y a Juan Rodríguez por el arte y diseño gráfico del protocolo de muestreo. Agradecemos a todos los participantes su compromiso y dedicación a este proyecto en tiempos muy difíciles. Este trabajo fue apoyado por una generosa donación de la Dra. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) y la fundación nacional de ciencias RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Número de premio: 2030479).

Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista detallada de reactivos y suministros, incluidos los números de catálogo, el fabricante y los costos correspondientes.
1. Muestreo del entorno urbano
<ol><li>Alcance científico ciudadano<ol><li>Reclutar científicos ciudadanos utilizando un llamado directo y claro a la acción lanzado a través de las redes locales y sociales. Cree un identificador de redes sociales (por ejemplo, #swab4corona)para conectar el tema a través del contenido de las redes sociales.</li>
		<li>Cree una cuenta de correo electrónico para la comunicación directa entre el equipo del laboratorio y cada científico ciudadano, administrada por una persona que domine los principales idiomas de la región de interés (por ejemplo, español e inglés para el condado de San Diego).</li>
		<li>Construir una plataforma segura de gestión de muestras basada en la web (SMP) para servir como una base de datos, un sistema de gestión de información de laboratorio (LIMS), y para comunicarse con los científicos ciudadanos. NOTA: El SMP proporciona una ubicación centralizada donde los usuarios solicitan un kit, acceden a los protocolos de recopilación de muestras, envían metadatos de muestra y solicitan una recogida de kits de muestra completados.</li>
		<li>Cree un enlace al SMP (por ejemplo, https://demo.covidsample.org/) (Figura 1) para que las personas soliciten participar en el esfuerzo de muestreo ambiental respondiendo a las preguntas relacionadas con la bioseguridad especificadas en un formulario en línea.</li>
		<li>Acceso seguro al SMP mediante una interfaz de programación de aplicaciones de autenticación facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Dar a los usuarios aprobados acceso al SMP. NOTA: Consulte la documentación para obtener una descripción del protocolo 31 de OAuth2.0 para la autenticación y autorización. Proporciona un proceso de inicio de sesión sin fricciones para los voluntarios científicos ciudadanos. También permite a los usuarios iniciar sesión con una cuenta existente, lo que elimina la necesidad de crear una solución de inicio de sesión personalizada y administrar las credenciales de usuario, lo que ahorra una cantidad significativa de tiempo y fomenta la participación. Según informes recientes, el servicio de correo electrónico gratuito disponible para el proveedor de servicios informáticos en la nube elegido tiene aproximadamente 1.5 mil millones de usuarios de correo electrónico activos mensualmente; requerir una cuenta de correo electrónico de este proveedor de servicios para la participación no se considera un factor desalentador.</li>
		<li>Explicar el objetivo del estudio y las consideraciones de bioseguridad a los científicos ciudadanos en el SMP antes de que soliciten su primer kit. Proporcione un complemento multilingüe para permitir la navegación en cualquiera de los idiomas disponibles en un servicio de traducción automática neuronal multilingüe facilitado por un proveedor de servicios informáticos en la nube.</li>
		<li>Incluir en el apartado de muestreo protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español.</li>
		<li>Asigne un identificador único a cada kit y diseñe la interfaz de usuario para utilizar los botones vinculados al ID de muestra para agilizar el proceso de entrada de datos (Figura 1A).</li>
		<li>Utilice un software de planificación de rutas de entrega con una aplicación de dispositivo móvil para ser utilizado por los conductores para optimizar las rutas de entrega / recogida y notificar a los científicos ciudadanos de los tiempos estimados precisos de llegada.</li>
		<li>Construya la plataforma LIMS en una pila de servicios web PHP y hospede en una plataforma de alojamiento comercial (el sistema operativo sugerido, el software del servidor web y el software de base de datos se especifican en la Tabla de materiales).</li>
		<li>Proporcione una interfaz de aplicación segura basada en web para permitir que el personal del laboratorio administre los datos de forma rápida y sencilla en lims. Proporcionar visualización de datos mediante una interfaz de programación de aplicaciones de gráficos de datos facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube.</li>
		<li>Visualice los datos geoespaciales utilizando una interfaz de programación de aplicaciones geoespaciales facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Almacenar los datos enviados al LIMS a través del SMP para facilitar (1) el almacenamiento centralizado de los datos del proyecto; (2) seguimiento de flujos de trabajo de procesamiento de muestras/datos; y (3) gestión de la logística de la distribución de kits de muestras a científicos ciudadanos.</li>
		<li>Proteja los metadatos enviados mediante las mejores prácticas (por ejemplo, https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>Pre-cargue información como id. de kit de muestra, ID de muestra, fecha, hora y coordenadas del sistema de posicionamiento global (GPS) (recopilada automáticamente de una imagen del sitio) para permitir el cumplimiento del tipo de datos y minimizar el envío de datos erróneos o faltantes por parte del usuario (Figura 1B). Incluya los siguientes campos que el científico ciudadano debe rellenar de forma manual y rápida (<1 min): fecha y hora de la recolección, una breve descripción de la ubicación y una imagen del sitio de muestreo.</li>
		<li>Sanitize todos los datos cargados y valide para el tipo de datos. Por ejemplo, valide los datos de imagen cargados por los usuarios para seleccionar .jpg archivos, cámbiele el nombre con el identificador de ejemplo para una asociación rápida con el ejemplo y almacene las imágenes cargadas en una ubicación segura independiente a la que no puedan acceder los usuarios.</li>
		<li>Active la opción para solicitar la entrega y recogida del kit cuando se hayan completado todas las muestras (16). Adicionalmente, activa la opción de solicitar un nuevo kit para ser entregado en el momento de la recogida del anterior (Figura 1A). NOTA: Para los voluntarios que prefieren una plataforma no basada en la web y para aquellos preocupados por revelar su ubicación GPS (por ejemplo, los miembros de la comunidad preocupados por su estado migratorio), los kits se pueden entregar en un lugar de reunión acordado y se les pide a los voluntarios que registren una versión escrita de la recopilación de datos. Para la comunicación entre el laboratorio y cada científico ciudadano, tener un miembro bilingüe del proyecto disponible para llamadas telefónicas y mensajes de texto.</li>
	</ol></li>
	<li>Hisopo para Corona<ol>
<li>Identificar una ventana de tiempo epidemiológicamente relevante para el esfuerzo de muestreo.</li>
		<li>Construya un kit que contenga todos los suministros de muestreo, incluido el equipo de protección personal necesario (es decir, máscara, guantes), un protocolo de muestreo e información relevante para la bioseguridad (Figura 2). Pre-etiquete cada tubo con el identificador único asignado (ID de muestra).</li>
		<li>Los hisopos rara vez desinfectan las superficies que están expuestas a fómites aerosolizados en los hogares y el medio ambiente urbano.<ol>
<li>Use la mascarilla proporcionada en público y un nuevo par de guantes para la recolección de cada muestra para evitar la contaminación cruzada. Después de terminar el muestreo, use el desinfectante de manos proporcionado.</li>
			<li>Moje un hisopo absorbente de poliésterde 1 cm 2 (por ejemplo, almohadillas de fregona) con un detergente (por ejemplo, sulfato de dodecil sódico al 0,5% (SDS)) para inactivar el virus interrumpiendo su envoltura y para estabilizar el ARN desnudo induciendo el despliegue de RNasas32.</li>
			<li>Hisopo una superficie de 10 cm2. Con la ayuda de un palillo de dientes, sumerja completamente cada hisopo de muestra en el tubo premarcado correspondiente que contiene 200 μL de solución de tiocianato de guanidinio (GITC). Almacene los tubos a 4 °C hasta que sean transportados al laboratorio. Una vez que las muestras lleguen al laboratorio, guárdelas a -80 °C. NOTA: GITC es un irritante tóxico; evitar el contacto con la piel. La solución GITC es fácil de preparar a partir de productos químicos de laboratorio comunes, para la receta ver33,34. Inactiva el virus, estabiliza el ARN desnaturalizando las RNasas34,35,36y estabiliza las muestras a temperatura ambiente. El kit, sin embargo, incluye bolsas de hielo para mantener las muestras frías sin la necesidad de usar refrigeradores domésticos para el almacenamiento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Detección del SARS-CoV-2
<ol><li>Aislamiento total de ARN<ol>
<li>Desinfecte las superficies, equipos y pipeteadores con una solución de sulfato de cobre de 2 mM y peróxido de hidrógeno al 3%; seguido de una solución de blanqueador al 10%, bicarbonato de sodio al 90 mM, SDS al 5% y NaOH al 2,5%. Limpie bien con agua destilada seguida de etanol al 75%. NOTA: Estas soluciones son una alternativa a las soluciones disponibles comercialmente.</li>
		<li>Descongelar muestras sobre hielo. Muestras de vórtice durante 2 min a velocidad media.</li>
		<li>Para aumentar la velocidad de la selección, procese las muestras en piscinas. Si un grupo es positivo, extraiga el ARN de cada muestra de forma independiente para encontrar la/s muestra/s positiva/s. Combine las muestras de cada kit de muestreo (16 en total) en 2 grupos de 8 muestras. Nota : tener 8 muestras por grupo significa que sólo 2 grupos deben procesarse por kit. Si una agrupación es positiva, las muestras individuales se vuelven a procesar para el análisis RT-LAMP individual. Esto reduce el tiempo, los costos y los reactivos.</li>
		<li>Pool 50 μL de cada una de las 8 muestras en un tubo de microcentrífuga (volumen total 400 μL); guarde la muestra restante a -80 °C. Añadir 0,2 volúmenes (80 μL) de cloroformo, vórtice durante 15 s, y luego incubar durante 20 min a 4 °C. Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera la capa acuosa (líquido transparente) a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde la interfaz restante y el líquido rosado en el congelador de -80 °C; estas fracciones contienen ADN y proteínas33,36.</li>
		<li>Añadir un volumen igual de isopropanol (~200 μL) y 2,6 μL de glucógeno coprecipitante (15 mg mL-1)37. Mezclar bien e incubar a -20 °C durante al menos 1 h, seguido de 4 °C durante 10 min para precipitar el ARN. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí incubando muestras a -20 °C durante la noche en lugar de 1 h.</li>
		<li>Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C. Retire el sobrenadante sin molestar el pellet. Resuspend el pellet en 50 μL de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y añadir un volumen igual (50 μL) de acetato de amonio 5 M libre de ARNasa y 2,5 volúmenes (250 μl) de etanol al 100%7,38. NOTA: Los iones de amonio inhiben la polinucleótido quinasa si se utilizan en un proceso aguas abajo38. La mezcla precipita ARN dejando trifosfatos y oligosacáridos desoxinucleósidos en solución38.</li>
		<li>Mezclar bien e incubar a -20 °C durante al menos 1 h, seguido de 4 °C durante 10 min para precipitar el ARN. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí incubando muestras a -20 °C durante la noche en lugar de 1 h.</li>
		<li>Centrífuga a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C. Lavar el pellet con 1 mL de frío (-20 °C), recién hecho al 75% de etanol. Centrífuga a 8.000 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con una pipeta P10 para evitar molestar el pellet.</li>
		<li>Seque al aire el pellet durante 10-15 min hasta que no quede etanol. Resuspend el pellet en 50 μL de agua tratada con DEPC, añadir 5 μL de tampón de 10x DNasa + 1μL de DNasa (2 Unidades μL-1), e incubar a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Añadir 0,1 volúmenes (5,6 μL) de reactivo de inactivación de la DNasa, incubar a temperatura ambiente durante 5 min y mezclar suavemente cada minuto. Centrífuga a 13.000 × g durante 2 min, y transferir sobrenadante a un tubo nuevo (~50 μL). Coloque el tubo sobre hielo inmediatamente mientras prepara las reacciones RT-qPCR o RT-LAMP, o guárdelo en un congelador de -20 °C. NOTA: Realice el aislamiento de ARN en una habitación libre de amplificación para evitar la contaminación por arrastre.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa múltiplex (RT-LAMP)<ol>
<li>Preparar una solución de mezcla de cebadores 20X (Tabla 1) para cada juego de cebadores (Tabla 2). Prepare la mezcla de reacción RT-LAMP (Tabla 3) a temperatura ambiente con un exceso de volumen del 10% para tener en cuenta la pérdida de pipeteo. NOTA: La mezcla maestra colorimétrica LAMP 2X con uracilo-ADN glicosilasa termolábil antártica (UDG) evita la amplificación de la contaminación del ADN por reacciones previas20,28.</li>
		<li>Vórtice y girar hacia abajo de la mezcla. Dispense 20 μL de la mezcla en cada tubo de reacción: muestra, punción, control positivoy control negativo. Incubar las reacciones en los tubos a temperatura ambiente durante 10 min para permitir que el UDG actúe sobre la posible contaminación por arrastre.</li>
		<li>Añadir 5 μL de ARN a la reacción de la muestra, 5 μL de ARN + 2,5 μL (450 copias) de ARN sintético del SARS-CoV-2 a la reacción con pinchos, 2,5 μL (450 copias) de ARN sintético del SARS-CoV-2 a la reacción de control positiva, y 5 μL de H2O a la reacción de control negativa. Mezclar bien, y girar hacia abajo las reacciones; descongelar todo el ARN en el hielo.</li>
		<li>Mientras que el termociclador, o el baño de agua, se calienta a 65 °C, permita que todas las reacciones permanezcan a temperatura ambiente. El UDG se inactivará a >50 °C. Coloque las reacciones en el termociclador (use tapa de calor), incube a 65 °C durante 40 min y deje que las reacciones alcancen la temperatura ambiente (~ 22 °C durante 5 min), o enfríe en el hielo durante 1 min. Analice los resultados utilizando la característica colorimétrica (observación simple) o ejecutando los productos en un gel de agarosa. NOTA: Aunque el límite de detección (LOD) es de 10 copias por reacción, la frecuencia de detección aumenta a medida que el número de copias se acerca a las 500 copias por reacción (Figura 3A). Para la observación colorimétrica, tenga en cuenta que un resultado negativo se indica con rosa (pH = 8,8), mientras que un resultado positivo se indica con amarillo (pH = 5) (Figura 3B). La opción colorimétrica evita la apertura de los tubos RT-LAMP después de la amplificación, lo que reducirá el volumen de los productos RT-LAMP en el entorno de trabajo y la contaminación por arrastre. Para la electroforesis en gel, prepare un gel de agarosa al 1,5% con tinción de gel de ADN 1X en tampón Tris/Borato/EDTA al 0,5%. Cargue 25 μL de la reacción + 5 μL de colorante de carga 6X en cada pozo. Ejecute el gel a 100 V durante 60 min. No se necesita un marcador molecular ya que las muestras positivas muestran un patrón de escalera (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Todos los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

Participación ciudadana científica. Científicos ciudadanos fueron reclutados para hisopar superficies en todo el condado de San Diego para muestrear y detectar la presencia de SARS-CoV-2 en el entorno urbano. La mayoría de los kits de muestreo entregados (70%) fueron devueltas al laboratorio, y de ellas, casi todas las muestras estaban completas (91%) (Figura 3A, B y Cuadro 4). Los voluntarios podían solicitar fácilmente la entrega/recogida de kits a través de la plataforma basada en la web, y el software de planificación de rutas de entrega notificaba a los científicos ciudadanos los tiempos estimados de llegada, ambos factores probablemente significativos para el éxito observado. El tiempo promedio desde que se entregó el kit al científico ciudadano hasta que fue devuelto al laboratorio fue de 8 días, con una mediana de 3 días y un rango de 1-64 días (Figura 3A y Tabla 4). Recordatorios más frecuentes a los voluntarios probablemente reducirían este tiempo de retraso.
La plataforma de recopilación de datos fue utilizada con éxito por una gran mayoría de los usuarios (73%) (Cuadro 4). Si bien no se midieron los esfuerzos de los científicos ciudadanos, las pruebas de campo mostraron que la plataforma de recopilación de datos redujo significativamente el esfuerzo y el tiempo necesarios para completar adecuadamente la recolección de muestras. Por lo tanto, la reducción de la cantidad de contabilidad alentó la participación de los científicos ciudadanos. La plataforma basada en la web pretendía superar las limitaciones demográficas proporcionando un servicio de traducción automática neuronal multilingüe y proporcionando protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español. Esto fue solo parcialmente exitoso, ya que se recolectaron menos muestras tanto del Condado de South Bay como del Condado norte, donde reside la mayoría de la población hispana / latina del condadocon 45 años. Estas áreas también albergaban el 63% (1,700 casos por cada 100,000) del total de casos de COVID-19 en el condado de San Diego con la prevalencia más alta de la enfermedad46 y la tasa de hospitalizaciones (62%)47,48. Aunque la mayoría de las muestras provinieron del Condado Central, se recogió un número representativo de los distritos más afectados por COVID-19 y solo una pequeña fracción de las muestras fue positiva, lo que sugiere que los reservorios superficiales de SARS-CoV-2 en el entorno urbano son relativamente raros.
Procesamiento de muestras. Los hisopos de muestreo se humedecieron con SDS, que inactivaron el virus al interrumpir su envoltura y estabilizaron el ARN desnudo mediante el despliegue de RNases32. Convenientemente durante la recolección, el detergente en el hisopo limpió la superficie muestreada. Las muestras ambientales a menudo contienen cantidades muy pequeñas de ARN. Para maximizar la recuperación, el aislamiento del ARN fue realizado usando gitc-basado, columna-libre, método crudo de la extracción. GITC, un fuerte agente caotrópico, interrumpe los enlaces de hidrógeno que mantienen el plegamiento de proteínas (es decir, efecto hidrofóbico). Esta acción da lugar a la inactivación de partículas virales, y el ARN permanece estable debido a la inhibición de las ARN34,35,36. La solución GITC mantuvo la estabilidad de las muestras de ARN sin consideraciones estrictas de cadena de frío, lo que permitió a los ciudadanos mantener las muestras a temperatura ambiente si no se disponía de un congelador para las bolsas de hielo proporcionadas. Para reducir el peligro potencial que este reactivo representa cuando se produce un contacto directo con la piel o la mucosa, los ciudadanos fueron informados de estos riesgos mediante la inclusión de una hoja de datos de seguridad del material proporcionada en el kit y se colocó un sello de advertencia en la caja que contiene los tubos.
El método crudo de extracción de GITC-cloroformo ayudó a la recuperación de rastros de ARN de los hisopos, y como se muestra en la amplificación de muestras con picos, los inhibidores rara vez persistieron en las muestras después de la extracción. Las muestras, que fueron negativas para el SARS-CoV-2 y no mostraron inhibición de RT-LAMP, representaron verdaderos negativos o tuvieron un número de copias más bajo que el LOD con una frecuencia del 100%. Por el contrario, la detección de ARN viral en una superficie no implica directamente el riesgo de transmisión a través del contacto, ya que es necesario analizar la infectividad del virus a partir de muestras positivas. La detección rápida del medio ambiente, no limitada por la disponibilidad de suministros sofisticados o personal altamente calificado, es crucial para evaluar si las superficies constituyen un reservorio viral y para dirigir mejor los esfuerzos de prevención y contención.
RT-LAMP fue seleccionado para ser el mejor método adecuado para la tubería de detección propuesta. Demostró ser un método rápido y barato que era altamente resistente a la mayoría de los inhibidores restantes y tan sensible y específico como otros métodos de RT-qPCR. Debido a su uso en entornos clínicos durante la pandemia de SARS-CoV-2, la disponibilidad de kits rt-qPCR se vio afectada por la demanda mundial. Además, las técnicas de RT-qPCR,incluso las formuladas para resistir a los inhibidores, eran sensibles a las sustancias contenidas en las muestras ambientales recogidas por una cohorte piloto de científicos ciudadanos, incluso después del uso de otras estrategias comunes para reducir la competencia de los inhibidores por la unión enzimática49. Estos hallazgos son corroborados por un estudio reciente que comparó ambos métodos para detectar sars-CoV-2 en muestras de hisopos de caramelos manejados por pacientes de COVID-19 y encontró más del 83% de concordancia de resultados, con un 25% menos de inhibición en muestras analizadas por RT-LAMP15. Además, la extracción de crudo GITC-cloroformo, junto con RT-LAMP, redujo el costo de los reactivos y suministros en un 42% en comparación con la extracción del kit de ARN y RT-qPCR (Tabla de Materiales).
Este método permitió el análisis de alto rendimiento de miles de muestras de hisopos superficiales. Hasta 80 piscinas, que representan 640 muestras, se procesaron en 2 días desde la extracción de ARN hasta la detección de SARS-CoV-2 por RT-LAMP. El protocolo propuesto es semicuantitativo, limitado a la detección de ARN viral, y no indica la presencia de partículas virales infecciosas. Se requieren análisis adicionales para evaluar el riesgo de transmisión del SARS-CoV-2 de los fómites infectados presentes en las superficies hisopadas.
Este estudio presenta un protocolo para establecer rápidamente una estrategia de pruebas que incluya un flujo de trabajo efectivo cuando se enfrenta a una emergencia de salud con una enfermedad transmisible. El protocolo de muestreo propuesto es simple y utiliza suministros que se encuentran comúnmente en los hogares, y el método de detección viral se lleva a cabo en equipos disponibles en entornos básicos de laboratorio, como un baño de agua en lugar de un termocicloador. Los costos de los reactivos RT-LAMP son significativamente más bajos que los necesarios para RT-qPCR y menos susceptibles a escenarios de alta demanda global. Este estudio sirve de marco para la evaluación de reservorios virales ambientales en futuros brotes epidémicos y pandemias mundiales.

Se cree que el SARS-CoV-2 se transmite principalmente a través de la inhalación de aerosoles y gotitas contaminados por contacto directo con individuos infectados1,2,3,4. Sin embargo, durante las fases iniciales de la pandemia mundial de COVID-19, los esfuerzos para controlar la transmisión del SARS-CoV-2 se centraron fuertemente en la desinfección de superficies, el lavado de manos y la desinfección. Para finales de 2020, las pautas de transmisión de la Organización Mundial de la Salud (OMS)5 y los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)6 de Estados Unidos consideraron que la transmisión en el aire era un peligro principalmente cuando se está en contacto cercano (<2 m) con una persona infectada o en presencia de procedimientos médicos generadores de aerosoles. La autoin inoculación después del contacto con superficies contaminadas o la inhalación de fómites aerosolizados aún no se han descartado como una vía de transmisión del SARS-CoV-2.
Se han reportado casos de COVID-19 en los que la transmisión aérea parece poco probable7,8. Los viriones del SARS-CoV-2 permanecen infecciosos en el cobre hasta 8 h, en el cartón y el acero inoxidable hasta 24 h, y en el plástico hasta 48 h9. En las cabinas de los cruceros, el ARN del SARS-CoV-2 se detectó 17 días después de que los pasajeros hubieran partido7. Muestras de aire y superficie de hospitales y sistemas de transporte masivo han dado positivo para SARS-CoV-2 y otros coronavirus8,10,11,12,13,14. Un estudio realizado en el embalaje exterior de caramelos de Halloween manejados por pacientes de COVID-19 asintomáticos y moderadamente/levemente sintomáticos, concluyó que la combinación de lavado de manos por parte del manipulador y lavado de los dulces con jabón de manos redujo el ARN del SARS-CoV-2 por debajo de los niveles umbral15.
Se han publicado varios métodos para el diagnóstico del SARS-CoV-2 basados en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real(RT-qPCR)16,17,la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP)11,18,19,20,21y las tecnologías CRISPR-Cas18,19,22,23. La mayoría requieren kits de extracción de ARN que a menudo escasean durante los períodos de demanda mundial significativa, y muy pocos se han utilizado para la detección ambiental del virus24. Se ha demostrado que la detección de ARN del SARS-CoV-2 mediante RT-LAMP es más del 83% concordante con el uso de RT-qPCR. Además, RT-LAMP dio lugar a una reducción del 25% en los resultados no concluyentes en comparación con RT-qPCR15.
RT-LAMP es una técnica sencilla que utiliza una transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de una plantilla de ARN25,seguida de una ADN polimerasa con fuerte actividad de desplazamiento de hebras que sintetiza ADN a temperatura constante (es decir, amplificación isotérmica)26. Una mayor especificidad de la detección del genoma viral se logra mediante el uso de cuatro o seis cebadores que reconocen seis u ocho regiones del ADN objetivo. La amplificación se inicia a partir de un cebador interno y produce una estructura de ADN semi-doble cadena. La hebra principal es entonces amplificada por una imprimación externa. Estas amplificaciones se repiten para los cebadores inversos. Los cebadores internos y externos en cada extremo tienen un sitio auto-complementario inverso interno que forma un bucle en el producto de amplificación26,27. En el desplazamiento de hebra isotérmica, la síntesis asíncrona de ADN genera altas cantidades de producto amplificado donde la polimerización continua amplifica la señal de tan solo 10 copias por reacción11,20,28. La mezcla colorimétrica RT-LAMP está débilmente tamponada y utiliza el rojo fenol como indicador de pH. Como la polimerasa incorpora un nucleótido, libera un protón, y suficientes protones cambiarán el pH de la solución así como su color de rosa a amarillo11,20,28,29.
RT-LAMP fue desarrollado para la detección de enfermedades transmitidas por mosquitos en centros de salud periféricos que carecen de laboratorios totalmente equipados25 y para la detección rápida de otros virus ARN como el virus de inmunodeficiencia humana30. Las poblaciones más vulnerables en los brotes epidémicos —según la definición de la OMS— a menudo carecen de recursos económicos suficientes y del equipo adecuado para llevar a cabo la detección (Programa mundial de salud pública de las Naciones Unidas). En la actual pandemia de SARS-CoV-2, los suministros como hisopos de grado médico y reactivos para kits de extracción de ARN no han podido satisfacer la demanda mundial, especialmente en los países no manufactureros. El protocolo propuesto utilizó una extracción de ARN crudo basada en tiocianato de guanidinio (GITC), que preservó eficazmente el ARN de una manera independiente de la cadena de frío y redujo significativamente la persistencia de los inhibidores de la muestra. Además, el protocolo de extracción gitc-cloroformo se basa en la separación del ARN del ADN y las proteínas seguida de la precipitación respectiva, lo que permite la recuperación de la mayor parte del material genético. Estas ventajas superan los peligros potenciales de los científicos ciudadanos que manipulan el producto químico si se toman medidas para informarles adecuadamente de los riesgos.
El flujo de trabajo propuesto utiliza materiales y reactivos que son de uso general. Requiere equipos que estén disponibles en entornos de laboratorio básicos, a menudo rurales. Estos métodos son baratos, altamente resistentes a los inhibidores que a menudo se encuentran en muestras ambientales o muestras que no se pueden procesar con kits de extracción, y eliminan la necesidad de un termociclador de alta precisión. Este estudio presenta una tubería para el muestreo y la detección del SARS-CoV-2 de reservorios ambientales en superficies comúnmente tocadas y raramente desinfectadas de los hogares y el medio ambiente urbano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

Para controlar la transmisión comunitaria del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) durante la pandemia mundial de 2020, la mayoría de los países implementaron estrategias basadas en pruebas directas en humanos, cobertura facial y desinfección de superficies. Bajo el supuesto de que la principal vía de transmisión incluye aerosoles y gotitas respiratorias, los esfuerzos para detectar el SARS-CoV-2 en fómites se han centrado en lugares sospechosos de alta prevalencia (por ejemplo, salas de hospitales, cruceros y sistemas de transporte masivo). Para investigar la presencia de SARS-CoV-2 en superficies en el entorno urbano que rara vez se limpian y rara vez se desinfectan, se alistó a 350 ciudadanos del condado de San Diego. En total, estos científicos ciudadanos recogieron 4.080 muestras. Se desarrolló una plataforma en línea para monitorear la entrega y recogida de kits de muestreo, así como para recopilar datos de muestras. Los kits de muestreo se construyeron en su mayoría a partir de suministros disponibles en tiendas con estrés pandémico. Las muestras se procesaron utilizando reactivos de fácil acceso a pesar de la escasez recurrente de suministros. Los métodos utilizados fueron altamente sensibles y resistentes a los inhibidores que están comúnmente presentes en muestras ambientales. El diseño experimental propuesto y los métodos de procesamiento tuvieron éxito en la participación de numerosos científicos ciudadanos que efectivamente recogieron muestras de diversas áreas de superficie. El flujo de trabajo y los métodos descritos aquí son relevantes para estudiar el entorno urbano en busca de otros virus, que son de interés para la salud pública y representan una amenaza para futuras pandemias.

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Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Un proyecto de ciencia ciudadana fue diseñado para reclutar residentes de San Diego para recolectar muestras ambientales para el SARS-CoV-2. Se creó una plataforma multilingüe basada en la web para el envío de datos utilizando una interfaz de dispositivo móvil fácil de usar. Un sistema de gestión de la información de laboratorio facilitó la recolección de miles de muestras geográficamente diversas con seguimiento de resultados en tiempo real.

Hisopado del medio ambiente urbano - Una tubería para el muestreo y la detección del SARS-CoV-2 de los embalses ambientales

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Este estudio presenta un nuevo flujo de trabajo para detectar el SARS-CoV-2 en superficies que rara vez se limpian en el entorno urbano, como las manijas de las bombas de gas, los parques infantiles y los cajeros automáticos. En una pandemia, los suministros son escasos. Utilizamos materiales y reactivos de fácil obtención y equipos disponibles en entornos básicos de laboratorio.Utilizamos un método de extracción que preserva el ARN sin una cadena de frío, y un método de detección resistente a los inhibidores. Este protocolo es de interés para la salud pública. Proporciona un marco para la evaluación de los reservorios virales ambientales para la actual pandemia de COVID-19 y otros agentes infecciosos durante futuros brotes globales.Reclutar científicos ciudadanos utilizando un llamado directo y claro a la acción lanzado a través de las redes sociales y locales. Cree un identificador de redes sociales para conectar el tema a través del contenido de las redes sociales. Cree un enlace al SMP, proporcionando un plug-in multilingüe para permitir la navegación en varios idiomas para que las personas soliciten participar en el esfuerzo de muestreo ambiental respondiendo a las preguntas relacionadas con la bioseguridad especificadas en un formulario en línea.Incluir en el apartado de muestreo protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español. Visualice los datos geoespaciales utilizando una interfaz de programación de aplicaciones geoespaciales facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Almacene los datos enviados al LIMS a través del SMP para facilitar el almacenamiento centralizado, el seguimiento de los flujos de trabajo de procesamiento y la gestión de la logística.Cargar previamente información como el identificador del kit de muestra, el identificador de muestra, la fecha, la hora y las coordenadas del sistema de posicionamiento global para habilitar el cumplimiento del tipo de datos y minimizar el error. Incluya un enlace de solicitud de recogida de muestras para los participantes, que pueden usar una vez que hayan recogido todas las muestras. Construya un kit que contenga todos los suministros de muestreo, incluido el equipo de protección personal necesario, como máscara y guantes, un protocolo de muestreo e información relevante sobre bioseguridad.El hisopo rara vez desinfecta las superficies en los hogares y el entorno urbano humedeciendo un hisopo absorbente de poliéster cuadrado de un centímetro con un detergente y frotando una superficie de 10 centímetros cuadrados. Con la ayuda de un palillo de dientes, sumerja cada hisopo de muestra en el tubo premarcado que contiene 200 microlitros de tiocianato de guanidinio. Use la máscara proporcionada y un nuevo par de guantes para la recolección de cada muestra para evitar la contaminación cruzada.Después de terminar el muestreo, use el desinfectante de manos proporcionado. Guarde los tubos a cuatro grados centígrados hasta que sean transportados al laboratorio. Una vez que las muestras lleguen al laboratorio, guárdelas a menos 80 grados centígrados.Para aumentar la velocidad de la selección, procese las muestras en piscinas. Si un grupo es positivo, extraiga el ARN de cada muestra de forma independiente. Combine las muestras de cada kit de muestreo en dos piscinas agrupando 50 microlitros de cada una de las ocho muestras en un tubo de microcentrífuga y guardando las muestras restantes a menos 80 grados Celsius.Añadir 80 microlitros de cloroformo y vórtice durante 15 segundos. Luego incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Centrífuga a 13,000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Centígrados.Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde la interfaz restante y el líquido rosado en el congelador de menos 80 grados Celsius. Estas fracciones contienen ADN y proteínas.Extraiga el ARN de la capa acuosa recuperada usando un protocolo crudo basado tiocianato del guanidinio de la extracción cruda del ARN. Prepare la mezcla de reacción RT-LAMP a temperatura ambiente con un volumen excesivo del 10% para tener en cuenta la pérdida de pipeteo. Agregue cinco microlitros de ARN a la reacción de la muestra y cinco microlitros de ARN más 2,5 microlitros de ARN sintético sars-cov-2 a la reacción con pinchos.Añadir 2,5 microlitros de ARN sintético del SARS-CoV-2 al control positivo y cinco microlitros de agua al control negativo. Mezclar bien y girar hacia abajo las reacciones. Para la observación colorimétrica, un resultado negativo se indica con rosa y un resultado positivo se indica con amarillo.Después de RT-LAMP, realice electroforesis en gel. La distribución de los sitios de recolección de muestras se muestra aquí. La mayoría de los kits estaban completos, y los datos correspondientes se cargaron en el LIMS.El límite de detección a una frecuencia del 100% fue de 500 copias por cada 25 microlitros de reacción. En el RT-LAMP colorimétrico, las muestras positivas cambiaron de color de rosa a amarillo debido a un cambio de pH de ocho a 5,5. En números bajos de la copia, las muestras fueron funcionadas en un gel de la agarosa para confirmar los positivos con el escala-como patrón resultante.Los métodos de RT QPCR se probaron con muestras ambientales. Todas las mezclas principales eran sensibles a los inhibidores en las concentraciones bajas del número de la copia del control positivo. En las concentraciones bajas de la plantilla, los métodos tradicionales de la polimerización en cadena de RT mostraron falsos positivos y falsos negativos.Por último, una técnica llamada amplificación del círculo rodante detectó pequeñas cantidades de la secuencia objetivo. Sin embargo, demostró la amplificación de la punta de prueba en ausencia de una plantilla del ARN. Es vital lanzar un llamado a la acción que llegue a todos los sectores de la comunidad para que el muestreo realmente represente el riesgo de exposición de todos los miembros de esa comunidad.Este marco detecta material genético del SARS-CoV-2. Los estudios para probar la viabilidad viral son el siguiente paso.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Investigación

Biología

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Recolección, aislamiento y enriquecimiento de bacterias naturales magnetotácticas del Medio Ambiente

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Brecha ocasiones intercelular de comunicación: un biomarcador funcional para evaluar los efectos adversos de las sustancias tóxicas y toxinas, y de Salud Beneficios de Productos Naturales

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

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Análisis de metagenómica cuasi de Salmonella de muestras alimentarias y ambientales

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Un Protocolo de Pantalla Mutante de Señalización de Señalización de Fuerza Táctil Y Repetible para el Estudio de la Thigmomorfogénesis de una Planta Modelo Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...