Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Vi tackar Viral Information Institute (VII) utredare, Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin och Dr. Jennifer Smith för att ta sig tid att samla in många prover. Vi tackar också Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre och Dr. Sarah Allard från institutionen för pediatrik vid School of Medicine University of San Diego California (UCSD) för att underlätta positiva kontroller och användbar feedback. Vi tackar Stacey Carota (SDSU College of Sciences) och Gina Spidel (SDSU) för logistiskt stöd och Juan Rodríguez för konsten och den grafiska utformningen av provtagningsprotokollet. Vi tackar alla deltagare för deras engagemang och engagemang för detta projekt under mycket svåra tider. Detta arbete stöddes av en generös donation från Dr. Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) och National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 grant (Award Number: 2030479).

Se strukturlistan för en detaljerad lista över reagenser och leveranser, inklusive katalognummer, tillverkare och motsvarande kostnader.
1. Provtagning av stadsmiljön
<ol><li>Medborgarforskare uppsökande verksamhet<ol><li>Rekrytera medborgarforskare med hjälp av en direkt och tydlig uppmaning som släpps via lokala och sociala medier. Skapa ett handtag på sociala medier (t.ex. #swab4corona) för att koppla ämnet över innehåll på sociala medier.</li>
		<li>Skapa ett e-postkonto för direkt kommunikation mellan laboratorieteamet och varje medborgarforskare, som hanteras av en person flytande på huvudspråken i intresseregionen (t.ex. spanska och engelska för San Diego County).</li>
		<li>Skapa en säker webbaserad testhanteringsplattform (SMP) för att fungera som en databas, ett LIMS (Laboratory Information Management System) och för att kommunicera med medborgarforskare. SMP tillhandahåller en centraliserad plats där användare begär ett kit, får åtkomst till exempelinsamlingsprotokoll, skickar exempelmetadata och begär en upphämtning för slutförda exempelsatser.</li>
		<li>Skapa en länk till SMP (t.ex. https://demo.covidsample.org/) (figur 1) för enskilda personer att ansöka om att delta i miljöprovtagningsinsatsen genom att svara på frågor om biosäkerhet som anges i ett onlineformulär.</li>
		<li>Säker åtkomst till SMP med hjälp av ett programmeringsgränssnitt för autentiseringsprogram som underlättas av en molndatortjänstleverantör. Ge godkända användare åtkomst till SMP. Obs: Se litteraturen för en beskrivning av OAuth 2.0 protokoll31 för autentisering och auktorisering. Det ger en friktionsfri inloggningsprocess för medborgarforskare. Det gör det också möjligt för användare att logga in med ett befintligt konto, vilket eliminerar behovet av att skapa en anpassad inloggningslösning och hantera användarautentiseringsuppgifter, vilket sparar en betydande tid och uppmuntrar deltagande. Enligt de senaste rapporterna har den kostnadsfria e-posttjänsten som är tillgänglig för den valda molndatorleverantören cirka 1,5 miljarder månatliga aktiva e-postanvändare; att kräva ett e-postkonto från denna tjänsteleverantör för deltagande anses inte vara en avskräckande faktor.</li>
		<li>Förklara syftet med studien och biosäkerhetsövervägandena för medborgarforskarna på SMP innan de begär sitt första kit. Tillhandahålla ett flerspråkigt plugin för att möjliggöra navigering på något av de språk som är tillgängliga från en flerspråkig neural maskinöversättningstjänst som underlättas av en molndatorleverantör.</li>
		<li>Inkludera i provtagningsavsnittet grafiska och audiovisuella protokoll på engelska och spanska.</li>
		<li>Tilldela en unik identifierare till varje sats och utforma användargränssnittet för att använda knappar kopplade till exempel-ID för att effektivisera datainmatningsprocessen (figur 1A).</li>
		<li>Använd en programvara för planering av leveransvägar med en mobil enhet som ska användas av förare för att optimera leverans-/upphämtningsvägar och meddela medborgarforskare om exakta beräknade ankomsttider.</li>
		<li>Bygg LIMS-plattformen på en PHP-webbtjänststack och var värd för den på en kommersiell värdplattform (föreslaget operativsystem, webbserverprogramvara och databasprogramvara anges i materialförteckningen).</li>
		<li>Tillhandahålla ett säkert webbaserat programgränssnitt som gör det möjligt för labbpersonal att hantera data snabbt och enkelt i LIMS. Tillhandahålla datavisualisering med hjälp av ett datadiagramprogramprogrammeringsgränssnitt som underlättas av en molndatorleverantör.</li>
		<li>Visualisera geospatiala data med hjälp av ett geospatialt programprogrammeringsgränssnitt som underlättas av en molndatorleverantör. Lagra de uppgifter som lämnats in till LIMS genom SMP för att underlätta (1) centraliserad lagring av projektdata, (2) Spårning av arbetsflöden för urvals-/databehandling. och (3) Hantering av logistiken för distribution av provkit till medborgarforskare.</li>
		<li>Säkra inlämnade metadata med hjälp av metodtips (t.ex. https://demo.covidsample.org/).</li>
		<li>Förinläsningsinformation som exempelsats-ID, prov-ID, datum, tid och GPS-koordinater (automatiskt insamlade från en bild av webbplatsen) för att möjliggöra datatypsefterlevnad och minimera användarens inlämning av felaktiga eller saknade data (figur 1B). Inkludera följande fält som ska fyllas manuellt och snabbt (<1 min) av medborgarforskaren: datum och tid för insamling, en kort beskrivning av platsen och en bild av provtagningsplatsen.</li>
		<li>Sanera alla uppladdade data och validera för datatyp. Du kan till exempel validera bilddata som laddats upp av användare för att välja .jpg-filer, byta namn på dem med exempel-ID för snabb association med exemplet och lagra uppladdade bilder på en separat säker plats som inte är tillgänglig för användare.</li>
		<li>Aktivera alternativet att begära leverans och upphämtning av satser när alla prover (16) har slutförts. Aktivera dessutom möjligheten att begära att ett nytt kit levereras vid upphämtning av det föregående (figur 1A). OBS: För volontärer som föredrar en icke-webbaserad plattform och för dem som är oroliga för att avslöja sin GPS-plats (t.ex. medlemmar i samhället som är oroliga för deras migrationsstatus) kan kit levereras på en överenskommen mötesplats och volontärer ombeds att spela in en skriftlig version av datainsamlingen. För kommunikation mellan laboratoriet och varje medborgarforskare, ha en tvåspråkig medlem i projektet tillgänglig för telefonsamtal och texter.</li>
	</ol></li>
	<li>Svabbprov för Corona<ol>
<li>Identifiera ett epidemiologiskt relevant tidsfönster för provtagningsarbetet.</li>
		<li>Bygg ett kit som innehåller alla provtagningsmaterial, inklusive nödvändig personlig skyddsutrustning (dvs. mask, handskar), provtagningsprotokoll och relevant information om biosäkerhet (figur 2). Förmärka varje rör med den tilldelade unika identifieraren (prov-ID).</li>
		<li>Svabbprov desinficerade ytor som utsätts för aerosoliserade fomiter i hushåll och stadsmiljön.<ol>
<li>Bär den medföljande masken offentligt och ett nytt par handskar för insamling av varje prov för att undvika korskontaminering. Efter avslutad provtagning, använd den medföljande handspriten.</li>
			<li>Fukta en 1 cm2 polyesterabsorberande svabbprov (t.ex. moppkuddar) med ett tvättmedel (t.ex. 0,5% natriumdidylsulfat (SDS)) för att inaktivera viruset genom att störa dess kuvert och stabilisera det nakna RNA genom att inducera utfällning av RNases32.</li>
			<li>Svabb en yta på 10 cm2. Med hjälp av en tandpetare, helt nedsänkt varje provsvabb i motsvarande förmärkta rör som innehåller 200 μL guanidinium tiocyanatlösning (GITC). Förvara rören vid 4 °C tills de transporteras till laboratoriet. När proverna anländer till laboratoriet, förvara dem vid -80 °C. OBS: GITC är ett giftigt irriterande medel; undvika kontakt med huden. GITC-lösningen är enkel att förbereda från vanliga laboratoriekemikalier, för receptet se33,34. Det inaktiverar viruset, stabiliserar RNA genom att denaturera RNases34,35,36, och stabiliserar prover vid rumstemperatur. Satsen innehåller dock isförpackningar för att hålla proverna kalla utan att behöva använda kylskåp för förvaring.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. SARS-CoV-2 detektering
<ol><li>Total RNA-isolering<ol>
<li>Desinficera ytor, utrustning och pipettors med en lösning av 2 mM kopparsulfat och 3% väteperoxid; följt av en lösning på 10% blekmedel, 90 mM natriumbikarbonat, 5% SDS och 2,5% NaOH. Torka noggrant med destillerat vatten följt av 75% etanol. OBS: Dessa lösningar är ett alternativ till de kommersiellt tillgängliga lösningarna.</li>
		<li>Tina prover på is. Virvelprover i 2 min med medelhög hastighet.</li>
		<li>För att öka screeninghastigheten, bearbeta proverna i pooler. Om en pool är positiv, extrahera RNA för varje prov självständigt för att hitta de positiva proven/proverna. Kombinera proverna från varje provtagningssats (totalt 16) i 2 pooler med 8 prover. OBS: Att ha 8 prover per pool innebär att endast 2 pooler behöver bearbetas per sats. Om en pool är positiv bearbetas de enskilda proverna igen för individuell RT-LAMP-analys. Detta minskar tid, kostnader och reagenser.</li>
		<li>Pool 50 μL av vart och ett av 8 prover i ett mikrocentrifugrör (total volym 400 μL). spara det återstående provet vid -80 °C. Tillsätt 0,2 volymer (80 μL) kloroform, virvel i 15 s och inkubera sedan i 20 minuter vid 4 °C. Centrifugera vid 13 000 × g i 20 min vid 4 °C.</li>
		<li>Överför det vattenhaltiga (klara vätska) skiktet till ett nytt mikrocentrifugrör. Förvara det återstående gränssnittet och den rosa vätskan i frysen -80 °C. Dessa fraktioner innehåller DNA och proteiner33,36.</li>
		<li>Tillsätt en lika stor mängd isopropanol (~200 μL) och 2,6 μL glykoprecipitant (15 mg ml-1)37. Blanda väl och inkubera vid -20 °C i minst 1 timme, följt av 4 °C i 10 minuter för att fälla ut RNA. OBS: Protokollet kan pausas här genom att inkubera prover vid -20 °C över natten istället för 1 h.</li>
		<li>Centrifugera vid 13 000 × g i 20 min vid 4 °C. Ta bort supernaten utan att störa pelleten. Återanvänd pelleten i 50 μL diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlat vatten och tillsätt en lika stor volym (50 μL) RNase-fritt 5 M ammoniumacetat och 2,5 volymer (250 μl) på 100 %etanol 7,38. OBS: Ammoniumjoner hämmar polynukleotidkinas om de används i nedströms38. Blandningen fäller ut RNA samtidigt som deoxynukleosid triphosfater och oligosaackarider lämnar i lösning38.</li>
		<li>Blanda väl och inkubera vid -20 °C i minst 1 timme, följt av 4 °C i 10 minuter för att fälla ut RNA. OBS: Protokollet kan pausas här genom att inkubera prover vid -20 °C över natten istället för 1 h.</li>
		<li>Centrifugera vid 13 000 × g i 20 min vid 4 °C. Tvätta pelleten med 1 ml kall (-20 °C), nygjord 75% etanol. Centrifugera vid 8 000 × g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernaten med en P10-pipett för att undvika att störa pelleten.</li>
		<li>Lufttorka pelleten i 10-15 min tills det inte finns någon kvarvarande etanol. Återanvänd pelleten i 50 μL DEPC-behandlat vatten, tillsätt 5 μL 10x DNase-buffert + 1 μL DNase (2 enheter μL-1)och inkubera vid 37 °C i 30 min.</li>
		<li>Tillsätt 0,1 volymer (5,6 μL) DNase inaktiveringsreagens, inkubera vid rumstemperatur i 5 min och blanda försiktigt varje minut. Centrifugera vid 13 000 × g i 2 min och överför supernatant till ett nytt rör (~ 50 μL). Placera röret på is omedelbart medan du förbereder RT-qPCR- eller RT-LAMP-reaktionerna eller förvara det i en frys med -20 °C. OBS: Utför RNA-isolering i ett ampliconfritt rum för att undvika överföringskontaminering.</li>
	</ol></li>
	<li>Multiplex omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP)<ol>
<li>Förbered en 20X primerblandningslösning (tabell 1) för varje uppsättning primers (tabell 2). Förbered RT-LAMP-reaktionsblandningen (tabell 3) vid rumstemperatur med 10 % övervolym för att ta hänsyn till rörförlust. OBS: Kolorimetriska LAMP 2X master mix med Antarktis termolabila uracil-DNA glykosylas (UDG) förhindrar förstärkning av DNA-kontaminering från tidigarereaktioner 20,28.</li>
		<li>Virvla och snurra ner blandningen. Dispensera 20 μL av blandningen i varje reaktionsrör: prov, spikad, positiv kontrolloch negativ kontroll. Inkubera reaktionerna i rören vid rumstemperatur i 10 minuter så att UDG kan agera på potentiell överföringskontaminering.</li>
		<li>Tillsätt 5 μL RNA till provreaktionen, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopior) syntetiskt SARS-CoV-2 RNA till den spikade reaktionen, 2,5 μL (450 kopior) syntetisk sars-cov-2 RNA till den positiva kontrollreaktionen och 5 μL H2O till den negativa kontrollreaktionen. Blanda väl och snurra ner reaktionerna; tina upp allt RNA på is.</li>
		<li>Medan termocyklisten, eller vattenbadet, värms upp till 65 °C, låt alla reaktioner förbli vid rumstemperatur. UDG kommer att inaktiveras vid >50 °C. Placera reaktionerna i termocyklisten (använd värmelocket), inkubera vid 65 °C i 40 minuter och låt reaktionerna nå rumstemperatur (~22 °C i 5 min) eller svalna på is i 1 minut. Analysera resultaten med hjälp av den kolorimetriska funktionen (enkel observation) eller genom att köra produkterna i en agarose gel. OBS: Även om detektionsgränsen (LOD) är 10 kopior per reaktion, ökar detektionsfrekvensen när kopieringsnumret närmar sig 500 kopior per reaktion (figur 3A). För kolorimetrisk observation, observera att ett negativt resultat indikeras av rosa (pH = 8,8), medan ett positivt resultat indikeras med gult (pH = 5) (Figur 3B). Det kolorimetriska alternativet undviker öppnandet av RT-LAMP-rören efter förstärkning, vilket minskar volymen på RT-LAMP-produkterna i arbetsmiljön och överföringskontaminering. För gelelektrofores, förbered en 1,5% agarosgel med 1X DNA-gelfläck i 0,5% Tris/Borate/EDTA (TBE) buffert. Belastning 25 μL av reaktionen + 5 μL 6X belastningsfärg i varje brunn. Kör gelén på 100 V i 60 min. En molekylär markör behövs inte eftersom positiva prover visar ett stegmönster (figur 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Alla författare förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen.

Medborgarforskarengagemang. Medborgarforskare rekryterades för att svabba ytor i hela San Diego County för att ta prover och upptäcka närvaron av SARS-CoV-2 i stadsmiljön. Majoriteten av de levererade provtagningssatserna (70 %) återlämnades till laboratoriet, och av dessa var nästan alla prover fullständiga (91 %) (Figur 3A,B och tabell 4). Volontärer kan enkelt begära leverans/ upphämtning av kit via den webbaserade plattformen, och programvaran för leveransvägsplanering meddelade medborgarforskare om uppskattade ankomsttider, båda sannolikt signifikanta faktorer för den observerade framgången. Den genomsnittliga tiden från det att satsen levererades till medborgarforskaren till när den återlämnades till laboratoriet var 8 dagar, med en median på 3 dagar och ett intervall på 1-64 dagar (figur 3A och tabell 4). Mer frekventa påminnelser till volontärer skulle sannolikt minska denna fördröjningstid.
Datainsamlingsplattformen användes framgångsrikt av en stor majoritet av användarna (73%) (Tabell 4). Även om medborgarforskarnas ansträngningar inte mättes, visade fälttester att datainsamlingsplattformen avsevärt minskade den ansträngning och tid som krävdes för att korrekt slutföra provinsamlingen. Att minska mängden bokföring uppmuntrade således medborgarforskarengagemang. Den webbaserade plattformen syftade till att övervinna demografiska begränsningar genom att tillhandahålla en flerspråkig neural maskinöversättningstjänst och genom att tillhandahålla grafiska och audiovisuella protokoll på engelska och spanska. Detta var endast delvis framgångsrikt eftersom färre prover samlades in från både South Bay och North County där större delen av länets latinamerikanska / latinobefolkning bor45. Dessa områden hyste också 63% (1 700 fall per 100 000) av de totala COVID-19-fallen i San Diego County med den högsta prevalensenav sjukdomen 46 och antalet sjukhusvistelse (62%)47,48. Även om de flesta av proverna kom från Central County, samlades ett representativt antal in från de mest COVID-19-drabbade distrikten och endast en liten del av proverna var positiva, vilket tyder på att ytreservoarer av SARS-CoV-2 i stadsmiljön är relativt sällsynta.
Provbehandling. Provtagningssvabbar var våta med SDS, som inaktiverade viruset genom att störa dess kuvert och stabiliserade det nakna RNA genom att veckla ut RNases32. Bekvämt under uppsamlingen rengjorde tvättmedlet i svabbprovet den provsatta ytan. Miljöprover innehåller ofta mycket små mängder RNA. För att maximera återhämtningen utfördes RNA-isolering med hjälp av en GITC-baserad, kolumnfri, råextraktionsmetod. GITC, ett starkt chaotropt medel, stör vätebindningarna som upprätthåller proteinveckning (dvs. hydrofobisk effekt). Denna åtgärd resulterar i inaktivering av viruspartiklar, och RNA förblir stabil på grund av hämningen av RNAses34,35,36. GITC-lösningen behöll stabiliteten hos RNA-proverna utan strikta överväganden i kylkedjan, vilket gjorde det möjligt för medborgarna att behålla proverna vid rumstemperatur om en frys för de medföljande isförpackningarna inte fanns tillgänglig. För att minska den potentiella fara som detta reagens utgör när direkt hud- eller slemhinnakontakt uppstår, blev medborgarna medvetna om dessa risker genom att inkludera ett materialsäkerhetsdatablad som finns i satsen och en varningstätning placerades i lådan som innehåller rören.
Den råa GITC-kloroform extraktionsmetoden hjälpte återvinning av spår av RNA från svabbproverna, och som framgår av förstärkningen av spikade prover, hämmare kvarstod sällan i proverna efter extraktion. Prover, som var negativa för SARS-CoV-2 och visade ingen RT-LAMP hämning, representerade verkliga negativa eller hade ett lägre kopieringsnummer än LOD vid 100% frekvens. Omvänt innebär detektion av viralt RNA på en yta inte direkt risk för överföring genom kontakt eftersom virusets smittsamhet från positiva prover måste testas. En snabb miljökontroll, som inte begränsas av tillgången till sofistikerade förnödenheter eller högkvalificerad personal, är avgörande för att bedöma om ytor utgör en virusreservoar och för bättre direkta förebyggande och inneslutningsinsatser.
RT-LAMP valdes ut som den bästa metoden som lämpar sig för den föreslagna detektionsledningen. Det visade sig vara en snabb och billig metod som var mycket resistent mot de flesta av de återstående hämmarna och lika känslig och specifik som andra RT-qPCR-metoder. På grund av deras användning i kliniska inställningar under SARS-CoV-2-pandemin påverkades tillgängligheten av RT-qPCR-kit av global efterfrågan. Dessutom var RT-qPCR-tekniker - även de som formulerades för att motstå hämmare - känsliga för ämnen som ingår i de miljöprover som samlats in av en pilotkohort av medborgarforskare, även efter användning av andra gemensamma strategier för att minska hämmarkonkurrensen förenzymbindning 49. Dessa resultat bekräftas av en ny studie som jämförde båda metoderna för att upptäcka SARS-CoV-2 på svabbprover från godis hanteras av COVID-19 patienter och fann över 83% resultatöverensstämmelse, med 25% lägre hämning i prover analyseras av RT-LAMP15. Dessutom minskade GITC-kloroform råextraktion, tillsammans med RT-LAMP, kostnaden för reagenser och leveranser med 42% jämfört med RNA-kitextraktion och RT-qPCR (Materialförteckning).
Denna metod möjlige analys av hög genomströmning av tusentals ytsvabbprover. Upp till 80 pooler, som representerar 640 prover, bearbetades på 2 dagar från RNA-extraktion till SARS-CoV-2-detektion av RT-LAMP. Det föreslagna protokollet är semiquantitative, begränsat till detektion av viralt RNA, och indikerar inte förekomsten av smittsamma viruspartiklar. Ytterligare analys krävs för att bedöma risken för överföring av SARS-CoV-2 från infekterade fomites som finns på de swabbed ytorna.
Den här studien presenterar ett protokoll för att snabbt skapa en teststrategi som innehåller ett effektivt arbetsflöde när du står inför en hälsokris med en smittsam sjukdom. Det föreslagna provtagningsprotokollet är enkelt och använder förnödenheter som ofta finns i hushållen, och metoden för viral detektion utförs på utrustning som finns tillgänglig i grundläggande laboratoriemiljöer, t.ex. Kostnaderna för RT-LAMP-reagenser är betydligt lägre än de som behövs för RT-qPCR och mindre mottagliga för scenarier med hög global efterfrågan. Denna studie fungerar som ett ramverk för bedömning av miljövirusreservoarer i framtida epidemiutbrott och globala pandemier.

SARS-CoV-2 tros huvudsakligen överföras via inandning av förorenade aerosoler och droppar från direktkontakt med infekterade individer1,2,3,4. Under de inledande faserna av den globala COVID-19-pandemin fokuserade dock insatserna för att kontrollera överföringen av SARS-CoV-2 starkt på desinfektion av ytor, handtvätt och sanering. I slutet av 2020 bedömde överföringsriktlinjer från Världshälsoorganisationen (WHO)5 och U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC)6 luftburen överföring som en fara främst vid nära kontakt (<2 m) med en smittad person eller i närvaro av aerosolgenererande medicinska procedurer. Självinokulering efter kontakt med förorenade ytor eller inandning av aerosoliserade fomites har ännu inte uteslutits som en överföringsväg av SARS-CoV-2.
Covid-19-fall har rapporterats där luftburen överföring verkar osannolik7,8. SARS-CoV-2 virions förblir smittsamma på koppar i upp till 8 h, på kartong och rostfritt stål i upp till 24 h och på plast i upp till 48 h9. I kryssningsfartygshytter upptäcktes SARS-CoV-2 RNA 17 dagar efter att passagerarna hade avgått7. Luft- och ytprover från sjukhus och masstransiteringssystem har testats positivt för SARS-CoV-2 och andra coronavirus8,10,11,12,13,14. En studie utförd på ytterförpackningen av Halloween godis hanteras av asymtomatiska och måttliga /milt symptomatiskt COVID-19 patienter, drog slutsatsen att kombinationen av handtvätt av hanteraren och tvättning av godis med hand tvål minskade SARS-CoV-2 RNA till under tröskelvärde nivåer15.
Flera metoder för SARS-CoV-2 diagnostik har publicerats baserat på realtid omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR)16,17,omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP)11,18,19,20,21och CRISPR-Casteknik 18,19,22,23. De flesta kräver RNA-extraktionssatser som ofta är en bristvara under perioder med betydande global efterfrågan, och mycket få har använts för miljöscreening av viruset24. Detektion av SARS-CoV-2 RNA med RT-LAMP har visat sig vara över 83% konkordans till att använda RT-qPCR. Dessutom resulterade RT-LAMP i en minskning av de ofullständiga resultaten med 25 % jämfört med RT-qPCR15.
RT-LAMP är en enkel teknik som använder en omvänd transkription för att syntetisera cDNA från en RNA-mall25, följt av en DNA-polymeras med stark strandförskjutningsaktivitet som syntetiserar DNA vid konstant temperatur (dvs isotermisk förstärkning)26. Högre specificitet av viral genomdetektering uppnås med hjälp av fyra eller sex primers som känner igen sex eller åtta regioner av mål-DNA. Förstärkning initieras från en intern primer och ger en halvdubbelsträngad DNA-struktur. Den ledande strängen förstärks sedan av en yttre primer. Dessa förstärkningar upprepas för de omvända primersna. Interna och yttre primers i vardera änden har en intern omvänd självkomplingande plats som bildar en slinga i förstärkningsprodukten26,27. Vid isotermisk strängförskjutning genererar asynkron DNA-syntes stora mängder förstärkt produkt där kontinuerlig polymerisation förstärker signalen på så få som 10 kopior per reaktion11,20,28. Den kolorimetriska RT-LAMP-blandningen är svagt buffrad och använder fenolrött som pH-indikator. Eftersom polymeraset innehåller en nukleotid frigör den en proton, och tillräckligt med protoner kommer att ändra lösningens pH samt dess färg från rosa till gul11,20,28,29.
RT-LAMP utvecklades för påvisande av myggburna sjukdomar i perifera vårdinrättningar som saknar fullt utrustadelaboratorier 25 och för snabb upptäckt av andra RNA-virus som humant immunbristvirus30. De mest utsatta befolkningsgrupperna i epidemiutbrott – enligt WHO:s definition – saknar ofta tillräckliga ekonomiska resurser och lämplig utrustning för att utföra upptäckt (FN:s globala folkhälsoagenda). I den nuvarande SARS-CoV-2-pandemin har leveranser som svabbprover av medicinsk kvalitet och reagenser för RNA-extraktionssatser inte kunnat möta den globala efterfrågan, särskilt i icke-tillverkningsländer. Det föreslagna protokollet använde en guanidinium tiocyanate (GITC)-baserade rå RNA extraktion, som effektivt bevarade RNA på ett kallt-kedja oberoende sätt och avsevärt minskade persistensen av inhibitorer från provet. Dessutom är GITC-kloroform extraktionsprotokollet baserat på separationen av RNA från DNA och proteiner följt av respektive nederbörd, vilket möjliggör återvinning av det mesta av det genetiska materialet. Dessa fördelar överväger de potentiella farorna för medborgarforskare som hanterar kemikalien om åtgärder vidtas för att på lämpligt sätt informera dem om riskerna.
Det föreslagna arbetsflödet använder material och reagenser som är av allmän användning. Det kräver utrustning som finns i grundläggande, ofta lantliga, laboratoriemiljöer. Dessa metoder är billiga, mycket resistenta mot hämmare som ofta finns i miljöprover eller prover som inte kan bearbetas med extraktionssatser och eliminerar behovet av en högprecisions termocyklist. Denna studie presenterar en pipeline för provtagning och detektion av SARS-CoV-2 från miljöreservoarer vid gemensamt vidrörda och sällan desinficerade ytor hos hushåll och stadsmiljön.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

För att kontrollera samhällsöverföringen av allvarliga akuta respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) under den globala pandemin 2020 implementerade de flesta länder strategier baserade på direkt mänsklig testning, ansiktsskydd och ytdesinfektion. Under antagandet att huvudvägen för överföring omfattar aerosoler och luftvägsdroppar har insatserna för att upptäcka SARS-CoV-2 hos fomiter fokuserat på platser som misstänks vara av hög prevalens (t.ex. sjukhusavdelningar, kryssningsfartyg och masstransportsystem). För att undersöka förekomsten av SARS-CoV-2 på ytor i stadsmiljön som sällan rengörs och sällan desinficeras, värvades 350 medborgare från san diego county. Totalt samlade dessa medborgarforskare in 4 080 prover. En onlineplattform utvecklades för att övervaka leverans och upphämtning av provtagningskit samt för att samla in exempeldata. Provtagningssatserna byggdes mestadels av förnödenheter som fanns i pandemistressade butiker. Prover bearbetades med reagenser som var lätta att komma åt trots den återkommande försörjningsbristen. De metoder som användes var mycket känsliga och resistenta mot hämmare som ofta förekommer i miljöprover. De föreslagna experimentella design- och bearbetningsmetoderna lyckades engagera många medborgarforskare som effektivt samlade prover från olika ytor. Arbetsflödet och metoderna som beskrivs här är relevanta för att kartlägga stadsmiljön för andra virus, som är av folkhälsoproblem och utgör ett hot mot framtida pandemier.

Prover som samlats in av medborgarforskare för detektion av SARS-CoV-2. Under en åttamånadersperiod (mitten av mars till tredje veckan i november 2020) godkändes 482 medborgare för att delta i detta projekt, varav 350 (73 %) begärde ett kit. Totalt levererades 362 satser (dvs. vissa deltagare begärde flera kit) och 246 (70%) returnerades (figur 4A,B). Alla 4 080 prover i dessa satser bearbetades. Samlingsplatserna fördelades över distrikten North Coastal, North Central, Central och Southern i länet, samt några i de östra distrikten (Figur 4A). Dessa distrikt har den högsta befolkningstätheten i San Diego County och de mest dokumenterade COVID-19-fallen, som rapporterats av San Diego Human Health Service Agency39.
Medborgarna begärde upphämtning av de flesta provsatser (dvs. genomsnittlig framgångsgrad: 70,4 %). Varje dag begärdes 1-16 satser och 0-14 satser återlämnades till laboratoriet (figur 4B). En undersökning av medborgarforskarna visade att insamlingen av ett komplett kit (16 prover) tog 1-3 h fördelat över i genomsnitt 8 dagar (figur 4A och tabell 4). De allra flesta satserna var kompletta (91,1 %), vilket innebär att de innehöll en bomullspinne i alla 16 provrören, och motsvarande provtagningsdata laddades upp till LIMS (figur 4A och tabell 4).
Detektion av SARS-CoV-2 med GITC-kloroform extraktion och multiplex omvänd transkriptas loop-medierad isotermisk förstärkning (RT-LAMP). För den kolorimetriska RT-LAMP-analysen användes två uppsättningar primers11,20,28 för att rikta in sig på nukleocapsid(N2)ochkuvertet (E1)gener (tabell 2). De sekvenser som erkänns av dessa primers är i samma region som primers och sonder godkända av CDC40 och Europeiska unionen (EU)41 för mänsklig diagnos av COVID-19 av RT-qPCR. Dessa resultat bekräftar vad Zhang et al.28 beskrev, där tillsats av 60 mM guanidinhydroklorid till reaktionen ökar LOD när den körs i multiplex. LOD med en frekvens av 100% var 500 kopior per 25 μL reaktion (Figur 3A, B). I den kolorimetriska RT-LAMP ÄNDRADE positiva prover färg från rosa till gult på grund av ett pH-skift från ~8 till 5,5 (figur 3B). När reaktionen blev orange vid låga kopior gjordes prover i en 1,5% agarose gel för att bekräfta att dessa var positiva och resulterade i ett stegliknande mönster (Figur 3C). RT-LAMP användes för att upptäcka SARS-CoV-2 i poolade RNA-prover.
För att kontrollera för falska negativ på grund av reaktionshämmare testades varje prov i en ytterligare reaktion spetsad med 500 kopior av syntetisk sars-cov-2. Positiva poolade prover dereplicerades genom att isolera RNA för varje enskilt prov i poolen och köras i en RT-LAMP reaktion för att bestämma identiteten på det positiva provet. Detekteringsresultaten laddades sedan upp till LIMS där det unika prov-ID:t parades ihop med informationen om datum, tid, GPS-koordinater, plats och bild av provet.
Realtids- och traditionella RT-PCR-metoder: hämning med provföroreningar. För att välja den bästa metoden som lämpar sig för den föreslagna detektionsledningen testades andra RNA-förstärkningsmetoder med miljöprover som samlats in av en pilotkohort av medborgarforskare. Exempel på resultaten av var och en av dessa metoder presenteras i figur 5 för att skildra deras känslighet för miljöhämmare och bakgrundssignalljud vid låga viruskopieringsnummerkoncentrationer.
Sex RT-qPCR-formuleringar (Table of Materials) som godkänts av CDC och WHO testades för detektion av viruset på miljöprover. Protokoll följdes enligt tillverkarens instruktioner samt CDC riktlinjer för detektion av SARS-CoV-2 i kliniska inställningar40. Reaktioner som innehåller olika koncentrationer av syntetiska SARS-CoV-2 RNA kontroller spikades i swabbed-ytan prover efter rå RNA isolering. Alla masterblandningar var känsliga för hämmare vid LOD-koncentrationer av den positiva kontrollen (figur 5A).
För att kringgå hämmare av dessa realtidstekniker testades ett traditionellt RT-PCR-system. Ett RT-PCR-system i ett steg (Materialförteckning) användes för att förstärka nukleocapsidgenen med hjälp av primeruppsättningarna N1, N2och kuvertgenen med hjälp av primeruppsättningen E1 som godkänts av CDC (USA) respektive ECDC (EU) (tabell 2). Protokoll följdes enligt tillverkarens instruktioner samt CDC riktlinjer för detektion av SARS-CoV-2 i kliniska inställningar40. Primern sätter N1 och N2 designade av CDC ger en ~ 70 bp-produkt; Positiva resultat med lågt antal kopior skildes dock inte från förstärkningsbakgrundsljudet från den negativa kontrollen (figur 5B),som introducerade falska positiva resultat. Produkten av E1 primers hade en svag signal vid lågt kopieringsnummer (Figur 5B), vilket införde falska negativ i resultaten. Dessutom var den testade RT-PCR-metoden fortfarande känslig för hämmare som fanns i miljöproverna (data som inte visades).
Andra metoder har utvecklats för att upptäcka mycket små mängder målsekvens. En av dessa metoder är Rolling Circle Amplification (RCA), varefter erkännande av målsekvensen, RNA eller DNA, av en specifik linjär sond, en ligase cirkuläriserar mallen. Med hjälp av primers som är utformade för att hybridisera med sonden förstärker ett DNA-polymeras med strandförskjutningsaktivitet sonden i en isotermisk reaktion42. Det är sonden som identifierade målet, som förstärks, och inte målsekvensen, vilket gör denna metod mycket känslig43. Wang et al.44 publicerade ett RCA-protokoll för direkt detektion av SARS-CoV-1 RNA. Metoden ändrades för att använda primers som är specifika för SARS-CoV-2. Tyvärr, i icke-mallkontrollen (NTC), cirkuläriserar och ger sonden produkt i avsaknad av RNA-mall, även när man använder en mängd olika ligaser, inklusive en SNP-känslig ligas. I avsaknad av ligase visade NTC inte förstärkning från den linjäriserade sonden (figur 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62379/62379fig1v3.jpg"> Figur 1:Webbaserad provtagningsplattform med exempelinsamlingsdatagränssnitt för mobila enheter. Plattformen användes för provsatsleverans / upphämtningsbegäran och exempeldataöverföring. Plattformen innehöll detaljerade engelsk-spanska grafiska och audiovisuella provtagningsprotokoll. (B) Vy över mobila enheter som används för att ladda upp exempeldata: datum, tid, GPS-koordinater, exempel på webbplatsbeskrivning och en bild av insamlingsplatsen. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; GPS = Globalt positioneringssystem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62379/62379fig1v3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62379/62379fig02.jpg"> Bild 2:Provuppsamlingssats. Medborgarforskare fick en kylare som innehöll två ispaket, ett säkerhetsdatablad för att informera volontärer om farorna med att hantera GITC-lösningen, ett detaljerat provtagnings- och maskbärande protokoll, en KN95-mask, en avfallspåse, en sprayflaska med handsprit, en sprayflaska med 0,5% SDS, 16 par handskar, en liten påse med 16 tandpetare och 16 polyestersvabbar, 16 förmärkta mikrocentrifugrör som innehåller 200 μL GITC-lösning, en låda som innehåller provtagningsrören och en påse som används som sekundärbehållare för rörlådan i händelse av spill. Förkortningar: GITC = guanidiniumtiocyanat; SDS = natrium dodecylsulfat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62379/62379fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62379/62379fig03.jpg"> Figur 3:Multiplexerad analys av omvänd transkriptionsslinga med mediaerad isotermisk förstärkning (RT-LAMP). Multiplexerade reaktioner med primers för SARS-CoV-2 nukleocapsid (N2) och kuvert(E1) gener för att upptäcka så få som 10 kopior av viruset i reaktionen. Syntetisk sars-cov-2 RNA användes som positiv kontroll. (A) Detektionsfrekvens i multiplex kolorimetrisk RT-LAMP av SARS-CoV-2 vid olika genomkopienummer per reaktion. Medelvärdet av fem replikat i rosa. B)Gräns för detektion (LOD) för SARS-CoV-2 i multiplex kolorimetrisk RT-LAMP. gul = positiv (pH ~5); rosa = negativ (pH ~8). C)Stege mönster av positiva SARS-CoV-2 RT-LAMP reaktioner i 1,5% agarose gel elektrofores. Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; rxn = reaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62379/62379fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62379/62379fig4v3.jpg"> Figur 4: Plats för medborgarforskares provtagningssatser i San Diego County och framgångsgraden för begärda kit.  Det blå cirkeldiagrammet visar andelen satser som tog olika dagar från det att de levererades till medborgarforskarna till när de återlämnades till laboratoriet. Antal dagar inom parentes. Det orange cirkeldiagrammet visar procentandelen satser med olika antal slutförda prover från totalt 16 prover. Antal ifyllda prover som innehåller en bomullspinne inuti provröret och motsvarande provtagningsdata som laddats upp till LIMS inom parentes. B)Procentandel satser som returnerades till laboratoriet (punkterna) och det totala antalet begärda satser (stänger), i förhållande till det datum då satsen begärdes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62379/62379fig4v3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62379/62379fig05.jpg"> Figur 5: Alternativa metoder för SARS-CoV-2 RNAdetection. (A) RT-qPCR-detektion av genen SARS-CoV-2 nukleocapsid(N)med hjälp av primeruppsättningen N2. Poolade miljöprover spetsade med 900 (gröna) eller 9 (orange) kopior av SARS-CoV-2. Positiva kontroller av samma kopieringsnummer i blått. Pil indikerar minskningen av fluorescensdetektering av positiv kontroll med lågt kopieringsnummer när miljöprov finns. (B) Traditionell RT-PCR-detektion av SARS-CoV-2. Topp: RT-PCR-produkter av nukleocapsidgenen med primeruppsättningarna N1 och N2. En svag bakgrundssignal observeras i kontrollen utan mall. Botten: RT-PCR-produkter av kuvertgenen med primeruppsättningen E1. Mycket låg signal observeras vid LOD-koncentrationen. Blå pilar visar förväntad positiv produkt: (topp) ~70 bp och (botten) 113 bp i 2% agarose gel elektrofores. C)RCA för SARS-CoV-2RNA. Cirkulär sond förstärker i närvaro av ligase och frånvaro av RNA-mall (NTCcir); I avsaknad av ligase och RNA mall linjär sond inte förstärka (NTClin). Förkortningar: SARS-CoV-2 = allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2; RFU = relativa fluorescensenheter; bp = baspar; rxn = reaktion; MM = molekylär markör; RT-PCR = omvänd transkription av polymeraskedjereaktion; RT-qPCR = kvantitativ RT-PCR i realtid; RCA = förstärkning av rullande cirkel; NTC= kontroll utan mall. LOD = detektionsgräns; rxn = reaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62379/62379fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>abc-bok</td>
			<td>20X koncentration (μM)</td>
			<td>1X koncentration (μM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fip</td>
			<td>32</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>BIP</td>
			<td>32</td>
			<td>1.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>F3 (F3)</td>
			<td>4</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>B3 (B3)</td>
			<td>4</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>LoopF (slingor)</td>
			<td>8</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>LoopB (slinga)</td>
			<td>8</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Formulering för 20X RT-LAMP primerblandning. I RT-LAMP-reaktionen känner 6 primers igen 8 regioner av det riktade DNA. Förkortningar:omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning; FIP = framåt inre primer; BIP = bakåt innerprimer; F3 = främre deplacementprimer; B3 = primör för bakåtförskjutning; LoopF = främre loopprimer; LoopB = bakåtslinga primer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>abc-bok</td>
			<td colspan="4">sekvens</td>
			<td>mål</td>
			<td>Produktstorlek</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">RT-LAMPA9,18,19
</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-F3</td>
			<td colspan="4">TGAGTACGAACTTATGTAKTCAT</td>
			<td rowspan="6">E</td>
			<td rowspan="12">stegliknande mönster</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-B3</td>
			<td colspan="4">TTCAGATTTTTAACACGAGAGT (OLIKA BETYDELSER)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-FIP</td>
			<td colspan="4">ACCACGAAAGCAAGAAAAGAAGAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-BIP</td>
			<td colspan="4">TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-loopb</td>
			<td colspan="4">GCGCTTCGATTGTGTGCGT</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1-LoopF</td>
			<td colspan="4">CGCTATTAACTATTAACG (olika)</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-F3 (på andra)</td>
			<td colspan="4">ACCAGGAACTAATCAGACAAG (PÅ ANDRA)</td>
			<td rowspan="6">N</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-B3 (på 2-B3)</td>
			<td colspan="4">GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-FIP (N2-FIP)</td>
			<td colspan="4">TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-BIP (bip)</td>
			<td colspan="4">CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-LoopF (N2-LoopF)</td>
			<td colspan="4">GGGGGCAAATTGTGCAATTTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2-LoopB (n2-loopb)</td>
			<td colspan="4">CTTCGGGAACGTGGTTGACC (CTTCGGGAGTGGTTGACC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">RT-qPCR38
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N1-F</td>
			<td colspan="4">GACCCCAAAATCAGCGAAAT (GACCCCAAAATCAGCGAAAT)</td>
			<td rowspan="3">N</td>
			<td rowspan="3">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N1-R</td>
			<td colspan="4">TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N1-P</td>
			<td colspan="4">5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N2-F</td>
			<td colspan="4">TTACAAACATTGGCCGCAAA (OLIKA)</td>
			<td rowspan="3">N</td>
			<td rowspan="3">67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N2-R</td>
			<td colspan="4">GCGCGACATTCCGAAGAA (OLIKA)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2019-nCoV_N2-P</td>
			<td colspan="4">5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">RT-PCR39
</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1_Sarbeco_F</td>
			<td colspan="4">ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT (OLIKA BETYDELSER)</td>
			<td rowspan="2">E</td>
			<td rowspan="2">113 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1_Sarbeco_R</td>
			<td colspan="4">ATATTGCAGCAGTACGCACACACA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Primers som används för RT-LAMP, RT-qPCR och RT-PCR. Primersekvenser, målgen, förväntad produktstorlek och motsvarande referens listas. Förkortningar: RT-LAMP = omvänd transkription loop-medierad isotermisk förstärkning; RT-PCR = omvänd transkription av polymeraskedjereaktion; bp = baspar; RT-qPCR = kvantitativ RT-PCR i realtid; E1 = kuvertgen; N2 = nukleocapsid gen; F = framåt primer; R = omvänd primer; P = Sond; FIP = framåt inre primer; BIP = bakåt innerprimer; F3 = främre deplacementprimer; B3 = primör för bakåtförskjutning; LoopF = främre loopprimer; LoopB = bakåtslinga primer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>reagens</td>
			<td>Volym (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>WarmStart kolorimetrisk lampa 2X Master Mix med UDG</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 Primer Mix (20x)</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1 Primer Mix (20x)</td>
			<td>1.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Guanidinhydroklorid (600 mM)*</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mål-RNA</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nukleasfri H2O</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Total volym</td>
			<td>25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: Reaktionsmästareblandning för multiplex kolorimetrisk RT-LAMP. (*) Guanidinhydroklorid har visat sig öka reaktionens känslighet och hastighet med en okarakteriseradmekanism 28. Förkortningar: LAMP = loopmedierad isotermisk förstärkning; UDG = uracil-DNA glykosylas; N2 = nukleocapsid gen; E1 = kuvertgen; DEPC = diethylpyrocarbonat.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Godkända medborgare</td>
			<td>Medborgare som begärde ett kit</td>
			<td>Levererade satser</td>
			<td>Returnerade provsatser</td>
			<td colspan="2">Dagar avsedda för provtagning</td>
			<td>% Kompletta satser</td>
			<td>% ofullständiga satser</td>
			<td>Bearbetade prover</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">482</td>
			<td rowspan="2">72.6% (350/482)</td>
			<td rowspan="2">362</td>
			<td rowspan="2">70.4% (255/362)</td>
			<td>betyda</td>
			<td>8</td>
			<td rowspan="2">91.1 (224/246)</td>
			<td rowspan="2">8.9 (22/246)</td>
			<td rowspan="2">4,080</td>
		</tr>
<tr>
<td>median</td>
			<td>3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4:Swabbing för SARS-CoV-2 med siffrorna. Framgångsgrad för uppsökande verksamhet och provtagning. Förkortning: SARS-CoV-2 = svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Ett medborgarforskningsprojekt utformades för att rekrytera San Diego-invånare för att samla in miljöprover för SARS-CoV-2. En flerspråkig webbaserad plattform skapades för dataöverföring med hjälp av ett användarvänligt gränssnitt för mobila enheter. Ett laboratorieinformationshanteringssystem underlättade insamlingen av tusentals geografiskt olika prover med resultatspårning i realtid.

Swabbing the Urban Environment - En pipeline för provtagning och detektion av sars-cov-2 från miljöreservoarer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Den här studien presenterar ett nytt arbetsflöde för att upptäcka SARS-CoV-2 på ytor som sällan rengörs i stadsmiljön, till exempel gaspumphandtag, lekplatser och bankomater. I en pandemi är det ont om förnödenheter. Vi använder lättåtkomliga material och reagenser och utrustning som finns i grundläggande laboratoriemiljöer.Vi använder en extraktionsmetod som bevarar RNA utan en kall kedja och en detektionsmetod som är resistent mot hämmare. Detta protokoll är av folkhälsointresse. Det ger ett ramverk för bedömning av miljövirusreservoarer för den nuvarande COVID-19-pandemin och andra smittämnen under framtida globala utbrott.Rekrytera medborgarforskare med hjälp av en direkt och tydlig uppmaning till åtgärder som släpps via lokala och sociala medier. Skapa ett handtag på sociala medier för att ansluta ämnet till innehåll på sociala medier. Skapa en länk till SMP, som ger ett flerspråkigt plugin-program för att möjliggöra navigering på flera språk för individer att ansöka om att delta i miljöprovtagningsinsatsen genom att svara på biosäkerhetsrelaterade frågor som anges i ett onlineformulär.Inkludera i provtagningsavsnittet grafiska och audiovisuella protokoll på engelska och spanska. Visualisera geospatiala data med hjälp av ett geospatialt programprogrammeringsgränssnitt som underlättas av en molndatorleverantör. Lagra de data som skickas till LIMS via SMP för att underlätta centraliserad lagring, spårning av bearbetningsarbetsflöden och hantering av logistiken.Förinläsningsinformation som exempelsats-ID, exempel-ID, datum, tid och globala positioneringssystemkoordinater för att aktivera datatypsefterlevnad och minimera felet. Inkludera en länk för begäran om upphämtning för deltagarna, som de kan använda när de har samlat in alla prover. Bygg ett kit som innehåller alla provtagningstillbehör, inklusive nödvändig personlig skyddsutrustning, som mask och handskar, ett provtagningsprotokoll och relevant information om biosäkerhet.Svabbprov desinficerade sällan ytor i hushåll och stadsmiljön genom att fukta en en centimeter kvadratisk polyesterabsorberande svabb med ett tvättmedel och svabba en yta på 10 centimeter i kvadrat. Med hjälp av en tandpetare, sänk ner varje provsvabb i det förmärkta röret som innehåller 200 mikroliter guanidiniumtiocyanat. Använd den medföljande masken och ett nytt par handskar för insamling av varje prov för att undvika korskontaminering.Efter avslutad provtagning, använd den medföljande handspriten. Förvara rören i fyra grader Celsius tills de transporteras till laboratoriet. När proverna anländer till laboratoriet, lagra dem på minus 80 grader Celsius.För att öka screeninghastigheten, bearbeta proverna i pooler. Om en pool är positiv, extrahera RNA för varje prov självständigt. Kombinera proverna från varje provtagningssats i två pooler genom att slå samman 50 mikroliter av vart och ett av de åtta proverna i ett mikrocentrifugrör och spara de återstående proverna vid minus 80 grader Celsius.Tillsätt 80 mikroliter kloroform och virvel i 15 sekunder. Inkubera sedan i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Centrifug vid 13 000 gånger G i 20 minuter vid fyra grader Celsius.Överför vattenskiktet till ett nytt mikrocentrifugrör. Förvara det återstående gränssnittet och rosa vätskan i minus 80 grader Celsius frys. Dessa fraktioner innehåller DNA och proteiner.Extrahera RNA från det återvunna vattenhaltiga skiktet med hjälp av en guanidinium tiocyanat baserade RNA rå extraktion protokoll. Förbered RT-LAMP-reaktionsblandningen vid rumstemperatur med 10% övervolym för att ta hänsyn till rörförlust. Tillsätt fem mikroliter RNA till provreaktionen och fem mikroliter RNA plus 2,5 mikroliter syntetisk sars-cov-2 RNA till den spikade reaktionen.Tillsätt 2,5 mikroliter syntetiskt SARS-CoV-2 RNA till den positiva kontrollen och fem mikroliter vatten till den negativa kontrollen. Blanda väl och snurra ner reaktionerna. För kolorimetrisk observation indikeras ett negativt resultat med rosa och ett positivt resultat indikeras av gult.Efter RT-LAMP, utför gelelektrofores. Fördelningen av provsamlingswebbplatser visas här. En majoritet av satserna var fullständiga och motsvarande data laddades upp till LIMS.Detektionsgränsen med en frekvens av 100%var 500 kopior per 25 mikroliter reaktion. I den kolorimetriska RT-LAMP ändrade positiva prover färg från rosa till gult på grund av ett pH-skift från åtta till 5,5. Vid låga kopieringsnummer togs prover på en agarosagel för att bekräfta det positiva med det resulterande stegliknande mönstret.RT QPCR-metoder testades med miljöprover. Alla master mixes var känsliga för inhibitorer vid låga kopia nummer koncentrationer av den positiva kontrollen. Vid låga koncentrationer av mallen visade traditionella RT PCR metoder falska positiva och falska negativa.Slutligen upptäckte en teknik som kallas rullande cirkelförstärkning små mängder av målsekvensen. Det visade dock förstärkning av sonden i avsaknad av en RNA mall. Det är mycket viktigt att offentliggöra en uppmaning till åtgärder som når alla sektorer i samhället, så provtagningen utgör verkligen risken för exponering för alla medlemmar i samhället.Detta ramverk detekterar SARS-CoV-2 genetiskt material. Studier för att testa viral livskraft är nästa steg.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

En icke-invasiv Hair provtagningsteknik för att med hög kvalitet DNA från Elusive små däggdjur

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Spårning av numeriska och strukturella förändringar i Alla 24 mänskliga kromosomer samtidigt enligt en ny OctoChrome FISH analys

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Produktion av Tissue Microarrays, immunohistokemi Staining och digitalisering inom Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Insamling, isolering och anrikning av naturligt förekommande Magnetotactic bakterier från miljön

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent däggdjursceller för kontinuerlig och övervakning i realtid av cytotoxicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Provtagning Blod från den laterala svansvenen av Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Kanalförbindelse kommunikationen mellan: En funktionell Biomarker att bedöma biverkningar av gifter och toxiner, och hälsoeffekterna av naturliga produkter

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studerar ribonucleotid införlivande: Strand-detektering av ribonukleotider i jäst genomet och mäta ribonucleotid-inducerad mutagenes

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-gjorts analys av Salmonella från mat och miljöprover

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

En arbetsbesparande och repeterbara touch-Force signalering Mutant skärm protokoll för studiet av Thigmomorphogenesis av en modell växt Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...