Name: swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Viral Bilgi Enstitüsü (VII) araştırmacıları Dr. Anca M. Segall, Willow Segall, Patricia L. Rohwer, Gary Rohwer, Cary L. Rohwer, Magda Silvia Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, Dr. Gregory Peters, Dr. Stuart A. Sandin ve Dr. Jennifer Smith'e çok sayıda örnek toplamak için zaman ayırarak teşekkür ediyoruz. Ayrıca San Diego Kaliforniya Tıp Fakültesi (UCSD) Pediatri Bölümünden Dr. Rob Knight, Dr. Jack Gilbert, Dr. Pedro Balda-Ferre ve Dr. Sarah Allard'a olumlu kontrolleri ve yararlı geri bildirimleri kolaylaştıranlar için teşekkür ederiz. Lojistik destek için Stacey Carota (SDSU Bilimler Koleji) ve Gina Spidel'e (SDSU) ve örnekleme protokolünün sanatı ve grafik tasarımı için Juan Rodríguez'e teşekkür ederiz. Tüm katılımcılara çok zor zamanlarda bu projeye olan bağlılıkları ve özverileri için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Dr. Jo Ann Lane (SDSU Bilimler Koleji) ve Ulusal Bilim Vakfı RAPID: Sars-CoV-2'nin Çevre Rezervuarları hibesinin cömert bir bağışı ile desteklendi (Ödül Numarası: 2030479).

Katalog numaraları, üretici ve ilgili maliyetler de dahil olmak üzere reaktiflerin ve sarf malzemelerinin ayrıntılı bir listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Kentsel çevrenin örneklemesi
<ol><li>Vatandaş bilim adamı sosyal yardım<ol><li>Yerel ve sosyal medya üzerinden yayınlanan doğrudan ve net bir eylem çağrısı kullanarak vatandaş bilim adamlarını işe alın. Konuyu sosyal medya içeriğine bağlamak için bir sosyal medya tanıtıcısı (örneğin, #swab4corona)oluşturun.</li>
		<li>Laboratuvar ekibi ile her bir vatandaş bilim adamı arasında doğrudan iletişim için, ilgi çekici bölgenin ana dillerini akıcı bir şekilde konuşarak (örneğin, San Diego County için İspanyolca ve İngilizce) yöneten bir e-posta hesabı oluşturun.</li>
		<li>Bir veritabanı, bir laboratuvar bilgi yönetim sistemi (LIMS) olarak hizmet vermek ve vatandaş bilim insanlarıyla iletişim kurmak için güvenli bir web tabanlı örnek yönetim platformu (SMP) oluşturun. NOT: SMP, kullanıcıların bir kit istediği, örnek toplama protokollerine eriştiği, örnek meta veriler gönderdiği ve tamamlanan örnek kitler için bir teslim alım istediği merkezi bir konum sağlar.</li>
		<li>Bireylerin çevrimiçi bir formda belirtilen biyogüvenlik ile ilgili soruları yanıtlayarak çevresel örnekleme çalışmalarına katılmak için başvurmaları için SMP (örneğin, https://demo.covidsample.org/) (Şekil 1)için bir bağlantı oluşturun.</li>
		<li>Bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan bir Kimlik Doğrulama Uygulama Programlama Arabirimi kullanarak SMP'ye güvenli erişim. Onaylanan kullanıcılara SMP'ye erişim izni verin. NOT: Kimlik doğrulama ve yetkilendirme için OAuth 2.0 protokolü31'in açıklaması için literatüre bakın. Vatandaş bilim adamı gönüllüleri için sürtünmesiz bir oturum açma işlemi sağlar. Ayrıca, kullanıcıların mevcut bir hesapla oturum açmasına izin vererek özel bir oturum açma çözümü oluşturma ve kullanıcı kimlik bilgilerini yönetme ihtiyacını ortadan kaldırır, bu da önemli miktarda zaman kazandırır ve katılımı teşvik eder. Son raporlara göre, seçilen bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı için sunulan ücretsiz e-posta hizmeti yaklaşık 1,5 milyar aylık aktif e-posta kullanıcısına sahiptir; katılım için bu hizmet sağlayıcısından bir e-posta hesabı gerektirmek cesaret kırıcı bir faktör olarak kabul edilir.</li>
		<li>Çalışmanın amacını ve biyogüvenlik konularını ilk kitlerini istemeden önce SMP'deki vatandaş bilim insanlarına açıklayın. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan çok dilli bir sinir makinesi çeviri hizmetinden herhangi bir dilde gezinmeyi etkinleştirmek için çok dilli bir eklenti sağlayın.</li>
		<li>örnekleme bölümüne İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokolleri ekleyin.</li>
		<li>Her kite benzersiz bir tanımlayıcı atayın ve kullanıcı arabirimini veri giriş işlemini kolaylaştırmak için Örnek Kimlik'e bağlı düğmeleri kullanacak şekilde tasarlayın (Şekil 1A).</li>
		<li>Teslimat/teslim alma rotalarını optimize etmek ve vatandaş bilim adamlarını tahmini varış sürelerini bildirmek için sürücüler tarafından kullanılacak bir mobil cihaz uygulamasına sahip bir teslimat rotası planlama yazılımı kullanın.</li>
		<li>LIMS platformunu bir PHP web hizmeti yığını üzerine oluşturun ve ticari bir barındırma platformunda barındırın (önerilen işletim sistemi, web sunucusu yazılımı ve veritabanı yazılımı Malzeme Tablosundabelirtilmiştir).</li>
		<li>Laboratuvar personelinin LIMS'de verileri hızlı ve kolay bir şekilde yönetmesini sağlamak için güvenli bir web tabanlı uygulama arabirimi sağlayın. Bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan bir veri Grafik Uygulama Programlama Arabirimi kullanarak veri görselleştirmesi sağlayın.</li>
		<li>Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan jeo uzamsal uygulama programlama arabirimini kullanarak jeo uzamsal verileri görselleştirin. (1) proje verilerinin merkezi olarak depolanmasını kolaylaştırmak için SMP aracılığıyla LIMS'ye gönderilen verileri depolamak; (2) örnek/veri işleme iş akışlarının izlenmesi; ve (3) vatandaş bilim insanlarına numune kiti dağıtımı lojistiğinin yönetimi.</li>
		<li>Gönderilen meta verileri en iyi uygulamaları (örneğin, https://demo.covidsample.org/) kullanarak güvenli hale alın.</li>
		<li>Veri türü uyumluluğunu etkinleştirmek ve kullanıcı tarafından hatalı veya eksik verilerin gönderimini en aza indirmek için Örnek Kit Kimliği, Örnek Kimlik, tarih, saat ve Küresel Konumlandırma Sistemi (GPS) koordinatları (sitenin bir resminden otomatik olarak toplanır) gibi ön yükleme bilgileri (Şekil 1B). Vatandaş bilim adamı tarafından manuel ve hızlı bir şekilde (<1 dk) doldurulacak aşağıdaki alanları ekleyin: toplanma tarihi ve saati, konumun kısa bir açıklaması ve örnekleme sitesinin bir resmi.</li>
		<li>Karşıya yüklenen tüm verileri sterilize edin ve veri türü için doğrulayın. Örneğin, .jpg dosyaları seçmek için kullanıcılar tarafından yüklenen görüntü verilerini doğrulayın, örnekle hızlı ilişki için Örnek Kimliği ile yeniden adlandırın ve yüklenen görüntüleri kullanıcılar tarafından erişilemeyen ayrı bir güvenli konumda depolayın.</li>
		<li>Tüm numuneler (16) tamamlandığında kit teslimi ve teslim alma isteğinde bulunma seçeneğini etkinleştirin. Ayrıca, bir öncekinin teslim alınmasından sonra teslim edilecek yeni bir kit isteme seçeneğini etkinleştirin (Şekil 1A). NOT: Web tabanlı olmayan bir platformu tercih eden gönüllüler ve GPS konumlarını açıklamaktan endişe duyanlar için (örneğin, göçmen durumlarından endişe duyan topluluk üyeleri), kitler kararlaştırılan bir toplantı yerinde teslim edilebilir ve gönüllülerden veri toplamanın yazılı bir sürümünü kaydetmeleri istenir. Laboratuvar ve her bir vatandaş bilim adamı arasındaki iletişim için, projenin iki dilli bir üyesi telefon görüşmeleri ve metinler için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Corona için çubuk<ol>
<li>Örnekleme çabası için epidemiyolojik olarak ilgili bir zaman aralığı tanımlayın.</li>
		<li>Gerekli kişisel koruyucu ekipman (örneğin, maske, eldiven), örnekleme protokolü ve biyogüvenlik ile ilgili bilgiler de dahil olmak üzere tüm örnekleme malzemelerini içeren bir kit oluşturun (Şekil 2). Her tüpü atanan benzersiz tanımlayıcı (Örnek Kimliği) ile önceden etiketleyin.</li>
		<li>Evlerde ve kentsel çevrede aerosolize fomitlere maruz kalan yüzeyleri nadiren dezenfekte eder.<ol>
<li>Çapraz kontaminasyonu önlemek için sağlanan maskeyi ve her numunenin toplanması için yeni bir eldiven takın. Örneklemesi bitirdikten sonra, sağlanan el dezenfektanını kullanın.</li>
			<li>Zarfını bozarak virüsü etkisiz hale getirmek ve RNases 32'nin açılmasını teşvik ederek çıplak RNA'yı stabilize etmek için 1 cm2 polyester emici svabı (örneğin paspas pedleri) deterjanla (örn.%0,5sodyum dodecyl sülfat (SDS)) ıslatın.</li>
			<li>10 cm2'likbir yüzeyi sürün. Bir kürdan yardımıyla, her örnek çubuğu 200 μL guanidinium tiyosiyanat çözeltisi (GITC) içeren ilgili önceden etiketlenmiş tüpe tamamen batırın. Tüpleri laboratuvara taşınana kadar 4 °C'de saklayın. Numuneler laboratuvara ulaştığında -80 °C'de saklayın. NOT: GITC toksik bir tahriş edicidir; ciltle temastan kaçının. GITC çözeltisinin yaygın laboratuvar kimyasallarından hazırlanması kolaydır, tarif içinbkz. Virüsü inaktive eder, RNases34 , 35,36'yıdenatüreederekRNA'yı stabilize eder ve numuneleri oda sıcaklığında stabilize eder. Bununla birlikte, kit, depolama için ev buzdolaplarını kullanmaya gerek kalmadan numuneleri soğuk tutmak için buz paketleri içerir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. SARS-CoV-2 algılama
<ol><li>Toplam RNA yalıtımı<ol>
<li>Yüzeyleri, ekipmanları ve pipetleri 2 mM bakır sülfat ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile dezenfekte edin; ardından %10 çamaşır suyu, 90 mM sodyum bikarbonat, %5 SDS ve %2,5 NaOH çözeltisi. Damıtılmış su ve ardından% 75 etanol ile iyice silin. NOT: Bu çözümler, piyasada bulunan çözümlere bir alternatiftir.</li>
		<li>Buzdaki örnekleri eritin. Orta hızda 2 dakika boyunca girdap örnekleri.</li>
		<li>Taramanın hızını artırmak için örnekleri havuzlarda işleyin. Bir havuz pozitifse, pozitif örneği/örnekleri bulmak için her örneğin RNA'sını bağımsız olarak ayıklayın. Her örnekleme kitinden (toplam 16) alınan örnekleri 8 örnekten oluşan 2 havuzda birleştirin. NOT: Havuz başına 8 örneğe sahip olmak, kit başına yalnızca 2 havuzun işlenmesi gerektiği anlamına gelir. Bir havuz pozitifse, ayrı numuneler ayrı RT-LAMP analizi için yeniden işlenir. Bu, zamanı, maliyetleri ve reaktifleri azaltır.</li>
		<li>8 numunenin her birinin 50 μL'lik havuzu bir mikrosantrifüj tüpüne (toplam hacim 400 μL); kalan numuneyi -80 °C'de kaydedin. 0,2 hacim (80 μL) kloroform, 15 sn girdap ekleyin ve ardından 4 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj.</li>
		<li>Sulu (berrak sıvı) katmanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kalan arayüzü ve pembe sıvıyı -80 °C dondurucuda saklayın; bu fraksiyonlar DNA ve protein içerir33,36.</li>
		<li>Eşit hacimde izopropanol (~200 μL) ve 2,6 μL glikojen coprecipitant (15 mg mL-1)37ekleyin. İyice karıştırın ve en az 1 saat boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın, ardından RNA'yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4 °C'yi takip edin. NOT: Protokol burada numuneler 1 saat yerine gece boyunca -20 °C'de inkübe edilerek duraklatılabilir.</li>
		<li>4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. Peleti 50 μL dietilpyrokarbonat (DEPC) arıtılmış suya yeniden yansıtın ve eşit hacim (50 μL) RNase içermeyen 5 M amonyum asetat ve % 100 etanol7,38'in2,5 cilt (250 μl) ekleyin. NOT: Amonyum iyonları, aşağı akış işleminde kullanılırsa polinükleotid kinazı inhibe eder38. Karışım, çözelti38'dedeoksinükleozid trifosfatlar ve oligosakkaritler bırakırken RNA'yı çökeltir.</li>
		<li>İyice karıştırın ve en az 1 saat boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın, ardından RNA'yı çökeltmek için 10 dakika boyunca 4 °C'yi takip edin. NOT: Protokol burada numuneler 1 saat yerine gece boyunca -20 °C'de inkübe edilerek duraklatılabilir.</li>
		<li>4 °C'de 20 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj. Peleti 1 mL soğuk (-20 °C), taze yapılmış% 75 etanol ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız edici olmasını önlemek için üsttekiyi bir P10 pipetle çıkarın.</li>
		<li>Kalan etanol kalmayana kadar peletin hava ile 10-15 dakika kurutun. Peleti 50 μL DEPC arıtıcı suya yeniden saklayın, 5 μL 10x DNase tamponu + 1μL DNase (2 Birim μL-1)ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>0,1 cilt (5,6 μL) DNase inaktivasyon reaktifi ekleyin, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın ve her dakika hafifçe karıştırın. 2 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir tüpe (~50 μL) aktarın. RT-qPCR veya RT-LAMP reaksiyonlarını hazırlarken tüpü hemen buza yerleştirin veya -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. NOT: Taşıma kontaminasyonini önlemek için amplicon içermeyen bir odada RNA İzolasyonu gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Multipleks ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP)<ol>
<li>Her astar kümesi için 20X astar karışımı çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın (Tablo 2). Borulama kaybını hesaba katmak için ODA SıCAKLıĞıNDA %10 fazla hacimli RT-LAMP reaksiyon karışımını (Tablo 3) hazırlayın. NOT: Antarktika termolabile urasil-DNA glikosilaz (UDG) ile kolorimetrik LAMP 2X anakarışımı,DNA kontaminasyonunun önceki reaksiyonlardan amplifikasyonunun kesilmesini önler20,28.</li>
		<li>Girdap ve karışımı aşağı döndür. Karışımın 20 μL'sini her reaksiyon tüpüne dağıtın: örnek, çivili, pozitif kontrolve negatif kontrol. UDG'nin potansiyel taşıma kontaminasyonuna etki edebilmesi için tüplerdeki reaksiyonları oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya bırakın.</li>
		<li>Numune reaksiyonu için 5 μL RNA, çivili reaksiyona 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopya) sentetik SARS-CoV-2 RNA, pozitif kontrol reaksiyonu için 2,5 μL (450 kopya) sentetik SARS-CoV-2 RNA ve negatif kontrol reaksiyonu için5 μLH 2 O ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları aşağı çevirin; tüm RNA'ları buzda eritin.</li>
		<li>Termosikleyici veya su banyosu 65 °C'ye ısıtılırken, tüm reaksiyonların oda sıcaklığında kalmasını sağlar. UDG >50 °C'de devre dışı bırakılacaktır. Reaksiyonları termosiklere yerleştirin (ısı kapağı kullanın), 40 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yaslayın ve reaksiyonların oda sıcaklığına (5 dakika için ~ 22 ° C) ulaşmasını bekleyin veya 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Sonuçları kolorimetrik özelliği (basit gözlem) veya ürünleri bir agarose jelinde çalıştırarak analiz edin. NOT: Algılama sınırı (LOD) reaksiyon başına 10 kopya olmasına rağmen, kopya numarası reaksiyon başına 500 kopyaya yaklaştıkça algılama sıklığı artar (Şekil 3A). Kolorimetrik gözlem için, negatif bir sonucun pembe (pH = 8.8) ile, pozitif sonucun ise sarı (pH = 5) (Şekil 3B)ile belirtildiğini unutmayın. Kolorimetrik seçenek, rt-LAMP ürünlerinin çalışma ortamındaki hacmini ve taşıma kirlenmesini azaltacak olan amplifikasyondan sonra RT-LAMP tüplerinin açılmasını önler. Jel elektroforezi için% 0.5 Tris / Borat / EDTA (TBE) tamponunda 1X DNA jel lekesi ile% 1.5 agarose jel hazırlayın. Reaksiyonun 25 μL'si + her kuyuya 5 μL 6X yükleme boyası yükleyin. Jeli 60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın. Pozitif numuneler merdiven deseni gösterdiği için moleküler bir işarete ihtiyaç yoktur (Şekil 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Tüm yazarlar rakip çıkarların olmadığını beyan eder.

Vatandaş bilim adamı nişanı. Vatandaş bilim adamları, SARS-CoV-2'nin kentsel ortamdaki varlığını örnek almak ve tespit etmek için San Diego County'deki yüzeyleri taramak için işe alındı. Teslim edilen örnekleme kitlerinin çoğu (%70) laboratuvara iade edildi ve bunların neredeyse tüm örnekleri tamamlandı (%91) (Şekil 3A,B ve Tablo 4). Gönüllüler, web tabanlı platform üzerinden kolayca kit teslimi / teslim alma talep edebilir ve teslimat rotası planlama yazılımı, vatandaş bilim insanlarına tahmini varış zamanlarını, her ikisi de gözlemlenen başarı için muhtemelen önemli faktörleri bildirdi. Kitin vatandaş bilim adamına teslim edildiğinden laboratuvara geri döndüğü zamana kadar geçen ortalama süre 8 gün, 3 gün ortanca ve 1-64 gün aralığı (Şekil 3A ve Tablo 4)idi. Gönüllülere daha sık yapılan hatırlatmalar büyük olasılıkla bu gecikme süresini azaltacaktır.
Veri toplama platformu, kullanıcıların büyük bir çoğunluğu tarafından başarıyla kullanıldı (%73) (Tablo 4). Vatandaş bilim insanlarının çabaları ölçülmezken, saha testleri veri toplama platformunun örnek toplamayı düzgün bir şekilde tamamlamak için gereken çabayı ve zamanı önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Böylece, muhasebe miktarını azaltmak, vatandaş bilim adamı katılımını teşvik etti. Web tabanlı platform, çok dilli bir sinir makinesi çeviri hizmeti sunarak ve İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokoller sağlayarak demografik sınırlamaların üstesinden gelmeyi amaçlamıştır. Bu, hem Güney Körfezi'nden hem de ilçenin Hispanik / Latin nüfusunun çoğunun45ikamet ettiği North County'den daha az örnek toplandığı için sadece kısmen başarılı oldu. Bu bölgeler ayrıca San Diego county'deki toplam COVID-19 vakalarının% 63'ünü (100.000'de 1.700 vaka) barındırıyor ve hastalığın en yüksek yaygınlığı46 ve hastaneye yatış oranı (%62)47,48. Örneklerin çoğu Central County'den gelmesine rağmen, en çok COVID-19 etkilenen bölgelerden temsili bir sayı toplandı ve örneklerin sadece küçük bir kısmı pozitifti, bu da kentsel ortamdaKI SARS-CoV-2 yüzey rezervuarlarının nispeten nadir olduğunu gösteriyor.
Örnek işleme. Örnekleme sürüntüleri, zarfını bozarak virüsü inaktive eden ve RNases32'yiaçarak çıplak RNA'yı stabilize eden SDS ile ıslatıldı. Toplama sırasında, çubuktaki deterjan örneklenen yüzeyi temizledi. Çevresel numuneler genellikle çok az miktarda RNA içerir. Kurtarmayı en üst düzeye çıkarmak için, RNA yalıtımı GITC tabanlı, sütunsuz, ham çıkarma yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Güçlü bir chaotropik ajan olan GITC, protein katlamayı (yani hidrofobik etkiyi) koruyan hidrojen bağlarını bozar. Bu eylem viral parçacıkların inaktivasyonu ile sonuçlanır ve RNA,RNA'larıninhibisyonu nedeniyle sabit kalır 34,35,36. GITC çözümü, RNA numunelerinin stabilitesini sıkı soğuk zincir hususları olmadan korudu ve bu da sağlanan buz paketleri için bir dondurucu mevcut değilse vatandaşların numuneleri oda sıcaklığında tutmasını sağladı. Doğrudan cilt veya mukozal temas meydana geldiğinde bu reaktifin oluşturmuş olma potansiyelini azaltmak için kite sağlanan bir malzeme güvenliği veri sayfasının dahil edilmesiyle vatandaşlar bu risklerden haberdar edildi ve tüplerin bulunduğu kutuya uyarı mührü yerleştirildi.
Ham GITC-kloroform ekstraksiyon yöntemi, sürüntülerden RNA izlerinin geri kazanılmasına yardımcı oldu ve çivili örneklerin amplifikasyonunda gösterildiği gibi, inhibitörler ekstraksiyondan sonra örneklerde nadiren devam etti. SARS-CoV-2 için negatif olan ve RT-LAMP inhibisyonu göstermeyen örnekler, gerçek negatifleri temsil ediyordu veya %100 frekansta LOD'den daha düşük bir kopya numarasına sahipti. Tersine, viral RNA'nın bir yüzeyde tespit edilmesi, virüsün pozitif örneklerden enfeksiyozitesinin test edilmesi gerektiğinden, doğrudan temas yoluyla bulaşma riski anlamına gelmez. Sofistike malzemelerin veya yüksek nitelikli personelin mevcudiyeti ile sınırlı olmamak üzere çevrenin hızlı bir şekilde taranması, yüzeylerin viral bir rezervuar oluşturup oluşturmadığını değerlendirmek ve önleme ve çevreleme çabalarını daha iyi yönlendirmek için çok önemlidir.
RT-LAMP, önerilen algılama ardışık düzeni için uygun en iyi yöntem olarak seçildi. Kalan inhibitörlerin çoğuna karşı oldukça dirençli ve diğer RT-qPCR yöntemleri kadar hassas ve spesifik olan hızlı ve ucuz bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. SARS-CoV-2 pandemisi sırasında klinik ortamlarda kullanımları nedeniyle, RT-qPCR kitlerinin kullanılabilirliği küresel talepten etkilendi. Dahası, RT-qPCR teknikleri - inhibitörlere direnmek için formüle edilmiş olanlar bile - enzim bağlama49için inhibitör rekabetini azaltmak için diğer ortak stratejilerin kullanılmasından sonra bile, vatandaş bilim adamlarından oluşan bir pilot kohort tarafından toplanan çevresel örneklerde bulunan maddelere duyarlıydı. Bu bulgular, COVID-19 hastaları tarafından ele alınan şekerlerden alınan svap örneklerinde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için her iki yöntemi de karşılaştıran ve RT-LAMP 15 tarafındananaliz edilen örneklerde% 25 daha düşük inhibisyon ile% 83'ün üzerinde sonuç uyumu bulan yeni bir çalışma ile doğrulanmaktadır. Ayrıca, GITC-kloroform ham ekstraksiyonu, RT-LAMP ile birleştiğinde, reaktiflerin ve malzemelerin maliyetini RNA kit ekstraksiyonu ve RT-qPCR (Malzeme Masası)ile karşılaştırıldığında% 42 azalttı.
Bu yöntem, binlerce yüzey çubuğu örneğinin yüksek verim analizine izin verildi. RNA ekstraksiyonundan RT-LAMP ile SARS-CoV-2 algılamasına kadar 2 günde 640 örneği temsil eden 80'e kadar havuz işlendi. Önerilen protokol yarı niteliktedir, viral RNA'nın tespiti ile sınırlıdır ve enfektif viral parçacıkların varlığını göstermez. SARS-CoV-2'nin sürünmüş yüzeylerde bulunan enfekte fomitlerden bulaşma riskini değerlendirmek için daha fazla analiz yapılması gerekmektedir.
Bu çalışma, bulaşıcı bir hastalığa sahip bir sağlık acil durumuyla karşı karşıya kaldığında etkili bir iş akışı içeren bir test stratejisini hızlı bir şekilde kurmak için bir protokol salamaktadır. Önerilen örnekleme protokolü basittir ve evlerde yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanır ve viral algılama yöntemi, termosikler yerine su banyosu gibi temel laboratuvar ortamlarında bulunan ekipmanlarda gerçekleştirilir. RT-LAMP reaktiflerinin maliyetleri RT-qPCR için gerekenden önemli ölçüde daha düşüktür ve yüksek küresel talep senaryolarına daha az duyarlıdır. Bu çalışma, gelecekteki salgın salgınlarda ve küresel pandemilerde çevresel viral rezervuarların değerlendirilmesi için bir çerçeve görevi görür.

SARS-CoV-2'nin esas olarak kontamine aerosollerin ve damlacıkların enfekte bireylerle doğrudan temastan solunması yoluyla bulaştığı düşünülmektedir1,2,3,4. Bununla birlikte, küresel COVID-19 salgınının ilk aşamalarında, SARS-CoV-2'nin bulaşmasını kontrol etme çabaları, yüzeylerin dezenfekte edilmesine, el yıkamaya ve sterilizasyona odaklandı. 2020'nin sonunda, Dünya Sağlık Örgütü (WHO)5 ve ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC)6'dan gelen iletim kılavuzları, hava yoluyla bulaşmayı esas olarak enfekte bir kişiyle yakın temasta (<2 m) veya aerosol üreten tıbbi prosedürlerin varlığında bir tehlike olarak kabul etti. Kontamine yüzeylerle temas veya aerosolize fomitlerin solunmasından sonra kendi kendine aşılama, SARS-CoV-2'nin bir iletim yolu olarak henüz göz ardı edilemedi.
Covid-19 vakaları, havadan bulaşmanın olası görünmediği bildirilmiştir7,8. SARS-CoV-2 virionları bakır üzerinde 8 saate kadar, karton ve paslanmaz çelikte 24 saate kadar ve plastikte 48 saate kadar bulaşıcı kalır9. Yolcu gemisi kabinlerinde, SARS-CoV-2 RNA yolcuların 7 kalkışlarından17gün sonra tespit edildi. Hastanelerden ve toplu taşıma sistemlerinden alınan hava ve yüzey örnekleri SARS-CoV-2 ve diğer koronavirüsler 8 , 10,11,12,13,14için pozitif test edildi. Asemptomatik ve orta/hafif semptomatik COVID-19 hastaları tarafından ele edilen Cadılar Bayramı şekerinin dış ambalajı üzerinde yapılan bir çalışmada, işleyici tarafından el yıkama ve şekerin el sabunu ile yıkanması kombinasyonunun SARS-CoV-2 RNA'yı eşik seviyelerin altına düşürdüğü sonucuna varılmıştır15.
SARS-CoV-2 tanılama için çeşitli yöntemler gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR)16,17,ters transkripsiyon döngüsü aracılı izotermal amplifikasyon (RT-LAMP)11,18,19,20,21ve CRISPR-Cas teknolojileri18 , 19,22,23temel alınarak yayınlanmıştır. Çoğu, önemli küresel talep dönemlerinde genellikle yetersiz olan RNA ekstraksiyon kitleri gerektirir ve virüsün çevresel taraması için çok az kişi kullanılmıştır24. RT-LAMP kullanılarak SARS-CoV-2 RNA'nın tespitinin RT-qPCR kullanmaya %83'ün üzerinde uygun olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, RT-LAMP, RT-qPCR 15'e kıyasla sonuçsuz sonuçlarda%25azalmaya neden oldu.
RT-LAMP, bir RNA şablonundan cDNA sentezlemek için ters transkriptaz kullanan basit bir tekniktir25, ardından DNA'yı sabit sıcaklıkta sentezleyen güçlü iplik yer değiştirme aktivitesine sahip bir DNA polimeraz (yani, izotermal amplifikasyon)26. Viral genom tespitinin daha yüksek özgüllüğü, hedef DNA'nın altı veya sekiz bölgesini tanıyan dört veya altı astar kullanılarak elde edilir. Amplifikasyon bir iç astardan başlatılır ve yarı çift iplikli bir DNA yapısı verir. Önde gelen iplikçik daha sonra bir dış astar ile yükseltilir. Bu amplifikasyonlar ters astarlar için tekrarlanır. Her iki uçtaki iç ve dış astarlar, amplifikasyon ürünü26,27'debir döngü oluşturan dahili ters kendini tamamlayan bir siteye sahiptir. İzotermal iplikçik yer değiştirmede, asenkron DNA sentezi, sürekli polimerizasyonun reaksiyon başına 10 kopya kadar az sinyali güçlendirdiği yüksek miktarlarda güçlendirilmiş ürün üretir11,20,28. Kolorimetrik RT-LAMP karışımı zayıf bir şekilde tamponlanmıştır ve pH göstergesi olarak fenol kırmızısı kullanır. Polimeraz bir nükleotid içerdeğe sahip olduğundan, bir proton salgılar ve yeterli proton çözeltinin pH'ını ve rengini pembeden sarıya değiştirir11,20,28,29.
RT-LAMP, tam donanımlı laboratuvarlardan yoksun periferik sağlık tesislerinde sivrisinek kaynaklı hastalıkların tespiti için geliştirilmiştir25 ve insan immün yetmezlik virüsü30gibi diğer RNA virüslerinin hızlı tespiti için . Salgın salgınlarında en savunmasız nüfuslar -DSÖ tanımına göre- genellikle tespit yapmak için yeterli ekonomik kaynağa ve uygun ekipmana sahip değil (Birleşmiş Milletler Küresel Halk Sağlığı Gündemi). Mevcut SARS-CoV-2 salgınında, RNA ekstraksiyon kitleri için tıbbi sınıf sürüntü örnekleri ve reaktifler gibi malzemeler, özellikle üretim yapmayan ülkelerde küresel talebi karşılayamadı. Önerilen protokol, RNA'yı soğuk zincirden bağımsız bir şekilde etkili bir şekilde koruyan ve inhibitörlerin numuneden kalıcılığını önemli ölçüde azaltan guanidinyum tiyosiyanat (GITC) bazlı bir ham RNA ekstraksiyonu kullandı. Ayrıca, GITC-kloroform ekstraksiyon protokolü, RNA'nın DNA ve proteinlerden ayrılmasına ve ardından ilgili çökeltiye dayanır ve genetik materyalin çoğunun iyileşmesini sağlar. Bu avantajlar, risklerden uygun şekilde haberdar etmek için önlemler alınırsa, kimyasalı ele alan vatandaş bilim adamlarının potansiyel tehlikelerinden daha ağır basmaktadır.
Önerilen iş akışı, genel kullanımlı malzemeler ve reaktifler kullanır. Temel, genellikle kırsal, laboratuvar ortamlarında bulunan ekipman gerektirir. Bu yöntemler ucuzdur, genellikle çevresel örneklerde veya ekstraksiyon kitleriyle işlenemeyen örneklerde bulunan inhibitörlere karşı oldukça dayanıklıdır ve yüksek hassasiyetli bir termosikler ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu çalışma, hanelerin ve kentsel çevrenin yaygın olarak dokunulan ve nadiren dezenfekte edilen yüzeylerinde çevre rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin örneklemesi ve tespiti için bir boru hattı sunun.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SMP, LIMS, and community outreach:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Authentication Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Sign-In</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial hosting platform</td>
			<td>GoDaddy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Charting Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Charts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database software</td>
			<td>MySQL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delivery route planning software&#160;</td>
			<td>Circuit</td>
			<td>Circuit for Teams</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free email service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Email</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geospatial Application Programming Interface</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Maps API</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilingual neural machine translation service</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Translate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Online form</td>
			<td>Google</td>
			<td>Google Form</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating system</td>
			<td>Linux</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web and database development&#160;</td>
			<td>Big Rose Web Design</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Web server software</td>
			<td>Apache&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sampling kit:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolers</td>
			<td>Coleman (Amazon)</td>
			<td>B00363X3F2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallon Ziploc bags</td>
			<td>Solimo (Amazon)</td>
			<td>B07BJ495GL</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice packs</td>
			<td>Ice-Brix (Amazon)</td>
			<td>B075GLD3X1</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (hand sanitizer)</td>
			<td>FischerScientific</td>
			<td>AA36644K7</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KN95 masks</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Echo-Sigma</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>348037</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer)</td>
			<td>Anyumocz (Amazon)</td>
			<td>B07T64FHXR</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase, DNase, DNA &#38; PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-281</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample ID solvent resistant labels</td>
			<td>LABTAG</td>
			<td>XST-10C1-1WH</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffer WetJet pads (swabs)</td>
			<td>Swiffer (Amazon)</td>
			<td>B001F0RBT2</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Kitchen Essential (Amazon)</td>
			<td>B00PBK4NG6</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube boxes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-119</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Ziploc bags</td>
			<td>Ziploc (Amazon)</td>
			<td>B01LRKEI9K</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebra Thermal Transfer Desktop Printer&#160;</td>
			<td>Zebra</td>
			<td>GK420t</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate RNase-free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9070G</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9515</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Isopropanol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplexed colorimetric RT-LAMP:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAJ6548522</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP E1-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-LAMP N2-Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M1800S</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950030010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit for RNA extraction:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>61904</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic SARS-CoV-2 RNA</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-3276SD</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444432</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>10006713</td>
			<td>Cost (US$) per 100 rxns: 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95132-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Pathogen&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiNova Probe</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>208352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPlex 1-Step ToughMix&#160;</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95166-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-PCR:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12594025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab cleanup:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

swabbing the urban environment - a pipeline for sampling and detection of sars-cov-2 from environmental reservoirs

2020 küresel salgını sırasında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2'nin (SARS-CoV-2) toplum tarafından bulaşmasını kontrol etmek için, çoğu ülke doğrudan insan testlerine, yüz kaplamasına ve yüzey dezenfeksiyona dayalı stratejiler uyguladı. Ana bulaşma yolunun aerosoller ve solunum damlacıklarını içerdiği varsayımıyla, fomitlerde SARS-CoV-2'yi tespit etme çabaları, yüksek yaygınlık olduğundan şüphelenilen yerlere (örneğin, hastane koğuşları, yolcu gemileri ve toplu taşıma sistemleri) odaklanmıştır. SARS-CoV-2'nin kentsel ortamda nadiren temizlenen ve nadiren dezenfekte edilen yüzeylerde varlığını araştırmak için, 350 vatandaş büyük San Diego County'den askere alındı. Toplamda, bu vatandaş bilim adamları 4.080 örnek topladılar. Örnekleme kiti teslimat ve teslim alımını izlemek ve örnek verileri toplamak için çevrimiçi bir platform geliştirildi. Örnekleme kitleri çoğunlukla pandemik stresli mağazalarda bulunan malzemelerden üretildi. Numuneler, tekrarlayan tedarik sıkıntısına rağmen erişimi kolay reaktifler kullanılarak işlendi. Kullanılan yöntemler çevresel örneklerde yaygın olarak bulunan inhibitörlere karşı oldukça hassas ve dirençliydi. Önerilen deneysel tasarım ve işleme yöntemleri, çeşitli yüzey alanlarından etkili bir şekilde numune toplayan çok sayıda vatandaş bilim adamını devreye sokmada başarılı oldu. Burada açıklanan iş akışı ve yöntemler, halk sağlığıyla ilgili olan ve gelecekteki pandemiler için tehdit oluşturan diğer virüsler için kentsel çevreyi incelemekle ilgilidir.

Watch this Scientific Journal Video about Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs at JoVE.com

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Sars-CoV-2 için çevre örnekleri toplamak üzere San Diego sakinlerini işe almak için bir vatandaş bilimi projesi tasarlandı. Kullanıcı dostu bir mobil cihaz arayüzü kullanılarak veri gönderimi için çok dilli bir web tabanlı platform oluşturuldu. Laboratuvar bilgi yönetim sistemi, gerçek zamanlı sonuç takibi ile binlerce coğrafi çeşitlilikte numunenin toplanmasını kolaylaştıran bir sistemdir.

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Bu çalışma, gaz pompası kolları, oyun alanları ve ATM'ler gibi kentsel ortamda nadiren temizlenen yüzeylerde SARS-CoV-2'yi tespit etmek için yeni bir iş akışı sunmaktadır. Bir pandemide, erzak kıtlığı vardır. Temel laboratuvar ortamlarında bulunan kolayca elde edilebilen malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanıyoruz.Soğuk zincir olmadan RNA'yı koruyan bir ekstraksiyon yöntemi ve inhibitörlere dayanıklı bir algılama yöntemi kullanıyoruz. Bu protokol kamu sağlığını ilgilendiriyor. Gelecekteki küresel salgınlar sırasında mevcut COVID-19 salgını ve diğer bulaşıcı ajanlar için çevresel viral rezervuarların değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar.Yerel ve sosyal medya aracılığıyla yayınlanan doğrudan ve net bir eylem çağrısı kullanarak vatandaş bilim adamlarını işe alın. Konuyu sosyal medya içeriğine bağlamak için bir sosyal medya tanıtıcısı oluşturun. Çevrimiçi bir formda belirtilen biyogüvenlik ile ilgili soruları yanıtlayarak bireylerin çevresel örnekleme çabalarına katılmak için başvurmaları için birden fazla dilde gezinmeyi sağlamak için çok dilli bir eklenti sağlayarak SMP'ye bir bağlantı oluşturun.örnekleme bölümüne İngilizce ve İspanyolca grafik ve görsel-işitsel protokolleri ekleyin. Bir bulut bilgisayar hizmeti sağlayıcısı tarafından kolaylaştırılan jeo uzamsal uygulama programlama arabirimini kullanarak jeo uzamsal verileri görselleştirin. Merkezi depolamayı, işleme iş akışlarının izlenmesini ve lojistiğin yönetimini kolaylaştırmak için SMP aracılığıyla LIMS'ye gönderilen verileri depolayın.Veri türü uyumluluğunu etkinleştirmek ve hatayı en aza indirmek için örnek kit kimliği, örnek kimliği, tarih, saat ve genel konumlandırma sistemi koordinatları gibi ön yükleme bilgileri. Katılımcılar için, tüm örnekleri topladıktan sonra kullanabilecekleri bir örnek teslim alma isteği bağlantısı ekleyin. Maske ve eldiven, numune alma protokolü ve biyogüvenlik ile ilgili bilgiler gibi gerekli kişisel koruyucu ekipman da dahil olmak üzere tüm örnekleme malzemelerini içeren bir kit oluşturun.Bir santimetrekare polyester emici bezeyi deterjanla ıslatarak ve 10 santimetrekarelik bir yüzeyi temizleyerek evlerde ve kentsel çevrede yüzeyleri nadiren dezenfekte etti. Bir kürdan yardımıyla, her örnek çubuğu 200 mikrolitre guanidinium tiyosiyanat içeren önceden etiketlenmiş tüpe batırın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her numunenin toplanması için sağlanan maskeyi ve yeni bir çift eldiven takın.Örneklemesi bitirdikten sonra, sağlanan el dezenfektanını kullanın. Tüpleri laboratuvara taşınana kadar dört santigrat derecede saklayın. Numuneler laboratuvara ulaştığında eksi 80 santigrat derecede saklayın.Taramanın hızını artırmak için örnekleri havuzlarda işleyin. Havuz pozitifse, her örneğin RNA'sını bağımsız olarak ayıklayın. Sekiz numunenin her birinin 50 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne bir araya getirerek ve kalan örnekleri eksi 80 santigrat derecede kurtararak her örnekleme kitinden alınan örnekleri iki havuzda birleştirin.15 saniye boyunca 80 mikrolitre kloroform ve girdap ekleyin. Sonra dört santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yaslanın. 13,000 kez G'de 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj.Sulu tabakayı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Kalan arayüzü ve pembe sıvıyı eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Bu fraksiyonlar DNA ve protein içerir.Guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA ham ekstraksiyon protokolü kullanarak kurtarılan sulu tabakadan RNA çıkarın. Borulama kaybını hesaba katmak için ODA SıCAKLıĞıNDA %10 fazla hacimde RT-LAMP reaksiyon karışımını hazırlayın. Numune reaksiyona beş mikrolitre RNA ve beş mikrolitre RNA artı çivili reaksiyona 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ekleyin.Pozitif kontrole 2,5 mikrolitre sentetik SARS-CoV-2 RNA ve negatif kontrole beş mikrolitre su ekleyin. İyice karıştırın ve reaksiyonları kısın. Kolorimetrik gözlem için negatif bir sonuç pembe, pozitif sonuç ise sarı ile gösterilir.RT-LAMP'den sonra jel elektroforez gerçekleştirin. Örnek toplama sitelerinin dağılımı burada gösterilmiştir. Kitlerin çoğunluğu tamamlandı ve ilgili veriler LIMS'ye yüklendi.%100 frekansta algılama sınırı 25 mikrolitre reaksiyon başına 500 kopya idi. Kolorimetrik RT-LAMP'de pozitif örnekler, pH kayması nedeniyle pembeden sarıya renk değiştirdi. Düşük kopya numaralarında, numuneler, ortaya çıkan merdiven benzeri desenle pozitifleri doğrulamak için bir agarose jel üzerinde çalıştırıldı.RT QPCR yöntemleri çevresel örneklerle test edilmiştir. Tüm ana karışımlar, pozitif kontrolün düşük kopya sayısı konsantrasyonlarında inhibitörlere karşı hassastı. Şablonun düşük konsantrasyonlarında, geleneksel RT PCR yöntemleri yanlış pozitifler ve yanlış negatifler gösterdi.Son olarak, yuvarlanan daire amplifikasyonu adı verilen bir teknik, hedef sıranın küçük miktarlarını tespit etti. Bununla birlikte, bir RNA şablonunun yokluğunda probun amplifikasyonu gösterdi. Toplumun tüm sektörlerine ulaşan bir eylem çağrısı yayınlamak çok önemlidir, bu nedenle örnekleme gerçekten bu topluluğun tüm üyelerinin maruz kalma riskini temsil eder.Bu çerçeve SARS-CoV-2 genetik materyali tespit eder. Viral canlılığı test etmek için yapılan çalışmalar bir sonraki adımdır.

Research

JoVE Journal

Biology

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray&#39;ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Doğal Çevre gelen Magnetotactic Bakteri meydana gelen toplanması, İzolasyon ve Zenginleştirme

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Bir model tesisi Arabidopsis thaliana Thigmomorphogenesis çalışması Için bir işgücü tasarrufu ve tekrarlanabilen dokunma-Force sinyalizasyon mutant ekran Protokolü

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...