Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) لمنحة Glycoscience U01CA241953. تم دعم MJP من قبل برنامج واجهة الكيمياء والبيولوجيا في جامعة جونز هوبكنز (T32GM080189).

تم جمع الأنسجة وفقا لشروط مصرح بها من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. استخراج العقديات على نطاق صغير وتنقية جزئية
تنبيه: استخدم التهوية المناسبة عند العمل مع المذيبات المتطايرة والسامة. تجنب البلاستيك في جميع أنحاء. سوف تستخرج المذيبات ال?...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

إن طرق استخراج وعزل العصابات الصغيرة والكبيرة النطاق المبلغ عنها هنا ليست فريدة من نوعها - فهناك العديد من أساليب استخراج وتنقية المذيبات المختلفة التي توفر نتائج ممتازة12. وقد ثبت أن الطرق التي تم الإبلاغ عنها هنا للتنقية على نطاق صغير من الدماغ ، من فريدمان وسفينرهولم <sup class=...

تعرف الجانجليوسيدات بأنها جليكوسفينغوليبيد تحمل واحدا أو أكثر من بقايا حمض السياليك1. يتم التعبير عنها في المقام الأول على سطح الخلية مع مويتي الدهون سيراميد الكارهة للماء المضمنة في النشرة الخارجية لغشاء البلازما والجليكان المحب للماء الذي يمتد إلى الفضاء خارج الخلية2. على الرغم من توزيعها على نطاق واسع في الخلايا والأنسجة الفقارية، إلا أنها وفيرة بشكل خاص في دماغ الفقاريات3، حيث تم اكتشافها لأول مرة وتسميتها4.
تختلف هياكل الجليكان العقدي وهي أساس تسميتها (الشكل 1). يتكون جليكان جانجليوسيد من نواة سكر محايدة تحمل أعدادا وتوزيعات مختلفة من أحماض السياليك. أصغر جانجليوسيد ، GM4 ، يحتوي على سكرين فقط (حمض السياليك المرتبط بالجالاكتوز)5. قد تحتوي العقديات الكبيرة التي تحدث بشكل طبيعي على أكثر من اثني عشر سكرية إجمالية6 أو ما يصل إلى سبعة أحماض سياليك على نواة محايدة واحدة7. كما تختلف الجزيئات الدهنية من السيراميد ، حيث تحتوي على أطوال سفينغوزين مختلفة ومجموعة متنوعة من أميدات الأحماض الدهنية. في دماغ الفقاريات ، تسود أربعة أنواع من الجانجليوسيد ، GM1 و GD1a و GD1b و GT1b. يتم تنظيم تعبير Ganglioside من الناحية التنموية ، والأنسجة المحددة ، ونوع الخلية محددة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> الشكل 1: العقد الدماغية الرئيسية وسلائفها الاصطناعية الحيوية. يتم عرض الهياكل باستخدام تسمية الرمز ل Glycans11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تعمل Gangliosides على المستوى الجزيئي عن طريق إشراك وتعديل البروتينات في أغشيتها الخاصة (تنظيم رابطة الدول المستقلة) أو عن طريق إشراك بروتينات ربط الجليكان في الوسط خارج الخلية ، بما في ذلك السموم البكتيرية والليكتين على الخلايا الأخرى (التعرف عبر الإنترنت)3. يؤدي الارتباط المحدد للجانجليوسيدات بالبروتينات التنظيمية و / أو الارتباط الذاتي مع جزيئات أخرى في طوافات دهنية إلى تغييرات في سلوك الخلية التي تؤثر على بنية الجهاز العصبي ووظيفته ، وتطور السرطان ، والتمثيل الغذائي ، والالتهاب ، واعتلال البروتين العصبي ، والأمراض المعدية8. وبسبب أدوارها الخلوية المتنوعة، يمكن أن توفر طرق عزلها وتحليلها رؤى معززة في تنظيم العمليات الفسيولوجية والمرضية. هنا ، يتم توفير طرق تم التحقق من صحتها للاستخراج والتحليل السريع على نطاق صغير ، والعزل على نطاق تحضيري للجانجليوسيدات من الدماغ. وتناقش الفرص والتحديات للتطبيق على الأنسجة الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosides هي جليكوسفينغوليبيد تحتوي على واحد أو أكثر من بقايا حمض السياليك. توجد على جميع الخلايا والأنسجة الفقارية ولكنها وفيرة بشكل خاص في الدماغ. يتم التعبير عنها في المقام الأول على النشرة الخارجية للأغشية البلازمية للخلايا ، فهي تعدل أنشطة بروتينات سطح الخلية عن طريق الارتباط الجانبي ، وتعمل كمستقبلات في تفاعلات الخلايا الخلوية وهي أهداف لمسببات الأمراض والسموم. يؤدي خلل التنظيم الوراثي للتخليق الحيوي للعقدة في البشر إلى اضطرابات خلقية حادة في الجهاز العصبي. بسبب طبيعتها البرمائية ، يتطلب استخراج وتنقية وتحليل العقديات تقنيات تم تحسينها من قبل العديد من الباحثين في سنوات 80 منذ اكتشافها. هنا ، نصف طرقا على مستوى مقاعد البدلاء لاستخراج وتنقية وتحليلات نوعية وكمية أولية للجانجليسيدات الرئيسية من الأنسجة والخلايا التي يمكن إكمالها في غضون ساعات قليلة. كما نصف طرقا لعزل وتنقية الأنواع الرئيسية من الجانجليوسيد على نطاق أوسع من الدماغ. توفر هذه الطرق معا وصولا تحليليا وتحضيريا إلى هذه الفئة من الجزيئات النشطة بيولوجيا.

توفر الطرق الموصوفة في القسم 1 (على نطاق صغير) العقديات بكمية ونقاء كافيين لتحديد العقد الرئيسية في الدماغ نوعيا وكميا. الانتعاش من دماغ الفأر هو ~ 1 ميكرومول جانجليوسيد لكل غرام من الوزن الرطب للدماغ (1 نانومول / ميكرولتر) عند تحضيره كما هو موضح. توفر دقة TLC البالغة 1 ميكرولتر (1 نانومول) باستخد...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides هي جليكوسفينغوليبيد حاملة لحمض السياليك وفيرة بشكل خاص في الدماغ. تتطلب طبيعتها البرمائية تقنيات استخراج وتنقية عضوية / مائية لضمان الاسترداد الأمثل والتحليلات الدقيقة. توفر هذه المقالة لمحات عامة عن استخراج العقدة التحليلية والإعدادية وتنقيتها وتحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.

استخراج جانجليوسيد وتنقيته وتوصيفه

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

يتم التعبير عن Gangliosides على جميع أسطح الخلايا الفقارية وهي وفيرة بشكل خاص على الخلايا العصبية. أنها تنظم إشارات الخلية والتعرف على الخلايا الخلوية. يقدم هذا البروتوكول عزل وتحليل العقديات.تم اختيار التقنيات لزيادة غلة العقديات إلى أقصى حد على النطاقات الكبيرة والصغيرة مع تبسيط التنقية. كما نصف طرقا لإجراء تحليلات جانجليوسيد النوعية وشبه الكمية بسرعة نسبية. تتطلب الدراسة على الدهون ، وخاصة الدهون القطبية مثل العقديات ، أدوات وتقنيات مختلفة عن العمل مع البروتينات أو الأحماض النووية.يعرفك هذا الفيديو على كيفية العمل مع هذه الجزيئات. نظرا لأن المذيبات مثل الكلوروفورم ورباعي هيدروفوران تذوب البلاستيك الشائع ، فإننا نستخدم زجاجات وقوارير ذات أغطية مبطنة بالتفلون ، وماصات زجاجية ، وزجاج ، ومحاقن دقيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ومجانسات زجاج تفلون طوال هذه الإجراءات. الفشل في القيام بذلك يؤدي إلى البوليمرات البلاستيكية في المنتجات التي يمكن أن تتداخل مع التحليلات.للبدء ، أضف 4.1 ملليلتر من الماء لكل غرام من الوزن الرطب للأنسجة ، وقم بتجانسه ب 10 سكتات دماغية. أضف 13 ملليلتر من الميثانول لكل غرام من الأنسجة. انقله إلى درجة حرارة محيطة تبلغ 22 درجة مئوية ، واخلطه.انقل الأنسجة إلى أنبوب سميك الجدران وزجاجي مغطى بالمسمار مع غطاء لولبي مبطن ب PTFE ، واخلطه جيدا. أضف 6.5 ملليلتر من الكلوروفورم لكل غرام من الأنسجة ، وقم بتغطيته ، واخلطه جيدا. جهاز طرد مركزي في 450 مرة غرام لمدة 15 دقيقة.ثم انقل السوبرناتانت الشفاف إلى أنبوب جديد مغطى بالمسمار ، وقم بقياس الحجم كحجم مستخلص مسترد. للتقسيم ، أضف 0.173 مرة من حجم المستخلص المسترد من الماء إلى supernatant الواضح. ثم قم بتغطيته.دوامة بقوة. جهاز طرد مركزي في 450 مرة غرام لمدة 15 دقيقة. انقل المرحلة العليا ، التي تحتوي على العقديات ، إلى أنبوب زجاجي جديد مع غطاء لولبي مبطن ب PTFE.لإجراء كروماتوغرافيا خرطوشة الطور العكسي، استخدم حقنة زجاجية سعة خمسة ملليلتر لغسل خرطوشة استخراج الطور الصلب tC18 بثلاثة ملليلترات من الميثانول. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من الكلوروفورم والميثانول والماء بنسبة اثنين إلى 43 إلى 55. قم بتحميل المرحلة العليا من الخطوة السابقة على خرطوشة tC18 من خلال نفس المحقنة الزجاجية.اجمع التدفق وإعادة تحميله على العمود لتحسين الامتزاز. اغسل الخرطوشة بثلاثة ملليلترات من ماء الكلوروفورم والميثانول ثم بثلاثة ملليلترات من ماء الميثانول. قم بإخراج العقد مع ثلاثة ملليلتر من الميثانول في أنبوب جديد مغطى بالمسمار.يتبخر حتى يجف تحت تيار لطيف من النيتروجين عند درجة حرارة أقل من أو تساوي 45 درجة مئوية. يذوب في الميثانول عند ملليلتر واحد لكل غرام من الوزن الرطب الأصلي للأنسجة. ضع 100 جرام من المادة الرمادية في الدماغ في الخلاط ، وأضف ملليلتر واحد لكل غرام من الوزن الرطب للدماغ من المخزن المؤقت المبرد و 10 ملليمولار من فوسفات البوتاسيوم من الرقم الهيدروجيني 6.8.ثم تجانس على انخفاض لمدة 20 ثانية. أضف ثمانية ملليلترات من رباعي هيدروفوران لكل غرام من الوزن الرطب للدماغ ، وتجانس على مستوى منخفض لمدة 10 ثوان. صب في زجاجات الطرد المركزي الزجاجية ، وأجهزة الطرد المركزي في 5،000 مرات غرام لمدة 15 دقيقة.جمع supernatant ، وقياس حجمه ، ثم نقله إلى قمع فاصل زجاجي. أضف 0.3 ملليلتر من إيثيل الأثير لكل ملليلتر من الأثير الفائق. رجه بقوة.ثم اتركه يجلس دون إزعاج لمدة 30 دقيقة ، تنفصل خلالها مرحلتان ، مرحلة الأثير العلوي والمرحلة المائية السفلية. جمع المرحلة السفلى ، التي تحتوي على gangliosides ، في زجاجة زجاجية مع غطاء مبطن PTFE. إلى مرحلة الأثير العلوي المتبقية في القمع الفاصل ، أضف 0.1 ملليلتر من الماء لكل ملليلتر من supernatant الأصلي من الخطوة السابقة.رجه بقوة. اسمح للمراحل بالفصل. ثم جمع المرحلة المائية السفلى ، ودمجها مع المرحلة السفلية التي تم جمعها سابقا.تبخر المراحل السفلية مجتمعة إلى مسحوق جاف ، ووزنها. لإجراء كروماتوغرافيا الطور العكسي، اغسل مسبقا خرطوشة استخراج الطور الصلب tC18 واسعة النطاق عن طريق تمرير 50 ملليلتر من المذيبات عبر العمود باستخدام الفراغ أو الضغط لمدة تقل عن دقيقة واحدة لكل غسلة. قم بتحميل المرحلة العليا من فصل مرحلة ما بعد التصبن على العمود عن طريق الفراغ أو الضغط.ثم قم بجمع التدفق وإعادة تحميله وجمع التدفق مرة أخرى للتحليل اللاحق. اغسل العمود ب 30 ملليلتر لكل من ماء الكلوروفورم والميثانول ، يليه ماء الميثانول. ثم قم بإخراج العقديات مع 50 ملليلتر من الميثانول ثم مرة أخرى مع 10 ملليلتر من الميثانول.اجمع كل غسل وإزالة على حدة. استخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، أو TLC ، للتأكد من أن العقديات غائبة عن التدفق وتغسل وتزول في أول عملية إزالة للميثانول. تبخر العقد المنتفخة إلى مسحوق جاف ، ووزنها.لأداء TLC ، صب المذيب الجاري في غرفة TLC زجاجية 10 × 10 سم مع غطاء من الفولاذ المقاوم للصدأ بحيث يكون عمق المذيب 0.5 سم. قم بتغطية الغرفة ، واتركها تتوازن لمدة 10 دقائق. اغسل حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر بإبرة مشطوفة باستخدام الميثانول.اسحب ميكرولتر واحد من الميثانول في حقنة زجاجية لملء الحجم الميت للإبرة ثم ميكرولتر واحد من العينة أو المعيار. حدد العينة بالتساوي على الخطوط المحددة مسبقا والتي يبلغ طولها خمسة ملليمترات حتى يبقى أقل من ميكرولتر واحد من مذيب الميثانول في المحقنة. اترك الصفيحة لتجف عند 22 درجة مئوية بعد رصد جميع العينات.ضع اللوحة المرقطة والمجففة على غرفة TLC المتوازنة مسبقا مع غمر الحافة السفلية في المذيب الجاري. اسمح للمذيب الجاري بالتقدم إلى أعلى اللوحة عن طريق العمل الشعري حتى تصل جبهة المذيب إلى مسافة سنتيمتر واحد من الجزء العلوي من اللوحة. قم بإزالة ووضع علامة على مقدمة المذيب على حافة اللوحة بقلم رصاص.اسمح للمذيبات بالتبخر تماما إما دون إزعاج أو تحت تدفق هواء معتدل. في غطاء الدخان الكيميائي ، ضع لوحة TLC مع أصل العقد التي تم حلها رأسا على عقب في صندوق من الورق المقوى المقطوع لحماية جدران الغطاء من رذاذ الحمض. ضع كاشف رذاذ ريسورسينول في بخاخ TLC زجاجي.قم بإرفاقه بمصدر للنيتروجين المضغوط ، ورش اللوحة برفق قطريا في الاتجاهين الرأسي والأفقي. قم بتغطية اللوحة على الفور بلوحة غطاء زجاجية نظيفة وجافة من نفس الأبعاد ، وقم بتثبيت لوحة الغطاء في مكانها باستخدام مشابك الموثق. سخني الطبق المغطى على حرارة 125 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.ستظهر Gangliosides باللون الأرجواني الداكن على خلفية بيضاء. لإجراء تلطيخ الدهون ، اغمس لوحة TLC مع أصل العقد المحلولة جانبا في كوب يحتوي على بقعة أنيسالدهيد. انغمس في مقدمة الجري لأكثر من ثانيتين بقليل.ثم اتركه يستنزف. قم بتسخين لوحة TLC على صفيحة ساخنة عند درجة حرارة منخفضة لتطويرها. يوفر هذا البروتوكول العقديات بكمية ونقاء كافيين لتحديد نوعي وكمي.توفر دقة TLC لميكرولتر واحد مادة وافرة للكشف عن الريسورسينول وتحل جميع العقد الدماغية الرئيسية للفئران من النوع البري والمعدلة وراثيا. على الرغم من أن العقديات المختلطة المحضرة ليست خالية من الدهون الرئيسية الأخرى ، إلا أنها ذات نقاء كاف لتحديد الطيف الكتلي إما كجانجليوسيدات أصلية منقية في الوضع السلبي أو بعد المثيلة المسبقة في الوضع الإيجابي. يشمل التنقية على نطاق واسع الاستخراج والتصبن ودقة HPLC لتوفير العقد الدماغية الرئيسية النقية المناسبة للتجارب البيولوجية ولمزيد من التعديلات الكيميائية والإنزيمية.يتم عرض ملف تعريف HPLC مثالي وتحليل TLC اللاحق. العلاج القلوي ، أو التصبن ، ضروري لتحلل وإزالة الدهون الفوسفاتية الملوثة ، ولكنه سيؤدي أيضا إلى تحلل التعديلات الطبيعية للجانجليوسيدات مثل أحماض السياليك O-acetylated ، والتي قد تكون مهمة في بعض السياقات. تعد نسب المذيبات الدقيقة للاستخراج وتقسيم المذيبات ودقة TLC أمرا بالغ الأهمية لتعزيز الاسترداد والنقاء والتحليلات.من السرطان إلى التمثيل الغذائي إلى وظائف الدماغ ، فإن العقد هي معدلات فسيولوجية وأهداف علاجية. يعد عزل Ganglioside وتنقيته وتحليلاته حجر الزاوية في اكتشاف الطب الحيوي والتطوير العلاجي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

مختبر إنتاج مقياس وتنقية من الأجسام المضادة العلاجية

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome التنميط في الليشمانياوالخلايا البشرية والخصية الماوس

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

استخراج وتحليل للتايوانيين دنج الأخضر

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...