Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP blev støttet af Chemistry-Biology Interface Program på Johns Hopkins (T32GM080189).

Vævsindsamling blev udført under betingelser, der var godkendt af Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Gangliosidekstraktion i lille skala og delvis rensning
FORSIGTIG: Brug passende ventilation, når du arbejder med flygtige og giftige opløsningsmidler. Undgå plastik hele vejen igennem; opløsningsmidler vil udvinde kemiske komponenter fra mange plastmaterialer, der forstyrrer efterfølgende analyser. Polytetrafluorethylen (PTFE) er en undtagelse; PTFE...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Metoderne til gangliosidekstraktion og isolering i lille og stor skala, der er rapporteret her, er ikke unikke - der er mange forskellige opløsningsmiddelekstraktions- og oprensningsmetoder, der giver fremragende resultater12. De metoder, der er rapporteret her til rensning i lille skala fra hjernen, fra Fredman og Svennerholm13, viste sig at optimere restitutionen og har vist sig at være robuste og ligetil gennem mange år i vores laboratorium. Isolering og oprensning eg...

Gangliosider defineres som glycosphingolipider, der bærer en eller flere sialinsyrerester1. De udtrykkes primært på celleoverfladen med deres hydrofobe ceramidlipidmoiety indlejret i plasmamembranens ydre folder og deres hydrofile glycaner, der strækker sig ind i det ekstracellulære rum2. Selvom de er udbredt i hvirveldyrceller og væv, er de særligt rigelige i hvirveldyrshjernen3, hvor de først blev opdaget og navngivet4.
Strukturerne af gangliosidglycaner varierer og er grundlaget for deres nomenklatur (figur 1). Gangliosidglycaner består af en neutral sukkerkerne med forskellige tal og fordelinger af sialinsyrer. Det mindste gangliosid, GM4, har kun to sukkerarter (sialinsyre bundet til galactose)5. Større naturligt forekommende gangliosider kan indeholde langt over et dusin samlede sukkerarter6 eller op til syv sialinsyrer på en enkelt neutral kerne7. Deres ceramid lipid moieties varierer også, har forskellige sphingosin længder og en række fedtsyre amider. I hvirveldyrhjernen dominerer fire gangliosidarter, GM1, GD1a, GD1b og GT1b. Gangliosidekspression er udviklingsreguleret, vævsspecifik og celletypespecifik.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figur 1: Større hjernegangliosider og deres biosyntetiske forstadier. Strukturer vises ved hjælp af symbolnomenklatur for glykaner11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Gangliosider fungerer på molekylært niveau ved at engagere og modulere proteiner i deres egne membraner (cis-regulering) eller ved at engagere glycanbindende proteiner i det ekstracellulære miljø, herunder bakterielle toksiner og lektiner på andre celler (transgenkendelse)3. Specifik binding af gangliosider til regulatoriske proteiner og / eller selvforening med andre molekyler i lipidflåder resulterer i ændringer i celleadfærd, der påvirker nervesystemets struktur og funktion, kræftprogression, metabolisme, inflammation, neuronale proteinopatier og infektionssygdomme8. På grund af deres forskellige cellulære roller kan metoder til deres isolering og analyse give forbedret indsigt i reguleringen af fysiologiske og patologiske processer. Her tilvejebringes validerede metoder til hurtig ekstraktion og analyse i lille skala og præparativ skalaisolering af gangliosider fra hjernen. Muligheder og udfordringer for anvendelse på andre væv diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosider er glycosphingolipider, der indeholder en eller flere sialinsyrerester. De findes på alle hvirveldyrceller og væv, men er især rigelige i hjernen. Udtrykt primært på den ydre folder af plasmamembranerne i celler modulerer de aktiviteterne af celleoverfladeproteiner via lateral association, fungerer som receptorer i celle-celleinteraktioner og er mål for patogener og toksiner. Genetisk dysregulering af gangliosidbiosyntese hos mennesker resulterer i alvorlige medfødte nervesystemforstyrrelser. På grund af deres amfipatiske natur kræver ekstraktion, oprensning og analyse af gangliosider teknikker, der er blevet optimeret af mange efterforskere i de 80 år siden deres opdagelse. Her beskriver vi metoder på bænkniveau til ekstraktion, oprensning og foreløbige kvalitative og kvantitative analyser af større gangliosider fra væv og celler, der kan gennemføres på få timer. Vi beskriver også metoder til større skala isolering og oprensning af store gangliosidarter fra hjernen. Tilsammen giver disse metoder analytisk og præparativ skalaadgang til denne klasse af bioaktive molekyler.

De metoder, der er beskrevet i afsnit 1 (lille skala), tilvejebringer gangliosider i tilstrækkelig mængde og renhed til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af større hjernegangliosider. Genopretning fra musehjerne er ~ 1 μmol gangliosid pr. G hjernens våde vægt (1 nmol / μL), når den fremstilles som beskrevet. TLC-opløsning på 1 μL (1 nmol) ved hjælp af afsnit 3 giver rigeligt materiale til resorcinoldetektion og løser alle de store hjernegangliosider som vist for vildtypemus og genetisk modificerede mus i...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosider er sialinsyrebærende glycosphingolipider, der er særligt rigelige i hjernen. Deres amfipatiske natur kræver organiske/vandige ekstraktions- og rensningsteknikker for at sikre optimal genvinding og nøjagtige analyser. Denne artikel indeholder oversigter over analytisk og præparativ skala gangliosidekstraktion, oprensning og tyndtlagskromatografianalyse.

Gangliosidekstraktion, rensning og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliosider udtrykkes på alle hvirveldyrcelleoverflader og er især rigelige på nerveceller. De regulerer cellesignalering og celle-cellegenkendelse. Denne protokol introducerer gangliosidisolering og analyse.Teknikkerne blev valgt for at maksimere gangliosidudbyttet i store og små skalaer, samtidig med at rensningen blev strømlinet. Vi beskriver også metoder til relativt hurtigt at udføre kvalitative og semikvantende gangliosidanalyser. Undersøgelse af lipider, især polære lipider som gangliosider, kræver andre værktøjer og teknikker end at arbejde med proteiner eller nukleinsyrer.Denne video gør dig bekendt med, hvordan du arbejder med disse molekyler. Fordi opløsningsmidler som chloroform og tetrahydrofuran opløser almindelig plast, bruger vi glasflasker og hætteglas med teflonforede hætter, glaspipetter, glas, mikrosyringer i rustfrit stål og teflonglashomogenisatorer gennem disse procedurer. I modsat fald resulterer det i plastpolymerer i produkterne, som kan forstyrre analyserne.Til at begynde med tilsættes 4,1 ml vand pr. Gram vævsfugtig vægt og homogeniseres med 10 slag. Tilsæt 13 ml methanol pr. Gram væv. Overfør det til en omgivelsestemperatur på 22 grader Celsius, og bland.Overfør vævet til et tykvægget, glas, skruekappet rør med en PTFE-foret skruehætte, og bland grundigt. Tilsæt 6,5 ml chloroform pr. Gram væv, hætte det og bland grundigt. Centrifuge ved 450 gange g i 15 minutter.Overfør derefter den klare supernatant til et friskt, skruelåget rør, og mål volumenet som genvundet ekstraktvolumen. Til partitionering tilsættes 0,173 gange det genvundne ekstraktvolumen vand til det klare supernatant. Sæt derefter låg på det.Vortex kraftigt. Centrifuge ved 450 gange g i 15 minutter. Overfør den øverste fase, som indeholder gangliosiderne, til et friskt glasrør med et PTFE-foret skruelåg.For at udføre patronkromatografi med omvendt fase skal du bruge en glassprøjte på fem milliliter til at vaske en tC18 fastfaseekstraktionspatron med tre milliliter methanol. Derefter tilsættes tre milliliter chloroform-methanol-vand i et forhold på to til 43 til 55. Læg den øverste fase fra det foregående trin på tC18-patronen gennem den samme glassprøjte.Indsaml gennemstrømningen, og genindlæs den i kolonnen for at optimere adsorptionen. Vask patronen med tre milliliter chloroform-methanol-vand og derefter med tre milliliter methanol-vand. Elute gangliosiderne med tre milliliter methanol i et friskt, skruet hætte rør.Fordamp til tørhed under en blid strøm af nitrogen ved en temperatur mindre end eller lig med 45 grader Celsius. Opløs i methanol med en milliliter pr. Gram original vævs våd vægt. Anbring 100 gram hjernegråt stof i en blender, og tilsæt en milliliter pr. Gram hjerne våd vægt af kølet, 10 millimolær kaliumphosphatbuffer af pH 6,8.Homogeniser derefter på lavt i 20 sekunder. Tilsæt otte milliliter tetrahydrofuran pr. Gram hjerne våd vægt, og homogeniser på lavt i 10 sekunder. Dekanter i glascentrifugeflasker og centrifuge ved 5.000 gange g i 15 minutter.Saml supernatanten, mål dens volumen, og overfør den derefter til en glasseparatortragt. Der tilsættes 0,3 ml ethylether pr. milliliter supernatant. Ryst kraftigt.Lad det derefter sidde uforstyrret i 30 minutter, hvor to faser, en øvre etherfase og en nedre vandig fase, adskilles. Saml den nederste fase, som indeholder gangliosiderne, i en glasflaske med en PTFE-foret hætte. Til den øvre etherfase, der er tilbage i separationstragten, tilsættes 0,1 ml vand pr. milliliter original supernatant fra det foregående trin.Ryst kraftigt. Tillad faser at adskille. Saml derefter den nedre vandige fase, og kombiner den med den tidligere opsamlede nedre fase.Fordamp de kombinerede nedre faser til et tørt pulver, og vej det. For at udføre omvendt fasekromatografi skal du forvaske en storskala tC18 fastfaseekstraktionspatron ved at føre 50 ml opløsningsmidler gennem søjlen ved hjælp af vakuum eller tryk i mindre end et minut pr. vask. Læg den øverste fase fra adskillelsen efter forsæbningsfasen på søjlen ved hjælp af vakuum eller tryk.Saml derefter gennemstrømningen, genindlæs den, og saml gennemstrømningen igen til efterfølgende analyse. Kolonnen vaskes med 30 ml hver af chloroform-methanol-vand efterfulgt af methanol-vand. Derefter elueres gangliosiderne med 50 ml methanol og derefter igen med 10 ml methanol.Saml hver vask og eluering separat. Brug tyndtlagskromatografi eller TLC til at bekræfte, at gangliosider er fraværende fra gennemstrømningen og vaskes og elueres i den første eluering af methanol. Fordamp de eluerede gangliosider til et tørt pulver, og vej dem.For at udføre TLC skal du hælde løbende opløsningsmiddel i et 10-by-10 centimeter, glas TLC-kammer med et rustfrit ståldæksel, så opløsningsmiddeldybden er 0,5 centimeter. Dæk kammeret, og lad det udligne i ca. 10 minutter. Vask en Hamilton-sprøjte på 10 mikroliter med en skrå nål ved hjælp af methanol.Tegn en mikroliter methanol i en glassprøjte for at fylde nålens dødvolumen og derefter en mikroliter prøve eller standard. Prøven spotes jævnt på de fem millimeter, formærkede linjer, indtil der er mindre end en mikroliter methanolopløsningsmiddel tilbage i sprøjten. Lad pladen tørre ved 22 grader Celsius, når alle prøver er set.Anbring den plettede og tørrede plade på det forligevægtede TLC-kammer med bundkanten nedsænket i det løbende opløsningsmiddel. Lad det kørende opløsningsmiddel gå fremad op ad pladen ved kapillær virkning, indtil opløsningsmiddelfronten når inden for en centimeter fra toppen af pladen. Fjern og markér opløsningsmiddelfronten ved kanten af pladen med en blyant.Lad opløsningsmidlerne fordampe helt enten uforstyrret eller under mild luftstrøm. I en kemisk røghætte skal du placere TLC-pladen med den opløste gangliosiders oprindelse ende på hovedet i en afskåret papkasse for at beskytte emhættens vægge mod syrespray. Anbring resorcinolsprayreagens i en TLC-sprøjte af glas.Fastgør den til en kilde til trykkvælstof, og sprøjt pladen let diagonalt i lodrette og vandrette retninger. Dæk straks pladen med en ren, tør glasdækselplade af samme dimensioner, og fastgør dækpladen på plads med bindemiddelclips. Opvarm den overdækkede plade ved 125 grader Celsius i 20 minutter.Gangliosider vises mørk lilla mod en hvid baggrund. For at udføre lipidfarvning skal du dyppe TLC-pladen med den opløste gangliosiders oprindelsesside ned i et bægerglas, der indeholder anisaldehydpletten. Sænk ned til løbefronten i lidt over to sekunder.Lad det derefter dræne. Opvarm TLC-pladen på en kogeplade ved en lav temperatur for at udvikle sig. Denne protokol giver gangliosider i tilstrækkelig mængde og renhed til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse.TLC-opløsning på en mikroliter giver rigeligt materiale til resorcinoldetektion og løser alle de store hjernegangliosider for vildtype og genetisk modificerede mus. Selvom de tilberedte blandede gangliosider ikke er fri for andre vigtige lipider, er de af tilstrækkelig renhed til massespektrometrisk bestemmelse enten som indfødte rensede gangliosider i negativ tilstand eller efter præmethylering i positiv tilstand. Storstilet oprensning omfatter ekstraktion, forsæbning og HPLC-opløsning for at tilvejebringe rensede større hjernegangliosider, der er egnede til biologiske eksperimenter og til yderligere kemiske og enzymatiske modifikationer.En eksemplarisk HPLC-profil og efterfølgende TLC-analyse vises. Alkalibehandling eller forsæbning er nødvendig for at hydrolysere og fjerne forurenende fosfolipider, men vil også hydrolysere naturlige modifikationer af gangliosider såsom O-acetylerede sialinsyrer, hvilket kan være vigtigt i nogle sammenhænge. Nøjagtige opløsningsmiddelforhold til ekstraktion, opløsningsmiddelpartitionering og TLC-opløsning er afgørende for at forbedre genvinding, renhed og analyser.Fra kræft til stofskifte til hjernefunktion er gangliosider fysiologiske modifikatorer og terapeutiske mål. Gangliosidisolering, oprensning og analyser er hjørnesten for biomedicinsk opdagelse og terapeutisk udvikling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion og oprensning af et terapeutisk antistof

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Udvinding og analyse af taiwanske grønne Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Udtryk, oploesning og rensning af eukaryote Borat transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...