Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door national institutes of health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP werd ondersteund door het Chemistry-Biology Interface Program van Johns Hopkins (T32GM080189).

Weefselverzameling werd uitgevoerd onder omstandigheden die zijn geautoriseerd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Kleinschalige ganglioside extractie en gedeeltelijke zuivering
LET OP: Gebruik de juiste ventilatie bij het werken met vluchtige en giftige oplosmiddelen. Vermijd plastic overal; oplosmiddelen zullen chemische componenten uit veel kunststoffen halen die de daaropvolgende analyses verstoren. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een uitzond...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

De methoden voor kleine en grootschalige ganglioside-extractie en -isolatie die hier worden gerapporteerd, zijn niet uniek - er zijn veel verschillende oplosmiddelextractie- en zuiveringsbenaderingen die uitstekende resultaten opleveren12. De hier gerapporteerde methoden voor kleinschalige zuivering uit de hersenen, van Fredman en Svennerholm13, bleken het herstel te optimaliseren en hebben gedurende vele jaren in ons laboratorium bewezen robuust en eenvoudig te zijn. Isola...

Gangliosiden worden gedefinieerd als glycosfingolipiden met een of meer siaalzuurresiduen1. Ze komen voornamelijk tot expressie aan het celoppervlak met hun hydrofobe ceramide lipidegroep ingebed in de buitenste klep van het plasmamembraan en hun hydrofiele glycanen die zich uitstrekken tot in de extracellulaire ruimte2. Hoewel ze wijd verspreid zijn in gewervelde cellen en weefsels, zijn ze vooral overvloedig aanwezig in de hersenen van gewervelde dieren3, waar ze voor het eerst werden ontdekt en benoemd4.
De structuren van ganglioside glycanen variëren en vormen de basis voor hun nomenclatuur (figuur 1). Ganglioside glycanen bestaan uit een neutrale suikerkern met verschillende nummers en verdelingen van siaalzuren. Het kleinste ganglioside, GM4, heeft slechts twee suikers (siaalzuur gebonden aan galactose)5. Grotere natuurlijk voorkomende gangliosiden kunnen meer dan een dozijn totale suikers6 of maximaal zeven siaalzuren bevatten op een enkele neutrale kern7. Hun ceramide lipide moieties variëren ook, met verschillende sfingosine lengtes en een verscheidenheid aan vetzuuramiden. In de hersenen van gewervelde dieren overheersen vier ganglioside-soorten, GM1, GD1a, GD1b en GT1b. Ganglioside-expressie is ontwikkelingsreguleerd, weefselspecifiek en celtypespecifiek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figuur 1: Belangrijke hersengangliosiden en hun biosynthetische voorlopers. Structuren worden weergegeven met behulp van symboolnomenclatuur voor glycanen11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Gangliosiden functioneren op moleculair niveau door eiwitten in hun eigen membranen te betrekken en te moduleren (cis-regulatie) of door glycaanbindende eiwitten in het extracellulaire milieu te betrekken, inclusief bacteriële toxines en lectines op andere cellen (transherkenning)3. Specifieke binding van gangliosiden aan regulerende eiwitten en / of zelfassociatie met andere moleculen in lipidevlotten resulteert in veranderingen in celgedrag die van invloed zijn op de structuur en functie van het zenuwstelsel, kankerprogressie, metabolisme, ontsteking, neuronale proteïnopathieën en infectieziekten8. Vanwege hun diverse cellulaire rollen kunnen methoden voor hun isolatie en analyse verbeterde inzichten bieden in de regulatie van fysiologische en pathologische processen. Hier worden gevalideerde methoden voor snelle kleinschalige extractie en analyse en preparatieve schaalisolatie van gangliosiden uit de hersenen verstrekt. Kansen en uitdagingen voor toepassing op andere weefsels worden besproken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosiden zijn glycosfingolipiden die een of meer siaalzuurresiduen bevatten. Ze zijn te vinden op alle gewervelde cellen en weefsels, maar zijn vooral overvloedig aanwezig in de hersenen. Voornamelijk uitgedrukt op de buitenste folder van de plasmamembranen van cellen, moduleren ze de activiteiten van celoppervlakeiwitten via laterale associatie, fungeren ze als receptoren in cel-celinteracties en zijn ze doelwitten voor pathogenen en toxines. Genetische ontregeling van ganglioside biosynthese bij de mens resulteert in ernstige aangeboren aandoeningen van het zenuwstelsel. Vanwege hun amfipathische aard vereisen extractie, zuivering en analyse van gangliosiden technieken die door veel onderzoekers in de 80 jaar sinds hun ontdekking zijn geoptimaliseerd. Hier beschrijven we bench-level methoden voor de extractie, zuivering en voorlopige kwalitatieve en kwantitatieve analyses van belangrijke gangliosiden uit weefsels en cellen die in een paar uur kunnen worden voltooid. We beschrijven ook methoden voor grootschalige isolatie en zuivering van belangrijke ganglioside soorten uit de hersenen. Samen bieden deze methoden analytische en preparatieve schaaltoegang tot deze klasse van bioactieve moleculen.

De in rubriek 1 (kleinschalig) beschreven methoden bieden gangliosiden in voldoende hoeveelheid en zuiverheid voor kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van belangrijke hersengangliosiden. Herstel van muizenhersenen is ~ 1 μmol ganglioside per g nat gewicht in de hersenen (1 nmol / μL) wanneer bereid zoals beschreven. TLC-resolutie van 1 μL (1 nmol) met behulp van sectie 3 biedt voldoende materiaal voor resorcinoldetectie en lost alle belangrijke hersengangliosiden op zoals weergegeven voor wilde en genetisch gemodif...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosiden zijn siaalzuurhoudende glycosfingolipiden die bijzonder overvloedig aanwezig zijn in de hersenen. Hun amfipathische aard vereist organische /waterige extractie- en zuiveringstechnieken om optimaal herstel en nauwkeurige analyses te garanderen. Dit artikel biedt een overzicht van analytische en preparatieve schaal ganglioside extractie, zuivering en dunne laag chromatografie analyse.

Ganglioside extractie, zuivering en profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliosiden komen tot expressie op alle gewervelde celoppervlakken en zijn vooral overvloedig aanwezig op zenuwcellen. Ze reguleren celsignalering en celcelherkenning. Dit protocol introduceert ganglioside isolatie en analyse.De technieken werden geselecteerd om de gangliosideopbrengsten op grote en kleine schaal te maximaliseren en tegelijkertijd de zuivering te stroomlijnen. We beschrijven ook methoden om relatief snel kwalitatieve en semikwantitatieve ganglioside analyses uit te voeren. Onderzoek naar lipiden, vooral polaire lipiden zoals gangliosiden, vereist andere hulpmiddelen en technieken dan het werken met eiwitten of nucleïnezuren.Deze video maakt je vertrouwd met hoe je met deze moleculen kunt werken. Omdat oplosmiddelen zoals chloroform en tetrahydrofuran veel voorkomende kunststoffen oplossen, gebruiken we glazen flessen en flacons met met teflon beklede doppen, glazen pipetten, glas, roestvrijstalen microsyringes en teflonglashomogenisatoren tijdens deze procedures. Als u dit niet doet, resulteert dit in plastic polymeren in de producten die de analyses kunnen verstoren.Voeg om te beginnen 4,1 milliliter water per gram weefsel nat gewicht toe en homogeniseer het met 10 slagen. Voeg 13 milliliter methanol per gram weefsel toe. Breng het over naar een omgevingstemperatuur van 22 graden Celsius en meng.Breng het weefsel over naar een dikwandige, glazen buis met schroefdeksel met een PTFE-gevoerde schroefdop en meng grondig. Voeg 6,5 milliliter chloroform per gram weefsel toe, dop het af en meng grondig. Centrifugeer op 450 maal g gedurende 15 minuten.Breng vervolgens het heldere supernatant over naar een verse buis met schroefdeksel en meet het volume als teruggewonnen extractvolume. Voeg voor partitionering 0,173 keer het teruggewonnen extractvolume water toe aan het heldere supernatant. Sluit het dan af.Vortex krachtig. Centrifugeer op 450 maal g gedurende 15 minuten. Breng de bovenste fase, die de gangliosiden bevat, over in een verse, glazen buis met een met PTFE beklede schroefdop.Als u reverse-phase cartridge chromatography wilt uitvoeren, gebruikt u een glazen spuit van vijf milliliter om een tC18 vastefasige extractiecartridge te wassen met drie milliliter methanol. Voeg vervolgens drie milliliter chloroform-methanol-water toe in een verhouding van twee tot 43 tot 55. Laad de bovenste fase van de vorige stap op de tC18-patroon door dezelfde glazen spuit.Verzamel de doorstroming en laad deze opnieuw op de kolom om de adsorptie te optimaliseren. Was de patroon met drie milliliter chloroform-methanol-water en vervolgens met drie milliliter methanol-water. Eluteer de gangliosiden met drie milliliter methanol in een verse buis met schroefdeksel.Verdamp tot een droge onder een zachte stroom stikstof bij een temperatuur lager dan of gelijk aan 45 graden Celsius. Los op in methanol met één milliliter per gram oorspronkelijk weefsel nat gewicht. Doe 100 gram grijze stof in de hersenen in een blender en voeg een milliliter per gram hersenvochtig gewicht gekoelde, 10-millimolar kaliumfosfaatbuffer van pH 6,8 toe.Homogeneer vervolgens gedurende 20 seconden op laag. Voeg acht milliliter tetrahydrofuraan per gram hersenvochtig gewicht toe en homogeniseer gedurende 10 seconden op laag. Decanteer in glazen centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 5.000 maal g.Verzamel het supernatant, meet het volume en breng het vervolgens over naar een glazen scheidingstrechter. Voeg 0,3 milliliter ethylether per milliliter van het supernatant toe. Schud krachtig.Laat het vervolgens 30 minuten ongestoord zitten, waarbij twee fasen, een bovenste etherfase en een lagere waterige fase, zich scheiden. Verzamel de onderste fase, die de gangliosiden bevat, in een glazen fles met een ptfe-gevoerde dop. Voeg aan de bovenste etherfase die in de separatortrechter overblijft 0,1 milliliter water per milliliter oorspronkelijk supernatant uit de vorige stap toe.Schud krachtig. Laat fasen scheiden. Verzamel vervolgens de onderste waterige fase en combineer deze met de eerder verzamelde lagere fase.Verdamp de gecombineerde onderste fasen tot een droog poeder en weeg het. Om omgekeerde fasechromatografie uit te voeren, moet u een grootschalige tC18 vastefasige extractiepatroon voorspoelen door 50 milliliter oplosmiddelen door de kolom te laten gaan met behulp van vacuüm of druk gedurende minder dan één minuut per wasbeurt. Belast de bovenste fase van de scheiding na verzepingsfase op de kolom door vacuüm of druk.Verzamel vervolgens de doorstroming, laad deze opnieuw en verzamel de doorstroming opnieuw voor latere analyse. Was de kolom met elk 30 milliliter chloroform-methanol-water, gevolgd door methanol-water. Elueer vervolgens de gangliosiden met 50 milliliter methanol en dan weer met 10 milliliter methanol.Verzamel elke was en elutie afzonderlijk. Gebruik dunnelaagchromatografie, of TLC, om te bevestigen dat gangliosiden afwezig zijn in de doorstroom en wassingen en geëlueerd in de eerste elutie van methanol. Verdamp de geëlueerde gangliosiden tot een droog poeder en weeg ze.Om TLC uit te voeren, giet u het oplosmiddel in een glazen TLC-kamer van 10 bij 10 centimeter met een roestvrijstalen deksel, zodat de oplosmiddeldiepte 0,5 centimeter is. Bedek de kamer en laat deze ongeveer 10 minuten in evenwicht blijven. Was een Hamilton-spuit van 10 microliter met een afgeschuinde naald met methanol.Trek één microliter methanol in een glazen spuit om het naalddoodvolume te vullen en vervolgens één microliter monster of standaard. Plaats het monster gelijkmatig op de vooraf gemarkeerde lijnen van vijf millimeter totdat er minder dan één microliter methanoloplosmiddel in de spuit achterblijft. Laat de plaat drogen bij 22 graden Celsius nadat alle monsters zijn gespot.Plaats de gevlekte en gedroogde plaat op de voorgebalanceerde TLC-kamer met de onderrand ondergedompeld in het oplosmiddel. Laat het lopende oplosmiddel door capillaire werking de plaat opschuiven totdat de voorkant van het oplosmiddel binnen een centimeter van de bovenkant van de plaat komt. Verwijder en markeer de voorkant van het oplosmiddel aan de rand van de plaat met een potlood.Laat de oplosmiddelen volledig ongestoord of onder een milde luchtstroom verdampen. Plaats in een chemische zuurkast de TLC-plaat met de opgeloste gangliosidenoorsprong ondersteboven in een weggesneden kartonnen doos om de wanden van de kap te beschermen tegen zure spray. Plaats resorcinol spray reagens in een glazen TLC sproeier.Bevestig het aan een bron van stikstof onder druk en spuit de plaat licht diagonaal in de verticale en horizontale richting. Bedek de plaat onmiddellijk met een schone, droge, glazen afdekplaat van dezelfde afmetingen en bevestig de afdekplaat op zijn plaats met bindmiddelclips. Verwarm de afgedekte plaat gedurende 20 minuten op 125 graden Celsius.Gangliosiden zien er donkerpaars uit tegen een witte achtergrond. Om lipidekleuring uit te voeren, dompelt u de TLC-plaat met de opgeloste gangliosidenoorsprong naar beneden in een bekerglas met de anisaldehydekleuring. Dompel je iets meer dan twee seconden onder naar het lopende front.Laat het dan uitlekken. Verwarm de TLC-plaat op een hete plaat op een lage temperatuur om zich te ontwikkelen. Dit protocol biedt gangliosiden in voldoende hoeveelheid en zuiverheid voor kwalitatieve en kwantitatieve bepaling.TLC-resolutie van één microliter biedt voldoende materiaal voor resorcinoldetectie en lost alle belangrijke hersengangliosiden op voor wildtype en genetisch gemodificeerde muizen. Hoewel de bereide gemengde gangliosiden niet vrij zijn van andere belangrijke lipiden, zijn ze van voldoende zuiverheid voor massaspectrometrische bepaling, hetzij als inheemse gezuiverde gangliosiden in negatieve modus of na pre-methylatie in positieve modus. Grootschalige zuivering omvat extractie, verzeping en HPLC-resolutie om gezuiverde belangrijke hersengangliosiden te bieden die geschikt zijn voor biologische experimenten en voor verdere chemische en enzymatische modificaties.Een voorbeeldig HPLC-profiel en daaropvolgende TLC-analyse worden getoond. Alkalibehandeling, of verzeping, is noodzakelijk om verontreinigende fosfolipiden te hydrolyseren en te verwijderen, maar zal ook natuurlijke modificaties van gangliosiden zoals O-geacetyleerde siaalzuren hydrolyseren, wat in sommige contexten belangrijk kan zijn. Nauwkeurige oplosmiddelverhoudingen voor extractie, oplosmiddelverdeling en TLC-resolutie zijn van cruciaal belang om het herstel, de zuiverheid en analyses te verbeteren.Van kanker tot metabolisme tot hersenfunctie, gangliosiden zijn fysiologische modifiers en therapeutische doelen. Ganglioside-isolatie, zuivering en analyses zijn hoekstenen voor biomedische ontdekking en therapeutische ontwikkeling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratoriumschaal Productie en zuivering van een therapeutisch antilichaam

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extractie en analyse van Taiwanese groene Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...