Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par la subvention U01CA241953 du Fonds commun des National Institutes of Health (NIH) pour la glycoscience. MJP a été soutenu par le programme d’interface chimie-biologie de Johns Hopkins (T32GM080189).

Le prélèvement de tissus a été effectué dans les conditions autorisées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins.
1. Extraction de gangliosides à petite échelle et purification partielle
ATTENTION : Utilisez une ventilation appropriée lorsque vous travaillez avec des solvants volatils et toxiques. Évitez le plastique partout; les solvants extraient les composants chimiques de nombreux plastiques qui interfèrent avec les analyse...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Les méthodes d’extraction et d’isolement des gangliosides à petite et à grande échelle décrites ici ne sont pas uniques - il existe de nombreuses approches différentes d’extraction et de purification par solvant qui donnent d’excellents résultats12. Les méthodes rapportées ici pour la purification à petite échelle du cerveau, de Fredman et Svennerholm13, ont été montrées pour optimiser la récupération et se sont avérées robustes et simples pendant ...

Les gangliosides sont définis comme des glycosphingolipides portant un ou plusieurs résidus d’acide sialique1. Ils sont exprimés principalement à la surface de la cellule avec leur fraction lipidique céramide hydrophobe intégrée dans la feuillet externe de la membrane plasmique et leurs glycanes hydrophiles s’étendant dans l’espace extracellulaire2. Bien que largement distribués dans les cellules et les tissus des vertébrés, ils sont particulièrement abondants dans le cerveau des vertébrés3, où ils ont été découverts et nommés pour la première fois4.
Les structures des glycanes gangliosides varient et constituent la base de leur nomenclature (Figure 1). Les glycanes gangliosides sont constitués d’un noyau de sucre neutre portant différents nombres et distributions d’acides sialiques. Le plus petit ganglioside, GM4, ne contient que deux sucres (acide sialique lié au galactose)5. Les gangliosides naturels plus gros peuvent contenir plus d’une douzaine de sucres totaux6 ou jusqu’à sept acides sialiques sur un seul noyau neutre7. Leurs fractions lipidiques céramides varient également, ayant différentes longueurs de sphingosine et une variété d’amides d’acides gras. Dans le cerveau des vertébrés, quatre espèces de gangliosides, GM1, GD1a, GD1b et GT1b prédominent. L’expression du ganglioside est régulée par le développement, spécifique au tissu et spécifique au type de cellule.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figure 1 : Principaux gangliosides cérébraux et leurs précurseurs biosynthétiques. Les structures sont présentées à l’aide de la nomenclature des symboles pour les glycanes11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les gangliosides fonctionnent au niveau moléculaire en engageant et en modulant les protéines dans leurs propres membranes (régulation cis) ou en engageant les protéines de liaison aux glycanes dans le milieu extracellulaire, y compris les toxines bactériennes et les lectines sur d’autres cellules (trans reconnaissance)3. La liaison spécifique des gangliosides aux protéines régulatrices et/ou l’auto-association avec d’autres molécules dans des radeaux lipidiques entraîne des changements dans le comportement cellulaire qui ont un impact sur la structure et la fonction du système nerveux, la progression du cancer, le métabolisme, l’inflammation, les protéinopathies neuronales et les maladies infectieuses8. En raison de leurs divers rôles cellulaires, les méthodes d’isolement et d’analyse peuvent fournir des informations améliorées sur la régulation des processus physiologiques et pathologiques. Ici, des méthodes validées pour l’extraction et l’analyse rapides à petite échelle, et l’isolement à l’échelle préparative des gangliosides du cerveau sont fournis. Les possibilités et les défis liés à l’application à d’autres tissus sont discutés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Les gangliosides sont des glycosphingolipides qui contiennent un ou plusieurs résidus d’acide sialique. Ils se trouvent sur toutes les cellules et tissus des vertébrés, mais sont particulièrement abondants dans le cerveau. Exprimés principalement sur la feuillet externe des membranes plasmiques des cellules, ils modulent les activités des protéines de surface cellulaire par association latérale, agissent comme récepteurs dans les interactions cellule-cellule et sont des cibles pour les agents pathogènes et les toxines. La dérégulation génétique de la biosynthèse des gangliosides chez l’homme entraîne de graves troubles congénitaux du système nerveux. En raison de leur nature amphipathique, l’extraction, la purification et l’analyse des gangliosides nécessitent des techniques qui ont été optimisées par de nombreux chercheurs au cours des 80 années qui ont suivi leur découverte. Nous décrivons ici des méthodes au niveau du banc pour l’extraction, la purification et les analyses qualitatives et quantitatives préliminaires des principaux gangliosides de tissus et de cellules qui peuvent être complétées en quelques heures. Nous décrivons également des méthodes d’isolement et de purification à plus grande échelle des principales espèces de gangliosides du cerveau. Ensemble, ces méthodes fournissent un accès à l’échelle analytique et préparative à cette classe de molécules bioactives.

Les méthodes décrites à la rubrique 1 (petite échelle) fournissent des gangliosides en quantité et en pureté suffisantes pour la détermination qualitative et quantitative des principaux gangliosides cérébraux. La récupération du cerveau de la souris est d’environ 1 μmol de ganglioside par g de poids humide du cerveau (1 nmol / μL) lorsqu’il est préparé comme décrit. La résolution TLC de 1 μL (1 nmol) à l’aide de la section 3 fournit suffisamment de matériel pour la détection du résorcinol et r...

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Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Les gangliosides sont des glycosphingolipides porteurs d’acide sialique qui sont particulièrement abondants dans le cerveau. Leur nature amphipathique nécessite des techniques d’extraction et de purification organiques/aqueuses pour assurer une récupération optimale et des analyses précises. Cet article fournit des aperçus de l’extraction, de la purification et de l’analyse par chromatographie sur couche mince à l’échelle analytique et préparative.

Extraction, purification et profilage des gangliosides

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Les gangliosides sont exprimés sur toutes les surfaces cellulaires des vertébrés et sont particulièrement abondants sur les cellules nerveuses. Ils régulent la signalisation cellulaire et la reconnaissance cellule-cellule. Ce protocole introduit l’isolement et l’analyse gangliosides.Les techniques ont été sélectionnées pour maximiser les rendements en ganglioside à grande et à petite échelle tout en rationalisant la purification. Nous décrivons également des méthodes permettant d’effectuer relativement rapidement des analyses qualitatives et semi-quantitatives des gangliosides. L’étude des lipides, en particulier des lipides polaires comme les gangliosides, nécessite des outils et des techniques différents de ceux du travail avec des protéines ou des acides nucléiques.Cette vidéo vous familiarise avec la façon de travailler avec ces molécules. Parce que les solvants tels que le chloroforme et le tétrahydrofurane dissolvent les plastiques courants, nous utilisons des bouteilles et des flacons en verre avec des bouchons doublés de téflon, des pipettes en verre, du verre, des microsyringes en acier inoxydable et des homogénéisateurs en verre téflon tout au long de ces procédures. Si vous ne le faites pas, les produits contiennent des polymères plastiques qui peuvent interférer avec les analyses.Pour commencer, ajoutez 4,1 millilitres d’eau par gramme de poids humide tissulaire et homogénéisez-le avec 10 coups. Ajouter 13 millilitres de méthanol par gramme de tissu. Transférez-le à une température ambiante de 22 degrés Celsius et mélangez.Transférez le tissu dans un tube à paroi épaisse, en verre et à bouchon vissé avec un bouchon à vis doublé de PTFE, et mélangez bien. Ajouter 6,5 millilitres de chloroforme par gramme de tissu, le coiffer et bien mélanger. Centrifuger à 450 fois g pendant 15 minutes.Transférez ensuite le surnageant clair dans un tube frais à bouchon vissé et mesurez le volume en tant que volume d’extrait récupéré. Pour le partitionnement, ajoutez 0,173 fois le volume d’extrait d’eau récupéré au surnageant clair. Ensuite, plafonnez-le.Vortex vigoureusement. Centrifuger à 450 fois g pendant 15 minutes. Transférer la phase supérieure, qui contient les gangliosides, dans un tube en verre frais avec un bouchon à vis doublé de PTFE.Pour effectuer une chromatographie sur cartouche en phase inverse, utilisez une seringue en verre de cinq millilitres pour laver une cartouche d’extraction en phase solide tC18 avec trois millilitres de méthanol. Ajoutez ensuite trois millilitres de chloroforme-méthanol-eau dans un rapport de deux à 43 à 55. Chargez la phase supérieure de l’étape précédente sur la cartouche tC18 à l’aide de la même seringue en verre.Collectez le flux et rechargez-le sur la colonne pour optimiser l’adsorption. Lavez la cartouche avec trois millilitres de chloroforme-méthanol-eau, puis avec trois millilitres de méthanol-eau. Éluez les gangliosides avec trois millilitres de méthanol dans un tube frais à bouchon vissé.Évaporez-vous à sec sous un doux jet d’azote à une température inférieure ou égale à 45 degrés Celsius. Dissoudre dans le méthanol à un millilitre par gramme de poids humide des tissus d’origine. Placez 100 grammes de matière grise cérébrale dans un mélangeur et ajoutez un millilitre par gramme de poids humide du cerveau réfrigéré de 10 millimolaires tampon de phosphate de potassium de pH 6,8.Homogénéiser ensuite à basse température pendant 20 secondes. Ajouter huit millilitres de tétrahydrofurane par gramme de poids humide du cerveau et homogénéiser à faible intensité pendant 10 secondes. Décanter dans des bouteilles de centrifugeuse en verre et centrifuger à 5 000 fois g pendant 15 minutes.Collectez le surnageant, mesurez son volume, puis transférez-le dans un entonnoir séparateur de verre. Ajouter 0,3 millilitre d’éther éthylique par millilitre du surnageant. Agiter vigoureusement.Ensuite, laissez-le reposer sans être dérangé pendant 30 minutes, au cours desquelles deux phases, une phase éther supérieure et une phase aqueuse inférieure, se séparent. Recueillir la phase inférieure, qui contient les gangliosides, dans une bouteille en verre avec un bouchon doublé de PTFE. À la phase supérieure de l’éther restant dans l’entonnoir de séparation, ajoutez 0,1 millilitre d’eau par millilitre de surnageant d’origine de l’étape précédente.Agiter vigoureusement. Laissez les phases se séparer. Ensuite, collectez la phase aqueuse inférieure et combinez-la avec la phase inférieure précédemment collectée.Évaporez les phases inférieures combinées en une poudre sèche et pesez-la. Pour effectuer une chromatographie en phase inverse, prélavez une cartouche d’extraction en phase solide tC18 à grande échelle en faisant passer 50 millilitres de solvants à travers la colonne en utilisant le vide ou la pression pendant moins d’une minute par lavage. Chargez la phase supérieure de la séparation de phase post-saponification sur la colonne par vide ou pression.Ensuite, collectez le flux entrant, rechargez-le et collectez à nouveau le flux pour une analyse ultérieure. Laver la colonne avec 30 millilitres chacun de chloroforme-méthanol-eau, suivi de méthanol-eau. Ensuite, éluez les gangliosides avec 50 millilitres de méthanol, puis à nouveau avec 10 millilitres de méthanol.Collectez chaque lavage et élution séparément. Utilisez la chromatographie sur couche mince, ou TLC, pour confirmer que les gangliosides sont absents de l’écoulement et des lavages et élués lors de la première élution du méthanol. Évaporez les gangliosides élués en une poudre sèche et pesez-les.Pour effectuer le TLC, versez le solvant courant dans une chambre TLC en verre de 10 x 10 centimètres avec un couvercle en acier inoxydable afin que la profondeur du solvant soit de 0,5 centimètre. Couvrez la chambre et laissez-la s’équilibrer pendant environ 10 minutes. Lavez une seringue Hamilton de 10 microlitres avec une aiguille biseautée à l’aide de méthanol.Aspirez un microlitre de méthanol dans une seringue en verre pour remplir le volume mort de l’aiguille, puis un microlitre d’échantillon ou d’étalon. Repérez l’échantillon uniformément sur les lignes pré-marquées de cinq millimètres jusqu’à ce qu’il reste moins d’un microlitre de solvant méthanol dans la seringue. Laissez la plaque sécher à 22 degrés Celsius après que tous les échantillons ont été repérés.Placez la plaque tachetée et séchée sur la chambre TLC prééquilibrée avec le bord inférieur immergé dans le solvant en cours d’exécution. Laissez le solvant en cours d’exécution avancer vers le haut de la plaque par action capillaire jusqu’à ce que le front du solvant atteigne à moins d’un centimètre du sommet de la plaque. Retirez et marquez le front du solvant sur le bord de la plaque avec un crayon.Laissez les solvants s’évaporer complètement sans être dérangés ou sous un flux d’air doux. Dans une hotte à fumée chimique, placez la plaque TLC avec l’extrémité d’origine des gangliosides résolus à l’envers dans une boîte en carton découpée pour protéger les parois de la hotte des projections acides. Placez le réactif de pulvérisation de résorcinol dans un pulvérisateur TLC en verre.Fixez-la à une source d’azote sous pression et vaporisez légèrement la plaque en diagonale dans les directions verticale et horizontale. Couvrez immédiatement la plaque avec une plaque de couverture en verre propre et sèche de mêmes dimensions et fixez la plaque de couverture en place avec des clips de liant. Chauffer la plaque couverte à 125 degrés Celsius pendant 20 minutes.Les gangliosides apparaîtront violet foncé sur un fond blanc. Pour effectuer la coloration lipidique, trempez la plaque TLC avec le côté d’origine des gangliosides résolus vers le bas dans un bécher contenant la tache d’anisaldéhyde. Immergez-vous vers l’avant pendant un peu plus de deux secondes.Ensuite, laissez-le s’écouler. Chauffer la plaque TLC sur une plaque chauffante à basse température pour la développer. Ce protocole fournit des gangliosides en quantité et en pureté suffisantes pour la détermination qualitative et quantitative.La résolution TLC d’un microlitre fournit suffisamment de matériel pour la détection du résorcinol et résout tous les principaux gangliosides cérébraux pour les souris de type sauvage et génétiquement modifiées. Bien que les gangliosides mélangés préparés ne soient pas exempts d’autres lipides majeurs, ils sont d’une pureté suffisante pour la détermination par spectrométrie de masse, soit sous forme de gangliosides purifiés natifs en mode négatif, soit après pré-méthylation en mode positif. La purification à grande échelle comprend l’extraction, la saponification et la résolution HPLC pour fournir des gangliosides cérébraux majeurs purifiés adaptés aux expériences biologiques et à d’autres modifications chimiques et enzymatiques.Un profil HPLC exemplaire et une analyse TLC ultérieure sont présentés. Le traitement alcalin, ou saponification, est nécessaire pour hydrolyser et éliminer les phospholipides contaminants, mais hydrolysera également les modifications naturelles des gangliosides tels que les acides sialiques O-acétylés, ce qui peut être important dans certains contextes. Des rapports de solvant précis pour l’extraction, le partage des solvants et la résolution TLC sont essentiels pour améliorer la récupération, la pureté et les analyses.Du cancer au métabolisme en passant par le fonctionnement du cerveau, les gangliosides sont des modificateurs physiologiques et des cibles thérapeutiques. L’isolement, la purification et les analyses des gangliosides sont les pierres angulaires de la découverte biomédicale et du développement thérapeutique.

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Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expression et Purification des canaux ioniques de mammifères Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraction et analyse des taïwanaise Propolis verte

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expression, solubilisation et Purification des transporteurs de Borate eucaryotes

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Profilage et identification de Nitropeptide illustrépar Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...