Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience Grant U01CA241953 unterstützt. MJP wurde vom Chemistry-Biology Interface Program an der Johns Hopkins University (T32GM080189) unterstützt.

Die Gewebeentnahme erfolgte unter Bedingungen, die vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.
1. Grubengangliosidextraktion in kleinem Maßstab und teilweise Reinigung
ACHTUNG: Verwenden Sie eine angemessene Belüftung, wenn Sie mit flüchtigen und toxischen Lösungsmitteln arbeiten. Vermeiden Sie durchgehend Plastik; Lösungsmittel extrahieren chemische Komponenten aus vielen Kunststoffen, die nachfolgende Analysen stören. Polytetrafluorethyle...

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	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden zur Extraktion und Isolierung von Gangliosid in kleinem und großem Maßstab sind nicht einzigartig - es gibt viele verschiedene Lösungsmittelextraktions- und Reinigungsansätze, die hervorragende Ergebnisse liefern12. Die hier berichteten Methoden zur Reinigung in kleinem Maßstab aus dem Gehirn, von Fredman und Svennerholm13, haben gezeigt, dass sie die Rückgewinnung optimieren und sich über viele Jahre in unserem Labor als robust und un...

Ganglioside sind definiert als Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten1. Sie werden hauptsächlich an der Zelloberfläche exprimiert, wobei ihr hydrophober Ceramidlipidanteil in das äußere Blatt der Plasmamembran eingebettet ist und ihre hydrophilen Glykane sich in den extrazellulären Raum erstrecken2. Obwohl sie in Wirbeltierzellen und -geweben weit verbreitet sind, sind sie besonders häufig im Wirbeltiergehirn3, wo sie zuerst entdeckt und benannt wurden4.
Die Strukturen der Gangliosidglykane variieren und bilden die Grundlage für ihre Nomenklatur (Abbildung 1). Gangliosidglykane bestehen aus einem neutralen Zuckerkern, der unterschiedliche Anzahlen und Verteilungen von Sialinsäuren trägt. Das kleinste Gangliosid, GM4, hat nur zwei Zucker (Sialinsäure, die an Galaktose gebunden ist)5. Größere natürlich vorkommende Ganglioside können weit über ein Dutzend Gesamtzucker enthalten6 oder bis zu sieben Sialinsäuren auf einem einzigen neutralen Kern7. Ihre Ceramidlipidanteile variieren ebenfalls und haben unterschiedliche Sphingosinlängen und eine Vielzahl von Fettsäureamiden. Im Wirbeltiergehirn dominieren vier Gangliosidspezies, GM1, GD1a, GD1b und GT1b. Die Gangliosidexpression ist entwicklungsreguliert, gewebespezifisch und zelltypspezifisch.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Abbildung 1: Wichtige Hirnganglioside und ihre biosynthetischen Vorläufer. Strukturen werden mit der Symbolnomenklatur für Glykane angezeigt11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ganglioside wirken auf molekularer Ebene, indem sie Proteine in ihren eigenen Membranen einbinden und modulieren (cis-Regulation) oder indem sie Glykan-bindende Proteine im extrazellulären Milieu, einschließlich bakterieller Toxine und Lektine auf anderen Zellen (Trans-Erkennung), einsetzen3. Die spezifische Bindung von Gangliosiden an regulatorische Proteine und/oder die Selbstassoziation mit anderen Molekülen zu Lipidflößen führt zu Veränderungen des Zellverhaltens, die sich auf die Struktur und Funktion des Nervensystems, das Fortschreiten von Krebs, den Stoffwechsel, Entzündungen, neuronale Proteinopathien und Infektionskrankheiten auswirken8. Aufgrund ihrer vielfältigen zellulären Rollen können Methoden zu ihrer Isolierung und Analyse verbesserte Einblicke in die Regulation physiologischer und pathologischer Prozesse liefern. Hier werden validierte Methoden für die schnelle Extraktion und Analyse im kleinen Maßstab und die präparative Isolierung von Gangliosiden aus dem Gehirn bereitgestellt. Chancen und Herausforderungen für die Anwendung auf andere Gewebe werden diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Ganglioside sind Glykosphingolipide, die einen oder mehrere Sialinsäurereste enthalten. Sie kommen auf allen Wirbeltierzellen und -geweben vor, sind aber im Gehirn besonders häufig. Sie werden hauptsächlich auf dem äußeren Blatt der Plasmamembranen von Zellen exprimiert, modulieren die Aktivitäten von Zelloberflächenproteinen durch laterale Assoziation, fungieren als Rezeptoren in Zell-Zell-Interaktionen und sind Ziele für Krankheitserreger und Toxine. Genetische Dysregulation der Gangliosid-Biosynthese beim Menschen führt zu schweren angeborenen Erkrankungen des Nervensystems. Aufgrund ihrer amphipathischen Natur erfordern die Extraktion, Reinigung und Analyse von Gangliosiden Techniken, die von vielen Forschern in den 80 Jahren seit ihrer Entdeckung optimiert wurden. Hier beschreiben wir Methoden auf Laborebene für die Extraktion, Reinigung und vorläufige qualitative und quantitative Analysen der wichtigsten Ganglioside aus Geweben und Zellen, die in wenigen Stunden abgeschlossen werden können. Wir beschreiben auch Methoden zur großflächigen Isolierung und Reinigung der wichtigsten Gangliosidspezies aus dem Gehirn. Zusammen bieten diese Methoden analytischen und präparativen Zugang zu dieser Klasse bioaktiver Moleküle.

Die in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden (kleiner Maßstab) liefern Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung der wichtigsten Hirnganglioside. Die Erholung aus dem Gehirn der Maus beträgt ~ 1 μmol Gangliosid pro g Nassgewicht des Gehirns (1 nmol / μL), wenn es wie beschrieben zubereitet wird. Die TLC-Auflösung von 1 μL (1 nmol) unter Verwendung von Abschnitt 3 liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside auf...

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Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ganglioside sind Sialinsäure-tragende Glykosphingolipide, die im Gehirn besonders häufig vorkommen. Ihre amphipathische Natur erfordert organische/wässrige Extraktions- und Reinigungstechniken, um eine optimale Erholung und genaue Analysen zu gewährleisten. Dieser Artikel bietet einen Überblick über die analytische und präparative Gangliosidextraktion, -reinigung und -chromatographie-Analyse.

Gangliosidextraktion, -reinigung und -profilierung

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Ganglioside werden auf allen Zelloberflächen von Wirbeltieren exprimiert und sind besonders häufig auf Nervenzellen vorhanden. Sie regulieren die Zellsignalisierung und die Zell-Zell-Erkennung. Dieses Protokoll führt die Gangliosidisolierung und -analyse ein.Die Techniken wurden ausgewählt, um die Gangliosiderträge im Großen und Kleinen zu maximieren und gleichzeitig die Reinigung zu rationalisieren. Wir beschreiben auch Methoden, um relativ schnell qualitative und semiquantitative Gangliosidanalysen durchzuführen. Das Studium von Lipiden, insbesondere von polaren Lipiden wie Gangliosiden, erfordert andere Werkzeuge und Techniken als die Arbeit mit Proteinen oder Nukleinsäuren.Dieses Video macht Sie mit der Arbeit mit diesen Molekülen vertraut. Da Lösungsmittel wie Chloroform und Tetrahydrofuran gängige Kunststoffe lösen, verwenden wir während dieser Verfahren Glasflaschen und Fläschchen mit Teflon-ausgekleideten Kappen, Glaspipetten, Glas, Edelstahl-Mikrospritzen und Teflonglas-Homogenisatoren. Andernfalls entstehen Kunststoffpolymere in den Produkten, die die Analysen stören können.Fügen Sie zunächst 4,1 Milliliter Wasser pro Gramm Gewebenassgewicht hinzu und homogenisieren Sie es mit 10 Hüben. Fügen Sie 13 Milliliter Methanol pro Gramm Gewebe hinzu. Auf eine Umgebungstemperatur von 22 Grad Celsius übertragen und mischen.Übertragen Sie das Gewebe in ein dickwandiges, verschraubtes Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Schraubverschluss und mischen Sie es gründlich. Fügen Sie 6,5 Milliliter Chloroform pro Gramm Gewebe hinzu, verschließen Sie es und mischen Sie es gründlich. Zentrifen Sie bei 450 mal g für 15 Minuten.Übertragen Sie dann den klaren Überstand auf ein frisches, verschraubtes Rohr und messen Sie das Volumen als wiedergewonnenes Extraktvolumen. Für die Partitionierung fügen Sie dem klaren Überstand das 0,173-fache des wiedergewonnenen Wasservolumens hinzu. Dann kappen Sie es.Wirbel kräftig. Zentrifen Sie bei 450 mal g für 15 Minuten. Die obere Phase, die die Ganglioside enthält, wird in ein frisches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Schraubverschluss überführt.Um eine Umkehrphasen-Kartuschenchromatographie durchzuführen, verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Glasspritze, um eine tC18-Festphasenextraktionskartusche mit drei Millilitern Methanol zu waschen. Dann fügen Sie drei Milliliter Chloroform-Methanol-Wasser in einem Verhältnis von zwei zu 43 zu 55 hinzu. Laden Sie die obere Phase aus dem vorherigen Schritt durch dieselbe Glasspritze auf die tC18-Kartusche.Sammeln Sie den Durchfluss und laden Sie ihn erneut auf die Säule, um die Adsorption zu optimieren. Waschen Sie die Kartusche mit drei Millilitern Chloroform-Methanol-Wasser und dann mit drei Millilitern Methanol-Wasser. Die Ganglioside mit drei Millilitern Methanol zu einem frischen, verschraubten Schlauch eluieren.Verdampfen Sie unter einem sanften Stickstoffstrom bei einer Temperatur von weniger als oder gleich 45 Grad Celsius bis zur Trocknung. In Methanol mit einem Milliliter pro Gramm Nassgewicht des ursprünglichen Gewebes auflösen. Geben Sie 100 Gramm graue Substanz des Gehirns in einen Mixer und fügen Sie einen Milliliter pro Gramm Gehirnnassgewicht von gekühltem, 10-millimolarem Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 hinzu.Dann 20 Sekunden lang auf niedrigem Niveau homogenisieren. Fügen Sie acht Milliliter Tetrahydrofuran pro Gramm Gehirnnassgewicht hinzu und homogenisieren Sie es für 10 Sekunden auf niedrigem Niveau. In Glaszentrifugenflaschen dekantieren und 15 Minuten lang mit 5.000 x g zentrifugieren.Sammeln Sie den Überstand, messen Sie sein Volumen und übertragen Sie ihn dann in einen Glastrichter. Fügen Sie 0,3 Milliliter Ethylether pro Milliliter des Überstands hinzu. Kräftig schütteln.Dann lassen Sie es 30 Minuten lang ungestört sitzen, wobei sich zwei Phasen, eine obere Ätherphase und eine untere wässrige Phase, trennen. Sammeln Sie die untere Phase, die die Ganglioside enthält, in eine Glasflasche mit einem mit PTFE ausgekleideten Verschluss. Zu der oberen Ätherphase, die im Separatorentrichter verbleibt, fügen Sie 0,1 Milliliter Wasser pro Milliliter ursprünglichen Überstand aus dem vorherigen Schritt hinzu.Kräftig schütteln. Erlauben Sie die Trennung von Phasen. Dann sammeln Sie die untere wässrige Phase und kombinieren Sie sie mit der zuvor gesammelten unteren Phase.Die kombinierten unteren Phasen zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen. Um eine Umkehrphasenchromatographie durchzuführen, waschen Sie eine großflächige tC18-Festphasen-Extraktionskartusche vor, indem Sie 50 Milliliter Lösungsmittel mit Vakuum oder Druck für weniger als eine Minute pro Waschgang durch die Säule leiten. Laden Sie die obere Phase aus der Phasentrennung nach der Verseifung durch Vakuum oder Druck auf die Säule.Sammeln Sie dann den Durchfluss, laden Sie ihn neu und sammeln Sie den Durchfluss erneut für die nachfolgende Analyse. Waschen Sie die Säule mit je 30 Millilitern Chloroform-Methanol-Wasser, gefolgt von Methanol-Wasser. Dann die Ganglioside mit 50 Millilitern Methanol und dann wieder mit 10 Millilitern Methanol eluieren.Sammeln Sie jede Wäsche und Elution separat. Verwenden Sie die Dünnschichtchromatographie oder TLC, um zu bestätigen, dass Ganglioside im Durchfluss fehlen und in der ersten Elution von Methanol gewaschen und eluiert werden. Die eluierten Ganglioside zu einem trockenen Pulver verdampfen und wiegen.Um TLC durchzuführen, gießen Sie das laufende Lösungsmittel in eine 10 x 10 Zentimeter große TLC-Glaskammer mit einer Edelstahlabdeckung, so dass die Lösungsmitteltiefe 0,5 Zentimeter beträgt. Decken Sie die Kammer ab und lassen Sie sie etwa 10 Minuten lang ausgleichen. Waschen Sie eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit einer abgeschrägten Nadel mit Methanol.Ziehen Sie einen Mikroliter Methanol in eine Glasspritze, um das tote Volumen der Nadel zu füllen, und dann einen Mikroliter Probe oder Standard. Setzen Sie die Probe gleichmäßig auf die fünf Millimeter, vormarkierten Linien, bis weniger als ein Mikroliter Methanollösungsmittel in der Spritze verbleibt. Lassen Sie die Platte bei 22 Grad Celsius trocknen, nachdem alle Proben gesichtet wurden.Legen Sie die gefleckte und getrocknete Platte auf die voräquilibrierte TLC-Kammer, wobei die Unterkante in das laufende Lösungsmittel eingetaucht ist. Lassen Sie das laufende Lösungsmittel durch Kapillarwirkung die Platte hinauffahren, bis die Lösungsmittelfront innerhalb eines Zentimeters von der Oberseite der Platte reicht. Entfernen und markieren Sie die Lösungsmittelfront am Rand der Platte mit einem Bleistift.Lassen Sie die Lösungsmittel entweder ungestört oder unter milder Luftströmung vollständig verdampfen. Legen Sie in einem chemischen Abzug die TLC-Platte mit dem aufgelösten Ganglioside-Ursprung kopfüber in einen abgeschnittenen Karton, um die Wände der Haube vor Säurespray zu schützen. Legen Sie Resorcin Sprühreagenz in ein Glas-TLC-Sprühgerät.Befestigen Sie es an einer Druckstickstoffquelle und sprühen Sie die Platte leicht diagonal in vertikaler und horizontaler Richtung. Decken Sie die Platte sofort mit einer sauberen, trockenen Glasabdeckplatte mit den gleichen Abmessungen ab und befestigen Sie die Abdeckplatte mit Bindemittelclips. Erhitzen Sie die abgedeckte Platte bei 125 Grad Celsius für 20 Minuten.Ganglioside erscheinen dunkelviolett vor weißem Hintergrund. Um eine Lipidfärbung durchzuführen, tauchen Sie die TLC-Platte mit der aufgelösten Gangliosid-Ursprungsseite nach unten in ein Becherglas, das die Anisaldehydfärbung enthält. Tauchen Sie für etwas mehr als zwei Sekunden in die laufende Front ein.Lassen Sie es dann abtropfen. Erhitzen Sie die TLC-Platte auf einer heißen Platte bei niedriger Temperatur, um sich zu entwickeln. Dieses Protokoll liefert Ganglioside in ausreichender Menge und Reinheit für die qualitative und quantitative Bestimmung.Die TLC-Auflösung von einem Mikroliter liefert reichlich Material für den Nachweis von Resorcin und löst alle wichtigen Hirnganglioside für Wildtyp- und genetisch veränderte Mäuse auf. Obwohl die hergestellten gemischten Ganglioside nicht frei von anderen Hauptlipiden sind, sind sie von ausreichender Reinheit für die massenspektrometrische Bestimmung entweder als native gereinigte Ganglioside im negativen Modus oder nach Prämethylierung im positiven Modus. Die großflächige Reinigung umfasst Extraktion, Verseifung und HPLC-Auflösung, um gereinigte Hauptganglioside des Gehirns bereitzustellen, die für biologische Experimente und für weitere chemische und enzymatische Modifikationen geeignet sind.Es werden ein beispielhaftes HPLC-Profil und anschließende TLC-Analysen gezeigt. Eine Alkalibehandlung oder Verseifung ist notwendig, um kontaminierende Phospholipide zu hydrolysieren und zu entfernen, hydrolysiert aber auch natürliche Modifikationen von Gangliosiden wie O-Acetylierte Sialinsäuren, die in einigen Kontexten wichtig sein können. Genaue Lösungsmittelverhältnisse für die Extraktion, die Lösungsmittelverteilung und die TLC-Auflösung sind entscheidend, um die Gewinnung, Reinheit und Analyse zu verbessern.Von Krebs über Stoffwechsel bis hin zur Gehirnfunktion sind Ganglioside physiologische Modifikatoren und therapeutische Ziele. Gangliosisolierung, -reinigung und -analyse sind Eckpfeiler für die biomedizinische Entdeckung und therapeutische Entwicklung.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Forschung

Biochemie

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraktion und Analyse der taiwanesischen grünen Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...