Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן המשותפת של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) עבור מענק Glycoscience U01CA241953. MJP נתמך על ידי התוכנית לממשק כימיה-ביולוגיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (T32GM080189).

איסוף הרקמות בוצע בתנאים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש בג'ונס הופקינס.
1. מיצוי גנגליוסייד בקנה מידה קטן וטיהור חלקי
שים לב: השתמש באוורור מתאים בעת עבודה עם ממיסים נדיפים ורעילים. הימנע פלסטיק לאורך כל הדרך; ממסים יחלצו רכיבים כימיים מפלסטיק רב...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

השיטות להפקת גנגליוסיד בקנה מידה קטן וגדול ובידוד שדווחו כאן אינן ייחודיות - ישנן גישות מיצוי וטיהור ממסים רבות ושונות המספקות תוצאות מצוינות12. השיטות שדווחו כאן לטיהור בקנה מידה קטן מהמוח, מפרדמן וסוונרהולם13, הוכחו כמייעלות את ההתאוששות והוכחו כחסונות ופשוטות ...

גנגליוסידים מוגדרים כגליקוספינגולפידים הנושאים שאריות חומצה סיאלית אחת או יותר1. הם באים לידי ביטוי בעיקר על פני השטח של התא עם moiety השומנים הסרמיד ההידרופובי שלהם מוטבע בעלון החיצוני של קרום הפלזמה ואת הגליקנים ההידרופיליים שלהם המשתרעים לתוך החלל החוץ תאי2. למרות שהם מופצים באופן נרחב בתאים וברקמות בעלי חוליות, הם נפוצים במיוחד במוח החוליות3, שם הם התגלו לראשונה ושמם 4.
המבנים של הגליקנים של גנגליוסייד משתנים ומהווים את הבסיס למינוח שלהם (איור 1). גליקנים גנגליוזידים מורכבים מליבת סוכר נייטרלית הנושאת מספרים שונים והפצות של חומצות סיאליות. בגנגליוסיד הקטן ביותר, GM4, יש רק שני סוכרים (חומצה סיאלית הקשורה לגלקטוז)5. גנגליוסידים טבעיים גדולים יותר עשויים להכיל יותר מתריסר סוכרים סה"כ6 או עד שבע חומצות סיאליות על ליבה נייטרלית אחת7. שלהם ceramide שומנים שומנים גם להשתנות, בעל אורכי ספינגוזין שונים ומגוון של חומצות שומן amides. במוח החוליות שולטים ארבעה מינים של גנגליוסיד, GM1, GD1a, GD1b ו- GT1b. ביטוי Ganglioside מוסדר מבחינה התפתחותית, ספציפי לרקמות, וסוג התא הספציפי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> איור 1: גנגליוסידים מוחיים עיקריים ומבשרי הביוסינתזה שלהם. מבנים מוצגים באמצעות מינוח סמלים עבור Glycans11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
גנגליוסידים פועלים ברמה המולקולרית על ידי עיסוק ווויסות חלבונים בממברנות שלהם (ויסות cis) או על ידי עיסוק בחלבונים מחייבים גליקנים במילייה החוץ-תאי, כולל רעלנים חיידקיים ולקטינים בתאים אחרים (זיהוי טרנס)3. קשירה ספציפית של gangliosides חלבונים רגולטוריים ו/או קשר עצמי עם מולקולות אחרות לתוך רפסודות שומנים בדם גורמת לשינויים בהתנהגות התא המשפיעים על מבנה ותפקוד מערכת העצבים, התקדמות סרטן, חילוף החומרים, דלקת, חלבונים עצביים, ומחלות זיהומיות8. בשל תפקידיהם התאיים המגוונים, שיטות הבידוד והניתוח שלהם יכולות לספק תובנות משופרות על ויסות תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כאן, שיטות מאומתות לחילוץ וניתוח מהיר בקנה מידה קטן, ובידוד בקנה מידה הכנה של גנגליוסידים מהמוח מסופקים. הזדמנויות ואתגרים ליישום לרקמות אחרות נדונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

גנגליוסדים הם גליקוספינגוליפידים המכילים שאריות חומצה סיאלית אחת או יותר. הם נמצאים על כל התאים והרקמות החולייתיים אבל הם נפוצים במיוחד במוח. בא לידי ביטוי בעיקר על העלון החיצוני של קרום הפלזמה של תאים, הם לווסת את הפעילות של חלבונים פני התא באמצעות שיוך לרוחב, לפעול כקולטנים באינטראקציות תא-תא והם מטרות עבור פתוגנים ורעלים. דיסרגציה גנטית של ביוסינטזה ganglioside בבני אדם גורמת להפרעות חמורות במערכת העצבים המולדת. בשל אופיים האמפיפי, החילוץ, הטיהור והניתוח של גנגליוסידים דורשים טכניקות שעברו אופטימיזציה על ידי חוקרים רבים ב -80 השנים שחלפו מאז גילוים. כאן, אנו מתארים שיטות ברמת הספסל לחילוץ, טיהור, וניתוחים איכותיים וכמותיים ראשוניים של גנגליוסדים גדולים מרקמות ותאים שניתן להשלים תוך מספר שעות. אנו מתארים גם שיטות לבידוד וטיהור בקנה מידה גדול יותר של מינים גנגליוסידים מרכזיים מהמוח. יחד, שיטות אלה מספקות גישה בקנה מידה אנליטי ומכין לסוג זה של מולקולות ביואקטיביות.

השיטות המתוארות בסעיף 1 (בקנה מידה קטן) מספקות גנגליוסידים בכמות מספקת ובטוהר להגדרה איכותית וכמותית של גנגליוסידים מוחיים עיקריים. התאוששות ממוח העכבר היא ~ 1 μmol ganglioside לכל משקל רטוב במוח g (1 nmol / μL) כאשר מוכן כמתואר. רזולוציית TLC של 1 μL (1 nmol) באמצעות סעיף 3 מספקת חומר רב לגילוי רסוצינול ופותרת...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

גנגליוסידים הם גליקוספינגוליפידים נושאי חומצה סיאלית הנמצאים בשפע במיוחד במוח. טבעם האמפיפתי דורש טכניקות מיצוי וטיהור אורגניות/מימיות כדי להבטיח התאוששות אופטימלית וניתוחים מדויקים. מאמר זה מספק סקירות כלליות של מיצוי גנגליוסיד בקנה מידה אנליטי ומכין, טיהור, וניתוח כרומטוגרפיה שכבה דקה.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

גנגליוסידים באים לידי ביטוי על כל משטחי תאי החוליות והם נפוצים במיוחד על תאי עצב. הם מווסתים איתות תאים וזיהוי תאים. פרוטוקול זה מציג בידוד וניתוח ganglioside.הטכניקות נבחרו כדי למקסם את התפוקות ganglioside בקנה מידה גדול וקטן תוך ייעול הטיהור. אנו מתארים גם שיטות לביצוע מהיר יחסית של ניתוחי גנגליוסיד איכותיים ועתיקים למחצה. מחקר על שומנים, במיוחד שומנים קוטביים כמו gangliosides, דורש כלים וטכניקות שונות מאשר עבודה עם חלבונים או חומצות גרעין.וידאו זה מכיר אותך כיצד לעבוד עם מולקולות אלה. מכיוון שממסים כגון כלורופורם וטטרהידרופורן ממיסים פלסטיק נפוץ, אנו משתמשים בבקבוקי זכוכית ובקבוקונים עם כובעים מצופים טפלון, פיפטות זכוכית, זכוכית, מיקרו-מזרקים מפלדת אל-חלד והומוגניזרים מזכוכית טפלון לאורך הליכים אלה. כישלון לעשות זאת גורם פולימרים פלסטיים במוצרים שיכולים להפריע ניתוחים.כדי להתחיל, להוסיף 4.1 מיליליטר של מים לכל גרם של משקל רטוב רקמה, הומוגניזציה אותו עם 10 משיכות. מוסיפים 13 מיליליטר של מתנול לגרם של רקמה. מעבירים לטמפרטורת סביבה של 22 מעלות צלזיוס, ומערבבים.מעבירים את הרקמה לצינור עבה מוקף זכוכית, עם מכסה בורג מצופה ברגים עם מכסה בורג מצופה PTFE, ומערבבים היטב. מוסיפים 6.5 מיליליטר של כלורופורם לגרם של רקמה, מכסים אותו ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב 450 פעמים g במשך 15 דקות.לאחר מכן העבר את supernatant ברור לצינור רענן, בורג כתרים, ולמדוד את עוצמת הקול כמו נפח תמצית התאושש. עבור חלוקה למחיצות, להוסיף 0.173 פעמים את נפח החילוץ התאושש של מים כדי supernatant ברור. אז תכסה את זה.מערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 450 פעמים g במשך 15 דקות. העבר את השלב העליון, המכיל את gangliosides, לתוך צינור זכוכית טרי עם כובע בורג מצופה PTFE.כדי לבצע כרומטוגרפיה של מחסנית דו-פאזית הפוכה, השתמש במזרק זכוכית של חמישה מיליליטר כדי לשטוף מחסנית חילוץ של שלב מוצק tC18 עם שלושה מיליליטרים של מתנול. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של כלורופורם-מתנול-מים ביחס של שניים עד 43 עד 55. טען את השלב העליון מהשלב הקודם על מחסנית tC18 באמצעות אותו מזרק זכוכית.אסוף את הזרימה וטען אותה מחדש לעמודה כדי למטב את הספיחה. לשטוף את המחסנית עם שלושה מיליליטרים של כלורופורם-מתנול-מים ולאחר מכן עם שלושה מיליליטרים של מתנול-מים. לרומם את gangliosides עם שלושה מיליליטר של מתנול לתוך צינור טרי, בורג כתרים.התאדו ליובש תחת זרם עדין של חנקן בטמפרטורה נמוכה או שווה ל -45 מעלות צלזיוס. מתמוססים במתנול במיליליטר אחד לגרם של משקל רטוב של רקמות מקוריות. מניחים 100 גרם של חומר אפור במוח בבלנדר, ומוסיפים מיליליטר אחד לגרם משקל רטוב במוח של חיץ אשלגן פוספט צונן, 10 מ"מ של pH 6.8.ואז הומוגני על נמוך במשך 20 שניות. מוסיפים שמונה מיליליטר של טטרה-הידרופורן לגרם משקל רטוב במוח, והומוגניים על נמוך במשך 10 שניות. דקאנט לבקבוקי צנטריפוגות זכוכית, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g במשך 15 דקות.לאסוף את supernatant, למדוד את נפחו, ולאחר מכן להעביר אותו למשפך הפרדת זכוכית. הוסף 0.3 מיליליטר של אתיל אתר למיליליטר של supernatant. לנער במרץ.ואז לאפשר לו לשבת באין מפריע במשך 30 דקות, שבמהלכן שני שלבים, שלב אתר עליון שלב מימית נמוכה יותר, נפרדים. לאסוף את השלב התחתון, המכיל את gangliosides, לתוך בקבוק זכוכית עם כובע מצופה PTFE. לשלב האתר העליון שנותר במשפך המפריד, הוסף 0.1 מיליליטר של מים למיליליטר של סופר-נרטיב מקורי מהשלב הקודם.לנער במרץ. אפשר לשלבים להיפרד. לאחר מכן לאסוף את השלב מימי התחתון, ולשלב אותו עם השלב התחתון שנאסף בעבר.התאדו את השלבים התחתונים המשולבים לאבקה יבשה, ושקלו אותה. כדי לבצע כרומטוגרפיה של שלב הפוך, שטפו מראש מחסנית חילוץ tC18 מוצקה בקנה מידה גדול על ידי העברת 50 מיליליטר של ממסים דרך העמודה באמצעות ואקום או לחץ במשך פחות מדקה אחת לכל שטיפה. טען את השלב העליון מהפרדת השלב שלאחר הספוניפיקציה לעמודה באמצעות ואקום או לחץ.לאחר מכן לאסוף את הזרימה דרך, לטעון אותו מחדש, ולאסוף את הזרימה דרך שוב לניתוח הבא. לשטוף את הטור עם 30 מיליליטר כל אחד של כלורופורם-מתנול-מים, ואחריו מתנול-מים. ואז לברוח gangliosides עם 50 מיליליטר של מתנול ולאחר מכן שוב עם 10 מיליליטר של מתנול.לאסוף כל שטיפה ו elution בנפרד. השתמש כרומטוגרפיה שכבות דקות, או TLC, כדי לאשר כי gangliosides נעדרים מן הזרימה דרך ושוטף ו eluted בהתרוממות הראשונה של מתנול. התאדו את הגנגליוסידים המנוטרלים לאבקה יבשה, ושקלו אותם.כדי לבצע TLC, לשפוך ממס פועל לתוך 10 על 10 ס"מ, תא TLC זכוכית עם כיסוי נירוסטה, כך עומק הממס הוא 0.5 ס"מ. לכסות את התא, ולאפשר לו שיווי משקל במשך כ 10 דקות. שטפו מזרק המילטון 10 מיקרוליטר עם מחט משופעת באמצעות מתנול.צייר מיקרוליטר אחד של מתנול לתוך מזרק זכוכית כדי למלא את הנפח המת מחט ולאחר מכן מיקרוליטר אחד של מדגם או סטנדרטי. לזהות את המדגם באופן שווה על חמישה מילימטר, קווים מסומנים מראש עד פחות ממיקרוליטר אחד של ממס מתנול נשאר במזרק. אפשר לצלחת להתייבש ב 22 מעלות צלזיוס לאחר כל הדגימות הם הבחינו.מניחים את הצלחת המנוקדת והמיובשת על תא TLC המשתווה מראש כאשר הקצה התחתון שקוע בממס הרץ. אפשר ממס פועל להתקדם במעלה הצלחת על ידי פעולה נימית עד חזית הממס מגיע בתוך סנטימטר אחד של החלק העליון של הצלחת. הסר וסמן את חזית הממס בקצה הצלחת עם עיפרון.אפשר לממסים להתאדות לחלוטין או ללא הפרעה או תחת זרימת אוויר קלה. במכסה המנוע של האדים הכימיים, הניחו את צלחת ה-TLC עם מקור הגאנגליוזידים שנפתרו במהופך בקופסת קרטון חתוכה כדי להגן על קירות מכסה המנוע מפני תרסיס חומצה. מניחים ריאגנט תרסיס רססוריטול במרסס TLC זכוכית.חבר אותו למקור של חנקן בלחץ, ומרסס קלות את הצלחת באלכסון בכיוונים האנכיים והאופקיים. מיד לכסות את הצלחת עם צלחת כיסוי זכוכית נקייה, יבשה, של אותם ממדים, ולאבטח את צלחת הכיסוי במקום עם קליפס קלסר. מחממים את הצלחת המכוסה ב 125 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.גנגליוסידים יופיעו סגול כהה על רקע לבן. כדי לבצע כתמי שומנים בדם, לטבול את צלחת TLC עם צד המקור gangliosides נפתר למטה לתוך המכילה את כתם anisaldehyde. שקועים לחזית הריצה לקצת יותר משתי שניות.אז תן לו להתנקז. מחממים את צלחת TLC על צלחת חמה בטמפרטורה נמוכה כדי לפתח. פרוטוקול זה מספק gangliosides בכמות מספקת וטוהר לקביעה איכותית וכמותית.רזולוציית TLC של מיקרוליטר אחד מספקת חומר רב לגילוי רסורצינול ופותרת את כל הגרעיניוזדים העיקריים במוח עבור עכברים מסוג בר מהונדסים גנטית. למרות gangliosides מעורב מוכן אינם חופשיים שומנים מרכזיים אחרים, הם של טוהר מספיק לקביעת ספקטרומטרי מסה או כמו gangliosides מטוהרים ילידים במצב שלילי או לאחר טרום מתילציה במצב חיובי. טיהור בקנה מידה גדול כולל מיצוי, סאפוניפיקציה ורזולוציית HPLC כדי לספק גנגליוסידים מרכזיים מטוהרים למוח המתאימים לניסויים ביולוגיים ולשינויים כימיים ואזימטיים נוספים.פרופיל HPLC למופת וניתוח TLC עוקב מוצגים. טיפול אלקלי, או סאפוניפיקציה, יש צורך הידרוליזה ולהסיר פוספוליפידים מזהמים, אבל גם הידרוליזה שינויים טבעיים של gangliosides כגון חומצות סיאליות O-אצטילated, אשר עשוי להיות חשוב בהקשרים מסוימים. יחסי ממס מדויקים עבור מיצוי, חלוקה למחיצות ממסים ורזולוציית TLC הם קריטיים לשיפור ההתאוששות, הטוהר והניתוחים.מסרטן לחילוף חומרים ועד לתפקוד המוח, גנגליוסידים הם מכפילים פיזיולוגיים ויעדים טיפוליים. בידוד גנגליוסייד, טיהור וניתוחים הם אבני יסוד לגילוי ביו-רפואי והתפתחות טיפולית.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

הפקה בקנה מידה מעבדתי וטיהור של נוגדן רפואי

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

חילוץ וניתוח של פרופוליס ירוק מטייוואן

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...