Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione U01CA241953 del National Institutes of Health (NIH). MJP è stato supportato dal Chemistry-Biology Interface Program presso Johns Hopkins (T32GM080189).

La raccolta dei tessuti è stata eseguita alle condizioni autorizzate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Estrazione del ganglioside su piccola scala e purificazione parziale
ATTENZIONE: Utilizzare un'adeguata ventilazione quando si lavora con solventi volatili e tossici. Evitare la plastica in tutto; i solventi estrarranno componenti chimici da molte materie plastiche che interferiscono con le analisi successive. Il politetrafluoroetilene (PTFE) è un...

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	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

I metodi per l'estrazione e l'isolamento del ganglioside su piccola e grande scala qui riportati non sono unici: ci sono molti diversi approcci di estrazione e purificazione con solvente che forniscono risultati eccellenti12. I metodi riportati qui per la purificazione su piccola scala dal cervello, da Fredman e Svennerholm13, hanno dimostrato di ottimizzare il recupero e hanno dimostrato di essere robusti e diretti per molti anni nel nostro laboratorio. L'isolamento e la p...

I gangliosidi sono definiti come glicosfingolipidi portatori di uno o più residui di acido sialico1. Sono espressi principalmente sulla superficie cellulare con la loro porzione lipidica idrofobica ceramide incorporata nel foglietto esterno della membrana plasmatica e i loro glicani idrofili che si estendono nello spazio extracellulare2. Sebbene ampiamente distribuiti nelle cellule e nei tessuti dei vertebrati, sono particolarmente abbondanti nel cervello dei vertebrati3, dove sono stati scoperti e nominati per la prima volta4.
Le strutture dei gangliosidi glicani variano e sono alla base della loro nomenclatura (Figura 1). I glicani gangliosidici sono costituiti da un nucleo di zucchero neutro con diversi numeri e distribuzioni di acidi sialici. Il ganglioside più piccolo, GM4, ha solo due zuccheri (acido sialico legato al galattosio)5. I gangliosidi naturali più grandi possono contenere ben oltre una dozzina di zuccheri totali6 o fino a sette acidi sialici su un singolo nucleo neutro7. Anche le loro parti lipidiche di ceramide variano, avendo diverse lunghezze di sfingosina e una varietà di ammidi di acidi grassi. Nel cervello dei vertebrati predominano quattro specie di gangliosidi, GM1, GD1a, GD1b e GT1b. L'espressione del ganglioside è regolata dallo sviluppo, specifica del tessuto e specifica del tipo cellulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figura 1: Principali gangliosidi cerebrali e loro precursori biosintetici. Le strutture sono mostrate usando la nomenclatura dei simboli per Glycans11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I gangliosidi funzionano a livello molecolare coinvolgendo e modulando le proteine nelle proprie membrane (regolazione cis) o coinvolgendo le proteine leganti i glicani nell'ambiente extracellulare, comprese le tossine batteriche e le lectine su altre cellule (trans riconoscimento)3. Il legame specifico dei gangliosidi alle proteine regolatrici e/o l'autoassociazione con altre molecole in zattere lipidiche provoca cambiamenti nel comportamento cellulare che influiscono sulla struttura e sulla funzione del sistema nervoso, sulla progressione del cancro, sul metabolismo, sull'infiammazione, sulle proteinopatie neuronali e sulle malattie infettive8. A causa dei loro diversi ruoli cellulari, i metodi per il loro isolamento e analisi possono fornire maggiori informazioni sulla regolazione dei processi fisiologici e patologici. Qui vengono forniti metodi convalidati per l'estrazione e l'analisi rapide su piccola scala e l'isolamento su scala preparativa dei gangliosidi dal cervello. Vengono discusse le opportunità e le sfide per l'applicazione ad altri tessuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

I gangliosidi sono glicosfingolipidi che contengono uno o più residui di acido sialico. Si trovano su tutte le cellule e i tessuti dei vertebrati, ma sono particolarmente abbondanti nel cervello. Espressi principalmente sul foglietto esterno delle membrane plasmatiche delle cellule, modulano le attività delle proteine di superficie cellulare tramite associazione laterale, agiscono come recettori nelle interazioni cellula-cellula e sono bersagli per agenti patogeni e tossine. La disregolazione genetica della biosintesi dei gangliosidi nell'uomo provoca gravi disturbi congeniti del sistema nervoso. A causa della loro natura anfipatica, l'estrazione, la purificazione e l'analisi dei gangliosidi richiedono tecniche che sono state ottimizzate da molti ricercatori negli 80 anni dalla loro scoperta. Qui descriviamo i metodi a livello di banco per l'estrazione, la purificazione e le analisi qualitative e quantitative preliminari dei principali gangliosidi da tessuti e cellule che possono essere completati in poche ore. Descriviamo anche metodi per l'isolamento e la purificazione su larga scala delle principali specie di ganglioside dal cervello. Insieme, questi metodi forniscono accesso analitico e su scala preparativa a questa classe di molecole bioattive.

I metodi descritti nella sezione 1 (piccola scala) forniscono gangliosidi in quantità e purezza sufficienti per la determinazione qualitativa e quantitativa dei principali gangliosidi cerebrali. Il recupero dal cervello del topo è ~ 1 μmol ganglioside per g di peso cerebralmente bagnato (1 nmol / μL) quando preparato come descritto. La risoluzione TLC di 1 μL (1 nmol) utilizzando la sezione 3 fornisce ampio materiale per il rilevamento del resorcinolo e risolve tutti i principali gangliosidi cerebrali come mostrato ...

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Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

I gangliosidi sono glicosfingolipidi contenenti acido sialico che sono particolarmente abbondanti nel cervello. La loro natura anfipatica richiede tecniche di estrazione e purificazione organiche/acquose per garantire un recupero ottimale e analisi accurate. Questo articolo fornisce una panoramica dell'estrazione, della purificazione e dell'analisi della cromatografia su ganglioside su scala analitica e preparativa.

Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

I gangliosidi sono espressi su tutte le superfici cellulari dei vertebrati e sono particolarmente abbondanti sulle cellule nervose. Regolano la segnalazione cellulare e il riconoscimento cellula-cellula. Questo protocollo introduce l'isolamento e l'analisi dei gangliosidi.Le tecniche sono state selezionate per massimizzare le rese di ganglioside su larga e piccola scala, semplificando al contempo la purificazione. Descriviamo anche metodi per eseguire relativamente rapidamente analisi gangliosidiche qualitative e semiquantitative. Lo studio sui lipidi, in particolare i lipidi polari come i gangliosidi, richiede strumenti e tecniche diversi rispetto al lavoro con proteine o acidi nucleici.Questo video ti familiarizza con come lavorare con queste molecole. Poiché solventi come il cloroformio e il tetraidrofurano dissolvono le plastiche comuni, utilizziamo bottiglie e fiale di vetro con tappi rivestiti in teflon, pipette di vetro, vetro, microsiringhe in acciaio inossidabile e omogeneizzatori di vetro teflon in tutte queste procedure. In caso contrario, nei prodotti si verificano polimeri plastici che possono interferire con le analisi.Per iniziare, aggiungi 4,1 millilitri di acqua per grammo di peso umido del tessuto e omogeneizzalo con 10 colpi. Aggiungere 13 millilitri di metanolo per grammo di tessuto. Trasferirlo a una temperatura ambiente di 22 gradi Celsius e mescolare.Trasferire il tessuto in un tubo di vetro a parete spessa con tappo a vite con un tappo a vite rivestito in PTFE e mescolare accuratamente. Aggiungere 6,5 millilitri di cloroformio per grammo di tessuto, tapparlo e mescolare accuratamente. Centrifugare a 450 volte g per 15 minuti.Quindi trasferire il surnatante trasparente in un tubo fresco con tappo a vite e misurare il volume come volume di estratto recuperato. Per il partizionamento, aggiungere 0,173 volte il volume d'acqua estratto recuperato al surnatante trasparente. Quindi coprilo.Vortice vigorosamente. Centrifugare a 450 volte g per 15 minuti. Trasferire la fase superiore, che contiene i gangliosidi, in un tubo di vetro fresco con un tappo a vite rivestito in PTFE.Per eseguire la cromatografia a cartuccia inversa, utilizzare una siringa di vetro da cinque millilitri per lavare una cartuccia di estrazione a fase solida tC18 con tre millilitri di metanolo. Quindi aggiungere tre millilitri di cloroformio-metanolo-acqua con un rapporto di due a 43 a 55. Caricare la fase superiore del passaggio precedente sulla cartuccia tC18 attraverso la stessa siringa di vetro.Raccogli il flusso passante e ricaricalo sulla colonna per ottimizzare l'adsorbimento. Lavare la cartuccia con tre millilitri di cloroformio-metanolo-acqua e poi con tre millilitri di metanolo-acqua. Eluire i gangliosidi con tre millilitri di metanolo in un tubo fresco con tappo a vite.Evaporare a secco sotto un leggero flusso di azoto a una temperatura inferiore o uguale a 45 gradi Celsius. Sciogliere in metanolo a un millilitro per grammo di peso umido del tessuto originale. Metti 100 grammi di materia grigia cerebrale in un frullatore e aggiungi un millilitro per grammo di peso umido cerebrale di tampone di fosfato di potassio refrigerato da 10 millimolari di pH 6,8.Quindi omogeneizzare in basso per 20 secondi. Aggiungere otto millilitri di tetraidrofurano per grammo di peso umido del cervello e omogeneizzare a basso per 10 secondi. Decantare in bottiglie di centrifughe di vetro e centrifugare a 5.000 volte g per 15 minuti.Raccogliere il surnatante, misurarne il volume e quindi trasferirlo in un imbuto separatore di vetro. Aggiungere 0,3 millilitri di etere etilico per millilitro del surnatante. Agitare vigorosamente.Quindi lasciarlo riposare indisturbato per 30 minuti, durante i quali due fasi, una fase eterea superiore e una fase acquosa inferiore, si separano. Raccogliere la fase inferiore, che contiene i gangliosidi, in una bottiglia di vetro con un tappo rivestito in PTFE. Alla fase etere superiore che rimane nell'imbuto separatore, aggiungere 0,1 millilitri di acqua per millilitro di surnatante originale del passaggio precedente.Agitare vigorosamente. Consenti la separazione delle fasi. Quindi raccogliere la fase acquosa inferiore e combinarla con la fase inferiore precedentemente raccolta.Evaporare le fasi inferiori combinate in una polvere secca e pesarla. Per eseguire la cromatografia inversa, prelavare una cartuccia di estrazione a fase solida tC18 su larga scala facendo passare 50 millilitri di solventi attraverso la colonna usando il vuoto o la pressione per meno di un minuto per lavaggio. Caricare la fase superiore dalla separazione di fase post-saponificazione sulla colonna per vuoto o pressione.Quindi raccogliere il flusso attraverso, ricaricarlo e raccogliere nuovamente il flusso per l'analisi successiva. Lavare la colonna con 30 millilitri ciascuno di cloroformio-metanolo-acqua, seguita da metanolo-acqua. Quindi eluire i gangliosidi con 50 millilitri di metanolo e poi di nuovo con 10 millilitri di metanolo.Raccogliere ogni lavaggio ed eluizione separatamente. Utilizzare la cromatografia a strato sottile, o TLC, per confermare che i gangliosidi sono assenti dal flusso e lavati ed eluiti nella prima eluizione di metanolo. Evaporare i gangliosidi eluiti in una polvere secca e pesarli.Per eseguire TLC, versare il solvente in esecuzione in una camera TLC di vetro di 10 x 10 centimetri con una copertura in acciaio inossidabile in modo che la profondità del solvente sia di 0,5 centimetri. Coprire la camera e lasciarla equilibrare per circa 10 minuti. Lavare una siringa Hamilton da 10 microlitri con un ago smussato usando metanolo.Aspirare un microlitro di metanolo in una siringa di vetro per riempire il volume morto dell'ago e poi un microlitro di campione o standard. Individuare il campione in modo uniforme sulle linee premarcate di cinque millimetri fino a quando nella siringa rimane meno di un microlitro di solvente a metanolo. Lasciare asciugare la piastra a 22 gradi Celsius dopo che tutti i campioni sono stati individuati.Posizionare la piastra maculata e asciugata sulla camera TLC preequilibrata con il bordo inferiore immerso nel solvente in esecuzione. Lasciare che il solvente in esecuzione avanzi sulla piastra per azione capillare fino a quando il fronte del solvente raggiunge entro un centimetro dalla parte superiore della piastra. Rimuovere e contrassegnare la parte anteriore del solvente sul bordo del piatto con una matita.Lasciare evaporare completamente i solventi indisturbati o sotto un flusso d'aria mite. In una cappa aspirante chimica, posizionare la piastra TLC con l'estremità risolta dei gangliosidi a testa in giù in una scatola di cartone tagliata per proteggere le pareti della cappa dallo spruzzo acido. Posizionare il reagente spray resorcinolo in uno spruzzatore TLC di vetro.Attaccarlo a una fonte di azoto pressurizzato e spruzzare leggermente la piastra in diagonale nelle direzioni verticale e orizzontale. Coprire immediatamente la piastra con una piastra di copertura in vetro pulita, asciutta e delle stesse dimensioni e fissare la piastra di copertura in posizione con clip leganti. Riscaldare la piastra coperta a 125 gradi Celsius per 20 minuti.I gangliosidi appariranno viola scuro su uno sfondo bianco. Per eseguire la colorazione lipidica, immergere la piastra TLC con l'origine dei gangliosidi risolti verso il basso in un becher contenente la macchia di anisaldeide. Immergiti nella parte anteriore in corsa per poco più di due secondi.Quindi lasciarlo scolare. Riscaldare la piastra TLC su una piastra calda a bassa temperatura per svilupparsi. Questo protocollo fornisce gangliosidi in quantità e purezza sufficienti per la determinazione qualitativa e quantitativa.La risoluzione TLC di un microlitro fornisce ampio materiale per il rilevamento del resorcinolo e risolve tutti i principali gangliosidi cerebrali per topi selvatici e geneticamente modificati. Sebbene i gangliosidi misti preparati non siano privi di altri lipidi principali, sono di purezza sufficiente per la determinazione spettrometrica di massa sia come gangliosidi purificati nativi in modalità negativa che dopo pre-metilazione in modalità positiva. La purificazione su larga scala comprende l'estrazione, la saponificazione e la risoluzione HPLC per fornire gangliosidi cerebrali principali purificati adatti per esperimenti biologici e per ulteriori modifiche chimiche ed enzimatiche.Viene mostrato un profilo HPLC esemplare e la successiva analisi TLC. Il trattamento alcalino, o saponificazione, è necessario per idrolizzare e rimuovere i fosfolipidi contaminanti ma idrolizzerà anche le modificazioni naturali dei gangliosidi come gli acidi sialici O-acetilati, che possono essere importanti in alcuni contesti. Rapporti solventi accurati per l'estrazione, la suddivisione del solvente e la risoluzione TLC sono fondamentali per migliorare il recupero, la purezza e le analisi.Dal cancro al metabolismo alla funzione cerebrale, i gangliosidi sono modificatori fisiologici e bersagli terapeutici. L'isolamento, la purificazione e l'analisi del ganglioside sono pietre miliari per la scoperta biomedica e lo sviluppo terapeutico.

Research

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Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Estrazione ed analisi di propoli verde taiwanesi

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...