Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP ble støttet av Chemistry-Biology Interface Program ved Johns Hopkins (T32GM080189).

Vevsinnsamling ble utført under forhold autorisert av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Småskala ganglioside ekstraksjon og delvis rensing
FORSIKTIG: Bruk passende ventilasjon når du arbeider med flyktige og giftige løsemidler. Unngå plast gjennom hele; løsemidler vil trekke ut kjemiske komponenter fra mange plastmaterialer som forstyrrer påfølgende analyser. Polytetrafluoretylen (PTFE) er et unntak. PTFE-foret lukking bør brukes til å hette gl...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Metodene for liten og storskala ganglioside utvinning og isolasjon rapportert her er ikke unike - det er mange forskjellige løsningsmiddelutvinning og rensingsmetoder som gir gode resultater12. Metodene som rapporteres her for småskala rensing fra hjernen, fra Fredman og Svennerholm13, ble vist å optimalisere utvinningen og har vist seg å være robust og grei over mange år i vårt laboratorium. Isolasjon og rensing egnet for TLC og MS kan enkelt fullføres, fra intakt ...

Gangliosider er definert som glykosfatolipider som bærer en eller flere sialsyrerester1. De uttrykkes hovedsakelig på celleoverflaten med deres hydrofobe ceramid lipidmoiety innebygd i plasmamembranens ytre brosjyre og deres hydrofile glykaner som strekker seg inn i det ekstracellulære rommet2. Selv om de distribueres mye i virveldyrceller og vev, er de spesielt rikelig i virveldyrhjernen3, hvor de først ble oppdaget og navngitt4.
Strukturene til ganglioside glykaner varierer og er grunnlaget for deres nomenklatur (figur 1). Ganglioside glykaner består av en nøytral sukkerkjerne som bærer forskjellige tall og fordelinger av sialsyrer. Den minste ganglioside, GM4, har bare to sukkerarter (sialsyre bundet til galaktose)5. Større naturlig forekommende gangliosider kan inneholde godt over et dusin totale sukkerarter6 eller opptil syv sialsyrer på en enkelt nøytral kjerne7. Deres ceramid lipid moieties varierer også, har forskjellige sphingosine lengder og en rekke fettsyre amider. I virveldyrhjernen dominerer fire gangliosidearter, GM1, GD1a, GD1b og GT1b. Ganglioside-uttrykk er utviklingsregulert, vevsspesifikk og celletypespesifikk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figur 1: Store hjerne gangliosider og deres biosyntetiske forløpere. Strukturer vises ved hjelp av Symbol Nomenclature for Glycans11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Gangliosider fungerer på molekylært nivå ved å engasjere og modulere proteiner i sine egne membraner (cis regulering) eller ved å engasjere glykanbindende proteiner i det ekstracellulære miljøet, inkludert bakterielle toksiner og lectins på andre celler (transgjenkjenning)3. Spesifikk binding av gangliosider til regulatoriske proteiner og / eller selvtilknytning med andre molekyler i lipidflåter resulterer i endringer i celleadferd som påvirker nervesystemstrukturen og funksjonen, kreftprogresjon, metabolisme, betennelse, nevronale proteinopatier og smittsomme sykdommer8. På grunn av deres ulike cellulære roller kan metoder for isolasjon og analyse gi økt innsikt i regulering av fysiologiske og patologiske prosesser. Her er validerte metoder for rask småskala ekstraksjon og analyse, og forberedende skalaisolasjon av gangliosider fra hjernen gitt. Muligheter og utfordringer for anvendelse på andre vev diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosider er glykosfatolipider som inneholder en eller flere sialsyrerester. De finnes på alle virveldyrceller og vev, men er spesielt rikelig i hjernen. Uttrykt primært på det ytre pakningsvedlegget av plasmamembranene til celler, modulerer de aktivitetene til celleoverflateproteiner via lateral assosiasjon, fungerer som reseptorer i cellecelleinteraksjoner og er mål for patogener og giftstoffer. Genetisk dysregulering av ganglioside biosyntese hos mennesker resulterer i alvorlige medfødte nervesystemforstyrrelser. På grunn av deres amfipatiske natur krever utvinning, rensing og analyse av gangliosider teknikker som har blitt optimalisert av mange etterforskere i de 80 årene siden oppdagelsen. Her beskriver vi metoder på benknivå for utvinning, rensing og foreløpige kvalitative og kvantitative analyser av store gangliosider fra vev og celler som kan fullføres om noen timer. Vi beskriver også metoder for større isolasjon og rensing av store ganglioside arter fra hjernen. Sammen gir disse metodene analytisk og forberedende skalatilgang til denne klassen av bioaktive molekyler.

Metodene beskrevet i § 1 (liten skala) gir gangliosider tilstrekkelig mengde og renhet for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av store hjerne gangliosider. Restitusjon fra musehjernen er ~ 1 μmol ganglioside per g hjernens våte vekt (1 nmol/μL) når den fremstilles som beskrevet. TLC-oppløsning på 1 μL (1 nmol) ved hjelp av seksjon 3 gir rikelig materiale for resorcinoldeteksjon og løser alle de store hjerne gangliosidene som vist for vill type og genetisk modifiserte mus i figur 4</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosider er sialinsyrebærende glykosfetolipider som er spesielt rikelig i hjernen. Deres amfipatiske natur krever organisk/vandige ekstraksjons- og renseteknikker for å sikre optimal utvinning og nøyaktige analyser. Denne artikkelen gir oversikt over analytisk og forberedende skala ganglioside ekstraksjon, rensing og tynn lag kromatografi analyse.

Ganglioside utvinning, rensing og profilering

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliosider uttrykkes på alle virveldyrcelleoverflater og er spesielt rikelig på nerveceller. De regulerer cellesignalering og cellecellegjenkjenning. Denne protokollen introduserer ganglioside isolasjon og analyse.Teknikkene ble valgt for å maksimere ganglioside utbytter i store og små skalaer mens effektivisere rensing. Vi beskriver også metoder for relativt raskt å utføre kvalitative og semikantede gangliosideanalyser. Studie på lipider, spesielt polare lipider som gangliosider, krever forskjellige verktøy og teknikker enn å jobbe med proteiner eller nukleinsyrer.Denne videoen gjør deg kjent med hvordan du arbeider med disse molekylene. Fordi løsningsmidler som kloroform og tetrahydrofuran oppløser vanlig plast, bruker vi glassflasker og hetteglass med Teflon-foret caps, glasspipetter, glass, mikrosyringer i rustfritt stål og Teflon glass homogenisatorer gjennom disse prosedyrene. Unnlatelse av å gjøre dette resulterer i plastpolymerer i produktene som kan forstyrre analyser.Til å begynne med, legg til 4,1 milliliter vann per gram vev våt vekt, og homogeniser det med 10 slag. Tilsett 13 milliliter metanol per gram vev. Overfør den til en omgivelsestemperatur på 22 grader Celsius, og bland.Overfør vevet til et tykkvegget, glass, skrue-capped rør med en PTFE-foret skruehett, og bland grundig. Tilsett 6,5 milliliter kloroform per gram vev, hette det og bland grundig. Sentrifuge på 450 ganger g i 15 minutter.Overfør deretter den klare supernatanten til et friskt, skruekappet rør, og mål volumet som gjenvunnet ekstraktvolum. For partisjonering, tilsett 0,173 ganger det gjenvunne ekstraktvolumet av vann til den klare supernatanten. Så ta den.Virvel kraftig. Sentrifuge på 450 ganger g i 15 minutter. Overfør den øvre fasen, som inneholder gangliosidene, til et friskt glassrør med en PTFE-foret skruehett.For å utføre omvendt fase patronkromatografi, bruk en fem milliliter glass sprøyte for å vaske en tC18 solid-fase ekstraksjon patron med tre milliliter metanol. Tilsett deretter tre milliliter kloroform-metanolvann i forholdet to til 43 til 55. Legg den øvre fasen fra forrige trinn på tC18-patronen gjennom den samme glasssprøyten.Samle gjennomstrømningen, og last den inn på kolonnen på nytt for å optimalisere adsorpsjonen. Vask patronen med tre milliliter kloroform-metanolvann og deretter med tre milliliter metanolvann. Elute gangliosides med tre milliliter metanol i et friskt, skrue-capped rør.Fordamp til tørrhet under en mild strøm av nitrogen ved en temperatur mindre enn eller lik 45 grader Celsius. Løs opp i metanol ved en milliliter per gram original vev våt vekt. Legg 100 gram hjernegrå materie i en blender, og tilsett en milliliter per gram hjerne våtvekt av kjølt, 10 millimolar kaliumfosfatbuffer av pH 6,8.Deretter homogeniserer du lavt i 20 sekunder. Tilsett åtte milliliter tetrahydrofuran per gram hjerne våt vekt, og homogeniser lavt i 10 sekunder. Dekanter i glass sentrifuger flasker, og sentrifuge på 5000 ganger g i 15 minutter.Samle supernatanten, mål volumet, og overfør det deretter til en glassseparatortrakt. Tilsett 0,3 milliliter etyleter per milliliter av supernatanten. Rist kraftig.La det deretter sitte uforstyrret i 30 minutter, hvor to faser, en øvre eterfase og en lavere vandig fase, separat. Samle den nedre fasen, som inneholder gangliosidene, i en glassflaske med en PTFE-foret hette. Til den øvre eterfasen som gjenstår i separatortrakten, tilsett 0,1 milliliter vann per milliliter original supernatant fra forrige trinn.Rist kraftig. Tillat at faser skilles. Samle deretter den nedre vandige fasen, og kombiner den med den tidligere oppsamlede nedre fasen.Fordamp de kombinerte nedre fasene til et tørt pulver, og vei det. For å utføre omvendt fasekromatografi, forvask en storskala tC18 fastfase ekstraksjonspatron ved å sende 50 milliliter løsemidler gjennom kolonnen ved hjelp av vakuum eller trykk i mindre enn ett minutt per vask. Last den øvre fasen fra ettersyttingsfasens separasjon på kolonnen med vakuum eller trykk.Samle deretter gjennomstrømningen, last den inn på nytt og samle gjennomflyten igjen for etterfølgende analyse. Vask kolonnen med 30 milliliter hver av kloroform-metanol-vann, etterfulgt av metanolvann. Deretter elute gangliosides med 50 milliliter metanol og deretter igjen med 10 milliliter metanol.Samle hver vask og elution separat. Bruk tynnlagskromatografi, eller TLC, for å bekrefte at gangliosider er fraværende fra gjennomstrømningen og vasker og unnvikes i den første elutionen av metanol. Fordamp de rømte gangliosidene til et tørt pulver, og vei dem.For å utføre TLC, hell rennende løsningsmiddel i et 10-x-10 centimeter, glass TLC-kammer med et rustfritt ståldeksel slik at løsningsmiddeldybden er 0,5 centimeter. Dekk kammeret, og la det likevekte i ca 10 minutter. Vask en Hamilton-sprøyte med 10 mikroliter med en skrå nål ved hjelp av metanol.Trekk en mikroliter metanol inn i en glasssprøyte for å fylle nålens døde volum og deretter en mikroliter prøve eller standard. Se prøven jevnt på de fem millimeter, forhåndsmerkede linjene til mindre enn en mikroliter metanolløsningsmiddel forblir i sprøyten. La platen tørke ved 22 grader Celsius etter at alle prøvene er oppdaget.Plasser den flekkete og tørkede platen på det forhåndslikevektede TLC-kammeret med den nederste kanten nedsenket i det løpende løsningsmidlet. La rennende løsningsmiddel føre opp platen ved kapillær virkning til løsningsmidlet foran når innen en centimeter fra toppen av platen. Fjern og merk løsningsmidlet foran på kanten av platen med en blyant.La løsningsmidlene fordampe helt uforstyrret eller under mild luftstrøm. I en kjemisk avtrekkshette plasserer du TLC-platen med den løste gangliosides opprinnelsesenden opp ned i en avskåret pappkasse for å beskytte hettens vegger mot syrespray. Plasser resorcinol sprayreagenset i en TLC-sprøyte i glass.Fest den til en kilde til trykksatt nitrogen, og spray platen lett diagonalt i vertikale og horisontale retninger. Dekk straks platen med en ren, tørr glassdekselplate med samme dimensjoner, og fest dekkplaten på plass med bindemiddelklemmer. Varm den tildekkede platen ved 125 grader Celsius i 20 minutter.Gangliosides vil vises mørk lilla mot en hvit bakgrunn. For å utføre lipidfarging, dypp TLC-platen med den løste gangliosides opprinnelsessiden ned i et beger som inneholder anisaldehydflekken. Senk ned til løpefronten i litt over to sekunder.La det deretter renne ut. Varm TLC-platen på en varm plate ved lav temperatur for å utvikle seg. Denne protokollen gir gangliosider tilstrekkelig mengde og renhet for kvalitativ og kvantitativ besluttsomhet.TLC-oppløsning av en mikroliter gir rikelig materiale for resorcinoldeteksjon og løser alle de store hjerne gangliosidene for villtype og genetisk modifiserte mus. Selv om de forberedte blandede gangliosidene ikke er fri for andre store lipider, har de tilstrekkelig renhet for massespektrometrisk bestemmelse enten som innfødte rensede gangliosider i negativ modus eller etter pre-metylering i positiv modus. Storskala rensing inkluderer ekstraksjon, saponering og HPLC-oppløsning for å gi rensede store hjerne gangliosider egnet for biologiske eksperimenter og for ytterligere kjemiske og enzymatiske modifikasjoner.En eksemplarisk HPLC-profil og påfølgende TLC-analyse vises. Alkalisk behandling, eller saponering, er nødvendig for å hydrolysere og fjerne forurensende fosfolipider, men vil også hydrolysere naturlige modifikasjoner av gangliosider som O-acetylerte sialsyrer, noe som kan være viktig i noen sammenhenger. Nøyaktige løsningsmiddelforhold for ekstraksjon, partisjonering av løsemidler og TLC-oppløsning er avgjørende for å forbedre gjenoppretting, renhet og analyser.Fra kreft til metabolisme til hjernefunksjon, gangliosider er fysiologiske modifikatorer og terapeutiske mål. Gangliosideisolasjon, rensing og analyser er hjørnesteiner for biomedisinsk oppdagelse og terapeutisk utvikling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, menneskelige celler og mus testikkel

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Utvinning og analyse av taiwanske grønne Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Høyoppløselig Complexome profilering av Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...