Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грантом Общего фонда национальных институтов здравоохранения (NIH) для гликонауки U01CA241953. MJP поддерживался программой химико-биологического интерфейса в Университете Джона Хопкинса (T32GM080189).

Сбор тканей проводился в условиях, разрешенных Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса.
1. Мелкомасштабная экстракция ганглиозидов и частичная очистка
ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующую вентиляцию при работе с летучими и токсичными ...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Методы мелкой и крупномасштабной экстракции и выделения ганглиозидов, о которых здесь сообщается, не являются уникальными - существует множество различных подходов к экстракции и очистке растворителем, которые обеспечивают отличные результаты12. Методы, описанные здесь д...

Ганглиозиды определяются как гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой кислоты1. Они экспрессируются главным образом на поверхности клетки с их гидрофобным церамидным липидным фрагментом, встроенным во внешний листок плазматической мембраны, и их гидрофильными гликанами, простирающимися во внеклеточное пространство2. Хотя они широко распространены в клетках и тканях позвоночных, они особенно распространены в мозге позвоночных3, где они были впервые обнаружены и названы4.
Структуры ганглиозидных гликанов различаются и являются основой для их номенклатуры (рисунок 1). Ганглиозидные гликаны состоят из нейтрального сахарного ядра, несущего различное количество и распределение сиаловых кислот. Самый маленький ганглиозид, GM4, имеет только два сахара (сиаловая кислота, связанная с галактозой)5. Более крупные природные ганглиозиды могут содержать более десятка общих сахаров6 или до семи сиаловых кислот на одном нейтральном ядре7. Их керамидные липидные фрагменты также различаются, имея различную длину сфингозина и различные амиды жирных кислот. В мозге позвоночных преобладают четыре вида ганглиозидов, GM1, GD1a, GD1b и GT1b. Экспрессия ганглиозидов регулируется развитием, специфична для тканей и специфична для типа клеток.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Рисунок 1: Основные ганглиозиды мозга и их биосинтетические предшественники. Структуры показаны с использованием номенклатуры символов для гликанов11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Ганглиозиды функционируют на молекулярном уровне, вовлекая и модулируя белки в своих собственных мембранах (цис-регуляция) или вовлекая гликансвязывающие белки во внеклеточную среду, включая бактериальные токсины и лектины на других клетках (транс-распознавание)3. Специфическое связывание ганглиозидов с регуляторными белками и/или самоассоциация с другими молекулами в липидные рафты приводит к изменениям в поведении клеток, которые влияют на структуру и функцию нервной системы, прогрессирование рака, метаболизм, воспаление, протеинопатии нейронов и инфекционные заболевания8. Из-за их разнообразных клеточных ролей методы их изоляции и анализа могут обеспечить более глубокое понимание регуляции физиологических и патологических процессов. Здесь представлены проверенные методы быстрой мелкомасштабной экстракции и анализа, а также экстрактивного масштабирования ганглиозидов из мозга. Обсуждаются возможности и проблемы для применения к другим тканям.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, которые содержат один или несколько остатков сиаловой кислоты. Они встречаются на всех клетках и тканях позвоночных, но особенно распространены в мозге. Экспрессируемые преимущественно на внешнем листочке плазматических мембран клеток, они модулируют активность белков клеточной поверхности через латеральную ассоциацию, действуют как рецепторы в клеточно-клеточных взаимодействиях и являются мишенями для патогенов и токсинов. Генетическая дисрегуляция биосинтеза ганглиозидов у человека приводит к тяжелым врожденным расстройствам нервной системы. Из-за их амфипатической природы извлечение, очистка и анализ ганглиозидов требуют методов, которые были оптимизированы многими исследователями за 80 лет с момента их открытия. Здесь мы описываем настольные методы экстракции, очистки и предварительного качественного и количественного анализа основных ганглиозидов из тканей и клеток, которые могут быть завершены за несколько часов. Мы также описываем методы более масштабного выделения и очистки основных видов ганглиозидов из мозга. Вместе эти методы обеспечивают аналитический и препаративный доступ к этому классу биологически активных молекул.

Методы, описанные в разделе 1 (малый масштаб), обеспечивают ганглиозиды в достаточном количестве и чистоте для качественного и количественного определения основных ганглиозидов мозга. Восстановление из мозга мыши составляет ~ 1 мкмоль ганглиозида на г влажного веса мозга (1 нмоль / мкл) п...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Ганглиозиды представляют собой гликосфинголипиды, несущие сиаловую кислоту, которые особенно распространены в головном мозге. Их амфипатическая природа требует органической / водной экстракции и методов очистки для обеспечения оптимального восстановления и точного анализа. В данной статье представлены обзоры аналитической и препаративной ганглиозидной экстракции, очистки и тонкослойного хроматографического анализа.

Экстракция, очистка и профилирование ганглиозидов

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Ганглиозиды экспрессируются на всех клеточных поверхностях позвоночных и особенно распространены на нервных клетках. Они регулируют клеточную сигнализацию и распознавание клеток-клеток. Этот протокол вводит выделение и анализ ганглиозидов.Методы были выбраны для максимизации выхода ганглиозидов в больших и малых масштабах при одновременной оптимизации очистки. Мы также описываем методы относительно быстрого выполнения качественного и полуколичественного анализа ганглиозидов. Изучение липидов, особенно полярных липидов, таких как ганглиозиды, требует других инструментов и методов, чем работа с белками или нуклеиновыми кислотами.Это видео познакомит вас с тем, как работать с этими молекулами. Поскольку растворители, такие как хлороформ и тетрагидрофуран, растворяют обычные пластмассы, мы используем стеклянные бутылки и флаконы с тефлоновыми крышками, стеклянные пипетки, стекло, микрошприцы из нержавеющей стали и гомогенизаторы тефлонового стекла во время этих процедур. Неспособность сделать это приводит к образованию пластиковых полимеров в продуктах, которые могут мешать анализу.Для начала добавьте 4,1 миллилитра воды на грамм ткани влажной массы, и гомогенизируйте ее 10 ударами. Добавьте 13 миллилитров метанола на грамм ткани. Переложите его до температуры окружающей среды 22 градуса Цельсия и перемешайте.Переложите ткань в толстостенную стеклянную завинчивающуюся трубку с завинчивающейся крышкой из PTFE и тщательно перемешайте. Добавьте 6,5 миллилитров хлороформа на грамм ткани, колпачкайте его и тщательно перемешайте. Центрифуга по 450 раз г в течение 15 мин.Затем перенесите прозрачный супернатант в свежую трубку с завинчивающейся крышкой и измерьте объем как восстановленный объем экстракта. Для разделения добавьте в 0,173 раза больше восстановленного объема экстракта воды к прозрачному супернатанту. Затем закройте его крышкой.Вихрь энергично. Центрифуга по 450 раз г в течение 15 мин. Перенесите верхнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в свежую стеклянную трубку с винтовой крышкой, облицованной PTFE.Для выполнения обратнофазной картриджной хроматографии используйте пятимиллилитровой стеклянный шприц для промывки твердофазного экстракционного картриджа tC18 тремя миллилитрами метанола. Затем добавляют три миллилитра хлороформа-метанола-воды в соотношении два к 43 к 55. Загрузите верхнюю фазу с предыдущего шага на картридж tC18 через тот же стеклянный шприц.Соберите сквозной поток и перезагрузите его на столбец, чтобы оптимизировать адсорбцию. Промыть картридж тремя миллилитрами хлороформ-метанол-воды, а затем тремя миллилитрами метаноловой воды. Элюируйте ганглиозиды тремя миллилитрами метанола в свежую трубку с завинчивающейся крышкой.Испаряются до сухости под мягким потоком азота при температуре менее или равной 45 градусам Цельсия. Растворяют в метаноле по одному миллилитру на грамм исходной ткани влажной массы. Поместите 100 граммов серого вещества мозга в блендер и добавьте один миллилитр на грамм мозговой влаги охлажденного 10-миллимолярного фосфатного буфера калия рН 6,8.Затем гомогенизировать на низком уровне в течение 20 секунд. Добавьте восемь миллилитров тетрагидрофурана на грамм мозгового влажного веса и гомогенизируйте на низком уровне в течение 10 секунд. Декантировать в стеклянные бутылки-центрифуги и центрифугу по 5 000 г в течение 15 минут.Соберите супернатант, измерьте его объем, а затем перенесите его в стеклянную сепараторную воронку. Добавьте 0,3 миллилитра этилового эфира на миллилитр супернатанта. Энергично встряхните.Затем дайте ему спокойно постоять в течение 30 минут, в течение которых две фазы, верхняя эфирная фаза и нижняя водная фаза, разделяются. Соберите нижнюю фазу, которая содержит ганглиозиды, в стеклянную бутылку с крышкой из PTFE. К верхней эфирной фазе, остающейся в сепараторной воронке, добавляют 0,1 миллилитра воды на миллилитр исходного супернатанта с предыдущей стадии.Энергично встряхните. Разрешите фазам разделяться. Затем соберите нижнюю водную фазу и соедините ее с ранее собранной нижней фазой.Испарите комбинированные нижние фазы в сухой порошок и взвесьте его. Для выполнения обратнофазной хроматографии предварительно промывайте крупномасштабную твердофазную экстракционную картриджную картридж tC18, пропуская 50 миллилитров растворителей через колонну с использованием вакуума или давления менее одной минуты на промывку. Загрузите верхнюю фазу из разделения фаз после омыления на колонну вакуумом или давлением.Затем соберите сквозной поток, перезагрузите его и снова соберите поток для последующего анализа. Промойте колонку по 30 миллилитров хлороформ-метанол-вода, а затем метанол-вода. Затем элюируют ганглиозиды 50 миллилитрами метанола, а затем снова 10 миллилитрами метанола.Соберите каждую стирку и элюирование отдельно. Используйте тонкослойную хроматографию, или TLC, чтобы подтвердить, что ганглиозиды отсутствуют в протекании и промываются и элюируются при первом элюировании метанола. Испарите элюированные ганглиозиды в сухой порошок и взвесьте их.Для выполнения TLC налейте работающий растворитель в стеклянную камеру TLC размером 10 на 10 сантиметров с крышкой из нержавеющей стали таким образом, чтобы глубина растворителя составляла 0,5 сантиметра. Накройте камеру и дайте ей уравновеситься в течение примерно 10 минут. Вымойте 10-микролитровый шприц Гамильтона скошенной иглой с использованием метанола.Нарисуйте один микролитр метанола в стеклянный шприц, чтобы заполнить мертвый объем иглы, а затем один микролитр образца или стандартного. Равномерно нанесите образец на пятимиллиметровые предварительно отмеченные линии до тех пор, пока в шприце не останется менее одного микролитра растворителя метанола. Дайте пластине высохнуть при 22 градусах Цельсия после того, как все образцы будут замечены.Поместите пятнистую и высушенную пластину в предварительно уравновешенную камеру TLC с нижним краем, погруженным в работающий растворитель. Позвольте работающему растворителю продвинуться вверх по пластине капиллярным действием до тех пор, пока передняя часть растворителя не достигнет одного сантиметра от верхней части пластины. Снимите и пометьте карандашом переднюю часть растворителя по краю пластины.Позвольте растворителям полностью испаряться либо без помех, либо под мягким потоком воздуха. В химическом вытяжном шкафу поместите пластину TLC с разрешенным концом ганглиозидов вверх ногами в вырезанную картонную коробку, чтобы защитить стенки вытяжки от кислотного распыления. Поместите реагент спрея реагента реагента в стеклянный распылитель TLC.Прикрепите его к источнику азота под давлением, и слегка распылите пластину по диагонали в вертикальном и горизонтальном направлениях. Немедленно накройте пластину чистой, сухой стеклянной крышкой тех же размеров и закрепите крышку на месте связующими зажимами. Нагрейте накрытую тарелку при 125 градусах Цельсия в течение 20 минут.Ганглиозиды будут казаться темно-фиолетовыми на белом фоне. Для выполнения липидного окрашивания опустите пластину TLC с разрешенными ганглиозидами стороной вниз в стакан, содержащий анизальдегидное пятно. Погрузитесь в бегущий фронт чуть более чем на две секунды.Затем дайте ему стечь. Нагревайте пластину TLC на конфорке при низкой температуре для развития. Этот протокол обеспечивает ганглиозиды в достаточном количестве и чистоте для качественного и количественного определения.Разрешение TLC в один микролитр обеспечивает достаточный материал для обнаружения резорцина и разрешает все основные ганглиозиды мозга для диких и генетически модифицированных мышей. Хотя полученные смешанные ганглиозиды не свободны от других основных липидов, они имеют достаточную чистоту для масс-спектрометрического определения либо в виде нативных очищенных ганглиозидов в отрицательном режиме, либо после предварительного метилирования в положительном режиме. Крупномасштабная очистка включает экстракцию, омыление и разрешение ВЭЖХ для обеспечения очищенных основных ганглиозидов мозга, пригодных для биологических экспериментов и для дальнейших химических и ферментативных модификаций.Показан примерный профиль ВЭЖХ и последующий анализ TLC. Щелочная обработка, или омыление, необходима для гидролиза и удаления загрязняющих фосфолипидов, но также гидролизует естественные модификации ганглиозидов, такие как O-ацетилированные сиаловые кислоты, которые могут быть важны в некоторых контекстах. Точные соотношения растворителей для экстракции, разделения растворителей и разрешения TLC имеют решающее значение для повышения извлечения, чистоты и анализа.От рака до метаболизма и функции мозга, ганглиозиды являются физиологическими модификаторами и терапевтическими мишенями. Выделение, очистка и анализ ганглиозидов являются краеугольными камнями для биомедицинских открытий и терапевтических разработок.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Полисома профилирование лейшманий, клетки человека и мыши яичка

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Извлечение и анализ тайваньского зеленый прополиса

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...