Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención U01CA241953 del Fondo Común para la Glicociencia de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). MJP fue apoyado por el Programa de Interfaz Química-Biología en Johns Hopkins (T32GM080189).

La recolección de tejidos se realizó en condiciones autorizadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.
1. Extracción de gangliósidos a pequeña escala y purificación parcial
PRECAUCIÓN: Use ventilación adecuada cuando trabaje con solventes volátiles y tóxicos. Evite el plástico en todas partes; los disolventes extraerán componentes químicos de muchos plásticos que interfieren con los análisis posteriores. El politetrafluoroetileno ...

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	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Los métodos para la extracción y el aislamiento de gangliósidos a pequeña y gran escala reportados aquí no son únicos: existen muchos enfoques diferentes de extracción y purificación con solventes que proporcionan excelentes resultados12. Los métodos reportados aquí para la purificación a pequeña escala del cerebro, de Fredman y Svennerholm13, demostraron optimizar la recuperación y han demostrado ser robustos y sencillos durante muchos años en nuestro laborat...

Los gangliósidos se definen como glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico1. Se expresan principalmente en la superficie celular con su fracción lipídica de ceramida hidrofóbica incrustada en la valva externa de la membrana plasmática y sus glicanos hidrófilos que se extienden hacia el espacio extracelular2. Aunque se distribuyen ampliamente en las células y tejidos de los vertebrados, son particularmente abundantes en el cerebro de los vertebrados3, donde fueron descubiertos y nombrados por primera vez4.
Las estructuras de los glicanos gangliósidos varían y son la base de su nomenclatura (Figura 1). Los glicanos gangliósidos se componen de un núcleo de azúcar neutro que contiene diferentes números y distribuciones de ácidos siálicos. El gangliósido más pequeño, GM4, tiene sólo dos azúcares (ácido siálico unido a la galactosa)5. Los gangliósidos naturales más grandes pueden contener más de una docena de azúcares totales6 o hasta siete ácidos siálicos en un solo núcleo neutro7. Sus fracciones lipídicas de ceramida también varían, teniendo diferentes longitudes de esfingosina y una variedad de amidas de ácidos grasos. En el cerebro de los vertebrados predominan cuatro especies de gangliósidos, GM1, GD1a, GD1b y GT1b. La expresión gangliósida está regulada por el desarrollo, específica del tejido y específica del tipo de célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figura 1: Principales gangliósidos cerebrales y sus precursores biosintéticos. Las estructuras se muestran utilizando la nomenclatura de símbolos para glicanos11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los gangliósidos funcionan a nivel molecular al involucrar y modular proteínas en sus propias membranas (regulación cis) o al involucrar proteínas de unión a glicanos en el medio extracelular, incluidas las toxinas bacterianas y las lectinas en otras células (reconocimiento trans)3. La unión específica de gangliósidos a proteínas reguladoras y/o la autoasociación con otras moléculas en balsas lipídicas da como resultado cambios en el comportamiento celular que afectan la estructura y función del sistema nervioso, la progresión del cáncer, el metabolismo, la inflamación, las proteinopatías neuronales y las enfermedades infecciosas8. Debido a sus diversas funciones celulares, los métodos para su aislamiento y análisis pueden proporcionar una mayor comprensión de la regulación de los procesos fisiológicos y patológicos. Aquí, se proporcionan métodos validados para la extracción y el análisis rápidos a pequeña escala, y el aislamiento a escala preparativa de gangliósidos del cerebro. Se discuten las oportunidades y desafíos para la aplicación a otros tejidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico. Se encuentran en todas las células y tejidos de vertebrados, pero son especialmente abundantes en el cerebro. Expresados principalmente en la valva externa de las membranas plasmáticas de las células, modulan las actividades de las proteínas de la superficie celular a través de la asociación lateral, actúan como receptores en las interacciones célula-célula y son objetivos para patógenos y toxinas. La desregulación genética de la biosíntesis de gangliósidos en humanos da como resultado trastornos congénitos graves del sistema nervioso. Debido a su naturaleza anfipática, la extracción, purificación y análisis de gangliósidos requieren técnicas que han sido optimizadas por muchos investigadores en los 80 años transcurridos desde su descubrimiento. Aquí, describimos métodos a nivel de banco para la extracción, purificación y análisis cualitativos y cuantitativos preliminares de los principales gangliósidos de tejidos y células que se pueden completar en unas pocas horas. También describimos métodos para el aislamiento y purificación a mayor escala de las principales especies de gangliósidos del cerebro. Juntos, estos métodos proporcionan acceso a escala analítica y preparativa a esta clase de moléculas bioactivas.

Los métodos descritos en la sección 1 (pequeña escala) proporcionan gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa de los principales gangliósidos cerebrales. La recuperación del cerebro del ratón es de ~ 1 μmol de gangliósido por g de peso húmedo cerebral (1 nmol / μL) cuando se prepara como se describe. La resolución TLC de 1 μL (1 nmol) utilizando la sección 3 proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales ...

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Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos portadores de ácido siálico que son particularmente abundantes en el cerebro. Su naturaleza anfipática requiere técnicas de extracción y purificación orgánicas / acuosas para garantizar una recuperación óptima y análisis precisos. Este artículo proporciona información general sobre la extracción de gangliósidos a escala analítica y preparativa, la purificación y el análisis de cromatografía de capa delgada.

Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Los gangliósidos se expresan en todas las superficies celulares de los vertebrados y son especialmente abundantes en las células nerviosas. Regulan la señalización celular y el reconocimiento célula-célula. Este protocolo introduce el aislamiento y análisis de gangliósidos.Las técnicas se seleccionaron para maximizar los rendimientos de gangliósidos a grandes y pequeñas escalas al tiempo que se racionalizaba la purificación. También se describen métodos para realizar con relativa rapidez análisis de gangliósidos cualitativos y semicuantitativos. El estudio de lípidos, especialmente lípidos polares como los gangliósidos, requiere herramientas y técnicas diferentes a las de trabajar con proteínas o ácidos nucleicos.Este video lo familiariza con cómo trabajar con estas moléculas. Debido a que los solventes como el cloroformo y el tetrahidrofurano disuelven los plásticos comunes, utilizamos botellas y viales de vidrio con tapas forradas de teflón, pipetas de vidrio, vidrio, microjeringes de acero inoxidable y homogeneizadores de vidrio de teflón a lo largo de estos procedimientos. De lo contrario, se producen polímeros plásticos en los productos que pueden interferir con los análisis.Para empezar, añade 4,1 mililitros de agua por gramo de peso húmedo de tejido, y homogeneiza con 10 golpes. Añadir 13 mililitros de metanol por gramo de tejido. Transfiéralo a una temperatura ambiente de 22 grados centígrados y mezcle.Transfiera el tejido a un tubo de paredes gruesas, de vidrio y tapón de rosca con una tapa de rosca forrada de PTFE y mezcle bien. Agregue 6.5 mililitros de cloroformo por gramo de tejido, cúbralo y mezcle bien. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos.Luego transfiera el sobrenadante transparente a un tubo fresco con tapa de rosca y mida el volumen como volumen de extracto recuperado. Para la partición, agregue 0.173 veces el volumen de agua de extracto recuperado al sobrenadante claro. Luego cúbrelo.Vórtice vigorosamente. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos. Transfiera la fase superior, que contiene los gangliósidos, a un tubo de vidrio fresco con una tapa de rosca forrada de PTFE.Para realizar cromatografía de cartucho de fase inversa, use una jeringa de vidrio de cinco mililitros para lavar un cartucho de extracción de fase sólida tC18 con tres mililitros de metanol. Luego agregue tres mililitros de cloroformo-metanol-agua en una proporción de dos a 43 a 55. Cargue la fase superior del paso anterior en el cartucho tC18 a través de la misma jeringa de vidrio.Recopile el flujo y vuelva a cargarlo en la columna para optimizar la adsorción. Lave el cartucho con tres mililitros de cloroformo-metanol-agua y luego con tres mililitros de metanol-agua. Eluya los gangliósidos con tres mililitros de metanol en un tubo fresco con tapa de rosca.Evaporar a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno a una temperatura menor o igual a 45 grados centígrados. Disolver en metanol a un mililitro por gramo de peso húmedo del tejido original. Coloque 100 gramos de materia gris cerebral en una licuadora y agregue un mililitro por gramo de peso húmedo cerebral de tampón de fosfato de potasio 10 milimolar refrigerado de pH 6.8.Luego homogeneizar en baja durante 20 segundos. Agregue ocho mililitros de tetrahidrofurano por gramo de peso húmedo cerebral y homogeneice a baja temperatura durante 10 segundos. Decantar en botellas de centrífuga de vidrio, y centrifugar a 5. 000 veces g durante 15 minutos.Recoja el sobrenadante, mida su volumen y luego transfiéralo a un embudo separador de vidrio. Añadir 0,3 mililitros de éter etílico por mililitro del sobrenadante. Agitar vigorosamente.Luego deje que se asiente sin ser molestado durante 30 minutos, durante los cuales se separan dos fases, una fase superior del éter y una fase acuosa inferior. Recoja la fase inferior, que contiene los gangliósidos, en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE. A la fase superior de éter que queda en el embudo separador, agregue 0,1 mililitros de agua por mililitro de sobrenadante original del paso anterior.Agitar vigorosamente. Permita que las fases se separen. Luego recoja la fase acuosa inferior y combínela con la fase inferior previamente recolectada.Evaporar las fases inferiores combinadas a un polvo seco y pesarlo. Para realizar cromatografía de fase inversa, prelavado de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 a gran escala pasando 50 mililitros de disolventes a través de la columna utilizando vacío o presión durante menos de un minuto por lavado. Cargue la fase superior desde la separación de la fase posterior a la saponificación en la columna por vacío o presión.A continuación, recoja el flujo a través, vuelva a cargarlo y vuelva a recoger el flujo para su posterior análisis. Lave la columna con 30 mililitros cada uno de cloroformo-metanol-agua, seguido de metanol-agua. Luego eluya los gangliósidos con 50 mililitros de metanol y luego nuevamente con 10 mililitros de metanol.Recoge cada lavado y elución por separado. Use cromatografía de capa delgada, o TLC, para confirmar que los gangliósidos están ausentes del flujo y lavados y eluidos en la primera elución de metanol. Evaporar los gangliósidos eluidos a un polvo seco y pesarlos.Para realizar TLC, vierta el disolvente corriente en una cámara TLC de vidrio de 10 por 10 centímetros con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de 0,5 centímetros. Cubra la cámara y deje que se equilibre durante unos 10 minutos. Lave una jeringa Hamilton de 10 microlitros con una aguja biselada con metanol.Extraiga un microlitro de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego un microlitro de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de cinco milímetros hasta que quede menos de un microlitro de disolvente de metanol en la jeringa. Deje que la placa se seque a 22 grados centígrados después de que se detecten todas las muestras.Coloque la placa manchada y seca sobre la cámara TLC preequilibrada con el borde inferior sumergido en el disolvente de funcionamiento. Permita que el disolvente en funcionamiento avance hacia arriba de la placa por acción capilar hasta que el frente del disolvente alcance dentro de un centímetro de la parte superior de la placa. Retire y marque el frente del disolvente en el borde de la placa con un lápiz.Permita que los disolventes se evaporen completamente, ya sea sin perturbaciones o bajo un flujo de aire suave. En una campana de humos químicos, coloque la placa TLC con el extremo de origen de gangliósidos resuelto boca abajo en una caja de cartón cortada para proteger las paredes de la campana del aerosol ácido. Coloque el reactivo de pulverización de resorcinol en un pulverizador TLC de vidrio.Adjúntelo a una fuente de nitrógeno presurizado y rocíe ligeramente la placa en diagonal en las direcciones vertical y horizontal. Cubra inmediatamente la placa con una placa de cubierta de vidrio limpia y seca de las mismas dimensiones, y asegure la placa de cubierta en su lugar con clips de aglutinante. Calentar la placa cubierta a 125 grados centígrados durante 20 minutos.Los gangliósidos aparecerán de color púrpura oscuro sobre un fondo blanco. Para realizar la tinción lipídica, sumerja la placa TLC con el origen de gangliósidos resueltos de lado hacia abajo en un vaso de precipitados que contenga la tinción de anisaldehído. Sumérgete en el frente de carrera durante poco más de dos segundos.Luego deje que drene. Calentar la placa TLC en una placa caliente a baja temperatura para que se desarrolle. Este protocolo proporciona gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa.La resolución TLC de un microlitro proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cerebrales para ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados. Aunque los gangliósidos mixtos preparados no están libres de otros lípidos importantes, son de suficiente pureza para la determinación espectrométrica de masas, ya sea como gangliósidos purificados nativos en modo negativo o después de la premetilación en modo positivo. La purificación a gran escala incluye extracción, saponificación y resolución de HPLC para proporcionar gangliósidos cerebrales principales purificados adecuados para experimentos biológicos y para modificaciones químicas y enzimáticas adicionales.Se muestra un perfil de HPLC ejemplar y el posterior análisis de TLC. El tratamiento alcalino, o saponificación, es necesario para hidrolizar y eliminar los fosfolípidos contaminantes, pero también hidrolizará las modificaciones naturales de los gangliósidos, como los ácidos siálicos O-acetilados, que pueden ser importantes en algunos contextos. Las proporciones precisas de disolventes para la extracción, la partición de disolventes y la resolución de TLC son fundamentales para mejorar la recuperación, la pureza y los análisis.Desde el cáncer hasta el metabolismo y la función cerebral, los gangliósidos son modificadores fisiológicos y objetivos terapéuticos. El aislamiento gangliósido, la purificación y los análisis son piedras angulares para el descubrimiento biomédico y el desarrollo terapéutico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Investigación

Bioquímica

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

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Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extracción y análisis de propóleos verde Taiwan

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...