Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP stöddes av Chemistry-Biology Interface Program vid Johns Hopkins (T32GM080189).

Vävnadsinsamling utfördes under förhållanden som godkänts av Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Småskalig gangliosidutvinning och partiell rening
VARNING: Använd lämplig ventilation när du arbetar med flyktiga och giftiga lösningsmedel. Undvik plast hela tiden; lösningsmedel kommer att extrahera kemiska komponenter från många plaster som stör efterföljande analyser. Polytetrafluoretylen (PTFE) är ett undantag; PTFE-fodrade förslutningar b...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Metoderna för extraktion och isolering av gangliosid som rapporteras här är inte unika – det finns många olika metoder för extraktion och rening av lösningsmedel som ger utmärkta resultat12. De metoder som här redovisas för småskalig rening från hjärnan, från Fredman och Svennerholm13, har visat sig optimera återhämtningen och har under många år visat sig vara robusta och okomplicerade i vårt laboratorium. Isolering och rening som är lämplig för TLC o...

Gangliosider definieras som glykosfingolipider som bär på en eller flera sialinsyrarester1. De uttrycks främst vid cellytan med sin hydrofoba ceramidlipiddel inbäddad i plasmamembranets yttre bipacksedel och deras hydrofila glykaner som sträcker sig in i det extracellulära utrymmet2. Även om de förekommer i stor utsträckning i ryggradsdjurens celler och vävnader är de särskilt rikliga i ryggradsdjurens hjärna3, där de först upptäcktes och namngavs4.
Strukturerna hos gangliosidglykaner varierar och ligger till grund för deras nomenklatur (figur 1). Gangliosidglykaner består av en neutral sockerkärna som bär olika antal och fördelningar av sialinsyror. Den minsta gangliosiden, GM4, har endast två sockerarter (sialinsyra bunden till galaktos)5. Större naturligt förekommande gangliosider kan innehålla långt över ett dussin sockerarter totalt6 eller upp till sju sialinsyror på en enda neutral kärna7. Deras ceramidlipiddel varierar också, med olika sfingosinlängder och en mängd olika fettsyraamider. I ryggradsdjurens hjärna dominerar fyra gangliosidarter, GM1, GD1a, GD1b och GT1b. Gangliosiduttryck är utvecklingsreglerat, vävnadsspecifikt och celltypsspecifikt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figur 1: Stora hjärngangliosider och deras biosyntetiska prekursorer. Strukturer visas med symbolnomenklatur för glykaner11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Gangliosider fungerar på molekylär nivå genom att engagera och modulera proteiner i sina egna membran (cis-reglering) eller genom att engagera glykanbindande proteiner i den extracellulära miljön, inklusive bakterietoxiner och lektiner på andra celler (transigenkänning)3. Specifik bindning av gangliosider till reglerande proteiner och/eller självassociation med andra molekyler i lipidflottar resulterar i förändringar i cellbeteende som påverkar nervsystemets struktur och funktion, cancerprogression, metabolism, inflammation, neuronala proteinopatier och infektionssjukdomar8. På grund av deras olika cellulära roller kan metoder för deras isolering och analys ge ökad insikt i regleringen av fysiologiska och patologiska processer. Här tillhandahålls validerade metoder för snabb småskalig extraktion och analys samt preparativ skalisolering av gangliosider från hjärnan. Möjligheter och utmaningar för applicering på andra vävnader diskuteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosider är glykosfingolipider som innehåller en eller flera sialinsyrarester. De finns på alla ryggradsdjurs celler och vävnader men är särskilt rikliga i hjärnan. Uttryckt främst på den yttre bipacksedeln i cellernas plasmamembran modulerar de aktiviteterna hos cellytproteiner via lateral association, fungerar som receptorer i cell-cellinteraktioner och är mål för patogener och toxiner. Genetisk dysregulering av gangliosidbiosyntes hos människor resulterar i allvarliga medfödda nervsystemet. På grund av deras amfipatiska natur kräver extraktion, rening och analys av gangliosider tekniker som har optimerats av många utredare under de 80 åren sedan deras upptäckt. Här beskriver vi bänknivåmetoder för extraktion, rening och preliminära kvalitativa och kvantitativa analyser av större gangliosider från vävnader och celler som kan slutföras på några timmar. Vi beskriver också metoder för storskalig isolering och rening av större gangliosidarter från hjärnan. Tillsammans ger dessa metoder analytisk och preparativ skala tillgång till denna klass av bioaktiva molekyler.

De metoder som beskrivs i avsnitt 1 (småskalighet) ger gangliosider i tillräcklig mängd och renhet för kvalitativ och kvantitativ bestämning av större hjärngangliosider. Återhämtning från mushjärnan är ~ 1 μmol gangliosid per g hjärnvåtvikt (1 nmol / μL) när den bereds enligt beskrivningen. TLC-upplösning på 1 μL (1 nmol) med användning av avsnitt 3 ger gott om material för resorcinoldetektion och löser alla större hjärngangliosider som visas för vilda och genetiskt modifierade möss i <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosider är sialinsyrabärande glykosfingolipider som är särskilt rikliga i hjärnan. Deras amfipatiska natur kräver organiska/vattenhaltiga extraktions- och reningstekniker för att säkerställa optimal återvinning och noggranna analyser. Den här artikeln innehåller översikter över analytisk och preparativ skala gangliosidextraktion, rening och tunnskiktskromatografianalys.

Utvinning, rening och profilering av gangliosid

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliosider uttrycks på alla ryggradsdjurs cellytor och är särskilt rikliga på nervceller. De reglerar cellsignalering och cell-celligenkänning. Detta protokoll introducerar gangliosidisolering och analys.Teknikerna valdes för att maximera gangliosidutbytet i stora och små skalor samtidigt som rening effektiviserades. Vi beskriver också metoder för att relativt snabbt utföra kvalitativa och semikvantitativa gangliosidanalyser. Studier av lipider, särskilt polära lipider som gangliosider, kräver andra verktyg och tekniker än att arbeta med proteiner eller nukleinsyror.Den här videon bekantar dig med hur du arbetar med dessa molekyler. Eftersom lösningsmedel som kloroform och tetrahydrofuran löser upp vanlig plast använder vi glasflaskor och injektionsflaskor med teflonfodrade lock, glaspipetter, glas, mikroyreringar i rostfritt stål och teflonglashomogenisatorer under dessa procedurer. Underlåtenhet att göra detta resulterar i plastpolymerer i produkterna som kan störa analyserna.Börja med att tillsätta 4,1 ml vatten per gram vävnads våtvikt och homogenisera det med 10 slag. Tillsätt 13 ml metanol per gram vävnad. Överför den till en omgivningstemperatur på 22 grader Celsius och blanda.Överför vävnaden till ett tjockväggigt, glas, skruvlockat rör med ett PTFE-fodrat skruvlock och blanda noggrant. Tillsätt 6,5 ml kloroform per gram vävnad, täck den och blanda noggrant. Centrifug vid 450 gånger g i 15 minuter.Överför sedan den klara supernatanten till ett färskt, skruvlockat rör och mät volymen som återvunnen extraktvolym. För partitionering, tillsätt 0,173 gånger den återvunna extraktvolymen vatten till den klara supernatanten. Täck sedan det.Virvel kraftigt. Centrifug vid 450 gånger g i 15 minuter. Överför den övre fasen, som innehåller gangliosiderna, till ett nytt glasrör med ett PTFE-fodrat skruvlock.För att utföra patronkromatografi i omvänd fas, använd en fem milliliter glasspruta för att tvätta en tC18 fastfas extraktionspatron med tre milliliter metanol. Tillsätt sedan tre milliliter kloroform-metanol-vatten i ett förhållande av två till 43 till 55. Ladda den övre fasen från föregående steg på tC18-patronen genom samma glasspruta.Samla in genomströmningen och ladda om den i kolumnen för att optimera adsorptionen. Tvätta patronen med tre milliliter kloroform-metanol-vatten och sedan med tre milliliter metanol-vatten. Eluera gangliosiderna med tre milliliter metanol i ett färskt, skruvtäckt rör.Avdunsta till torrhet under en mild kväveström vid en temperatur mindre än eller lika med 45 grader Celsius. Lös upp i metanol vid en milliliter per gram ursprunglig vävnad våtvikt. Placera 100 gram hjärngrå substans i en mixer och tillsätt en milliliter per gram hjärnvåtvikt av kyld, 10-millimolär kaliumfosfatbuffert med pH 6,8.Homogenisera sedan på låg i 20 sekunder. Tillsätt åtta milliliter tetrahydrofuran per gram hjärnvåtvikt och homogenisera på låg i 10 sekunder. Dekantera i glascentrifugflaskor och centrifug vid 5000 gånger g i 15 minuter.Samla supernatanten, mät dess volym och överför den sedan till en glasavskiljande tratt. Tillsätt 0,3 ml etyleter per milliliter supernatant. Skaka kraftigt.Låt den sedan sitta ostörd i 30 minuter, under vilken två faser, en övre eterfas och en lägre vattenfas, separeras. Samla den nedre fasen, som innehåller gangliosiderna, i en glasflaska med ett PTFE-fodrat lock. Till den övre eterfasen som återstår i separationstratten, tillsätt 0,1 ml vatten per milliliter original supernatant från föregående steg.Skaka kraftigt. Låt faser separeras. Samla sedan den nedre vattenhaltiga fasen och kombinera den med den tidigare uppsamlade nedre fasen.Avdunsta de kombinerade nedre faserna till ett torrt pulver och väga det. För att utföra omvänd faskromatografi, förtvätta en storskalig tC18 fastfasextraktionspatron genom att passera 50 ml lösningsmedel genom kolonnen med vakuum eller tryck i mindre än en minut per tvätt. Ladda den övre fasen från efterförtvålningsfaseparationen på kolonnen genom vakuum eller tryck.Samla sedan in genomströmningen, ladda om den och samla in genomströmningen igen för efterföljande analys. Tvätta kolonnen med 30 ml vardera kloroform-metanol-vatten, följt av metanol-vatten. Eluera sedan gangliosiderna med 50 ml metanol och sedan igen med 10 ml metanol.Samla varje tvätt och eluering separat. Använd tunnskiktskromatografi, eller TLC, för att bekräfta att gangliosider saknas från genomströmningen och tvättar och elueras vid den första elueringen av metanol. Avdunsta de eluerade gangliosiderna till ett torrt pulver och väg dem.För att utföra TLC, häll löpande lösningsmedel i en 10-till-10 centimeter, glas TLC-kammare med ett rostfritt stålskydd så att lösningsmedelsdjupet är 0,5 centimeter. Täck kammaren och låt den balansera i ca 10 minuter. Tvätta en 10 mikroliter Hamilton-spruta med en fasad nål med metanol.Rita en mikroliter metanol i en glasspruta för att fylla nålens dödvolym och sedan en mikroliter prov eller standard. Spot provet jämnt på de fem millimeter, förmarkerade linjerna tills mindre än en mikroliter metanollösningsmedel finns kvar i sprutan. Låt plattan torka vid 22 grader Celsius efter att alla prover har upptäckts.Placera den fläckiga och torkade plattan på den förbalanserade TLC-kammaren med den nedre kanten nedsänkt i det löpande lösningsmedlet. Låt det löpande lösningsmedlet avancera upp på plattan genom kapillärverkan tills lösningsmedlets framsida når inom en centimeter från toppen av plattan. Ta bort och markera lösningsmedlets framsida vid kanten av plattan med en penna.Låt lösningsmedlen avdunsta helt antingen ostört eller under milt luftflöde. I en kemisk draghuva, placera TLC-plattan med de lösta gangliosidernas ursprungsända upp och ner i en bortskuren kartong för att skydda huvens väggar från syraspray. Placera resorcinol sprayreagens i en TLC-spruta i glas.Fäst den på en källa till trycksatt kväve och spraya plattan lätt diagonalt i vertikala och horisontella riktningar. Täck omedelbart plattan med en ren, torr glasplatta av samma dimensioner och säkra täckplattan på plats med bindemedelsklämmor. Värm den täckta plattan vid 125 grader Celsius i 20 minuter.Gangliosider kommer att se mörklila ut mot en vit bakgrund. För att utföra lipidfärgning, doppa TLC-plattan med den upplösta gangliosidernas ursprungssida nedåt i en bägare som innehåller anisaldehydfläcken. Sänk ner till löpfronten i drygt två sekunder.Låt det sedan rinna av. Värm TLC-plattan på en kokplatta vid låg temperatur för att utvecklas. Detta protokoll ger gangliosider i tillräcklig mängd och renhet för kvalitativ och kvantitativ bestämning.TLC-upplösning av en mikroliter ger gott om material för resorcinoldetektering och löser alla de stora hjärngangliosiderna för vildtyp och genetiskt modifierade möss. Även om de beredda blandade gangliosiderna inte är fria från andra större lipider, är de av tillräcklig renhet för masspektrometrisk bestämning antingen som inhemska renade gangliosider i negativt läge eller efter förmetylering i positivt läge. Storskalig rening inkluderar extraktion, förtvålning och HPLC-upplösning för att tillhandahålla renade stora hjärngangliosider som är lämpliga för biologiska experiment och för ytterligare kemiska och enzymatiska modifieringar.En exemplifierande HPLC-profil och efterföljande TLC-analys visas. Alkalibehandling, eller förtvålning, är nödvändig för att hydrolysera och avlägsna förorenande fosfolipider men kommer också att hydrolysera naturliga modifieringar av gangliosider såsom O-acetylerade sialinsyror, vilket kan vara viktigt i vissa sammanhang. Exakta lösningsmedelsförhållanden för extraktion, lösningsmedelspartitionering och TLC-upplösning är avgörande för att förbättra återvinning, renhet och analyser.Från cancer till metabolism till hjärnfunktion är gangliosider fysiologiska modifierare och terapeutiska mål. Gangliosidisolering, rening och analyser är hörnstenar för biomedicinsk upptäckt och terapeutisk utveckling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratorieskala Produktion och rening av en terapeutisk antikropp

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Extraktion och analys av taiwanesiska grön Propolis

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...