Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Glikobilim Ortak Fonu hibesi U01CA241953 tarafından desteklenmiştir. MJP, Johns Hopkins'teki Kimya-Biyoloji Arayüz Programı (T32GM080189) tarafından desteklenmiştir.

Doku toplama, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından yetkilendirilen koşullar altında gerçekleştirildi.
1. Küçük ölçekli ganglioside ekstraksiyonu ve kısmi arıtma
DİKKAT: Uçucu ve toksik çözücülerle çalışırken uygun havalandırma kullanın. Boyunca plastikten kaçının; çözücüler, sonraki analizlere müdahale eden birçok plastikten kimyasal bileşenleri çıkaracaktır. Politetrafloroetilen (PTFE) bir istisnadır; Cam ...

<ol>
	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

Burada bildirilen küçük ve büyük ölçekli gangliosid ekstraksiyonu ve izolasyonu yöntemleri benzersiz değildir - mükemmel sonuçlar veren birçok farklı çözücü ekstraksiyonu ve saflaştırma yaklaşımı vardır12. Burada beyinden, Fredman ve Svennerholm'dan13 küçük ölçekli saflaştırma için bildirilen yöntemlerin iyileşmeyi optimize ettiği ve laboratuvarımızda uzun yıllar boyunca sağlam ve basit olduğu kanıtlanmıştır. TLC ve MS için uygun ...

Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı taşıyan glikozfingolipidler olarak tanımlanır1. Plazma zarının dış broşürüne gömülü hidrofobik seramid lipid köstebekleri ve hücre dışı boşluğa uzanan hidrofilik glikanları ile öncelikle hücre yüzeyinde eksprese edilirler2. Omurgalı hücrelerinde ve dokularında yaygın olarak dağılmış olmalarına rağmen, ilk keşfedildikleri ve adlandırıldıkları omurgalı beyninde3 özellikle bol miktarda bulunurlar4.
Gangliosid glikanlarının yapıları değişir ve isimlendirmelerinin temelidir (Şekil 1). Ganglioside glikanları, sialik asitlerin farklı sayılarını ve dağılımlarını taşıyan nötr bir şeker çekirdeğinden oluşur. En küçük ganglioside olan GM4, sadece iki şekere sahiptir (galaktoza bağlı sialik asit)5. Doğal olarak oluşan daha büyük gangliosidler, tek bir nötr çekirdek üzerinde bir düzineden fazla toplam şeker6 veya yedi adede kadar sialik asit içerebilir7. Seramid lipit moieties de farklı sfingozin uzunluklarına ve çeşitli yağ asidi amidlerine sahip olarak değişir. Omurgalı beyninde dört ganglioside türü, GM1, GD1a, GD1b ve GT1b baskındır. Ganglioside ekspresyonu gelişimsel olarak düzenlenir, dokuya özgüdür ve hücre tipine özgüdür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Şekil 1: Majör beyin gangliyozları ve biyosentetik öncülleri. Yapılar, Glikanlar için Sembol İsimlendirmesi kullanılarak gösterilmiştir11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Gangliosidler, proteinleri kendi zarlarına bağlayarak ve modüle ederek (cis regülasyonu) veya bakteriyel toksinler ve diğer hücrelerdeki lektinler de dahil olmak üzere hücre dışı ortamda glikan bağlayıcı proteinleri devreye sokarak moleküler düzeyde işlev görür (trans tanıma)3. Gangliosidlerin düzenleyici proteinlere spesifik bağlanması ve / veya diğer moleküllerle lipit sallarına kendi kendine bağlanması, sinir sistemi yapısını ve işlevini, kanser progresyonunu, metabolizmayı, inflamasyonu, nöronal proteinopatileri ve bulaşıcı hastalıkları etkileyen hücre davranışında değişikliklere neden olur8. Çeşitli hücresel rolleri nedeniyle, izolasyon ve analiz yöntemleri, fizyolojik ve patolojik süreçlerin düzenlenmesi konusunda gelişmiş bilgiler sağlayabilir. Burada, hızlı küçük ölçekli ekstraksiyon ve analiz için doğrulanmış yöntemler ve gangliosidlerin beyinden preparatif ölçekli izolasyonu sağlanmaktadır. Diğer dokulara uygulama fırsatları ve zorlukları tartışılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı içeren glikozfingolipidlerdir. Tüm omurgalı hücrelerinde ve dokularında bulunurlar, ancak özellikle beyinde bol miktarda bulunurlar. Öncelikle hücrelerin plazma zarlarının dış broşüründe ifade edilen, hücre yüzey proteinlerinin faaliyetlerini lateral ilişki yoluyla modüle eder, hücre-hücre etkileşimlerinde reseptör görevi görür ve patojenler ve toksinler için hedeflerdir. İnsanlarda gangliosid biyosentezinin genetik disregülasyonu ciddi konjenital sinir sistemi bozukluklarına neden olur. Amfipatik doğaları nedeniyle, gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve analizi, keşiflerinden bu yana geçen 80 yıl içinde birçok araştırmacı tarafından optimize edilmiş teknikler gerektirir. Burada, birkaç saat içinde tamamlanabilen dokulardan ve hücrelerden majör gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve ön kalitatif ve kantitatif analizleri için tezgah düzeyinde yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, büyük ganglioside türlerinin beyinden daha büyük ölçekli izolasyonu ve saflaştırılması için yöntemler de açıklıyoruz. Birlikte, bu yöntemler bu biyoaktif molekül sınıfına analitik ve hazırlayıcı ölçek erişimi sağlar.

Bölüm 1'de (küçük ölçekli) açıklanan yöntemler, majör beyin gangliosidlerinin kalitatif ve kantitatif tayini için yeterli miktarda ve saflıkta gangliosidler sağlar. Fare beyninden iyileşme, tarif edildiği gibi hazırlandığında g beyin ıslak ağırlığı (1 nmol / μL) başına ~ 1 μmol gangliosiddir. Bölüm 3 kullanılarak 1 μL'lik (1 nmol) TLC çözünürlüğü, resorsinol tespiti için yeterli materyal sağlar ve Şekil 4'te vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş...

Watch this Scientific Journal Video about Ganglioside Extraction, Purification and Profiling at JoVE.com

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.

Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliosidler tüm omurgalı hücre yüzeylerinde eksprese edilir ve özellikle sinir hücrelerinde bol miktarda bulunur. Hücre sinyalizasyonunu ve hücre-hücre tanımayı düzenlerler. Bu protokol ganglioside izolasyonu ve analizini tanıtmaktadır.Teknikler, saflaştırmayı kolaylaştırırken büyük ve küçük ölçeklerde ganglioside verimini en üst düzeye çıkarmak için seçildi. Ayrıca, kalitatif ve yarı kantitatif gangliosid analizlerini nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirmek için yöntemler de açıklıyoruz. Lipitler, özellikle gangliosidler gibi polar lipitler üzerinde çalışmak, proteinler veya nükleik asitlerle çalışmaktan farklı araçlar ve teknikler gerektirir.Bu video sizi bu moleküllerle nasıl çalışacağınız konusunda bilgilendiriyor. Kloroform ve tetrahidrofuran gibi çözücüler yaygın plastikleri çözdüğü için, bu prosedürler boyunca Teflon kaplı kapaklı cam şişeler ve şişeler, cam pipetler, cam, paslanmaz çelik mikroşırıngalar ve Teflon cam homojenizatörleri kullanıyoruz. Bunun yapılmaması, ürünlerde analizlere müdahale edebilecek plastik polimerlere neden olur.Başlamak için, doku ıslak ağırlığının gramı başına 4.1 mililitre su ekleyin ve 10 vuruşla homojenleştirin. Gram doku başına 13 mililitre metanol ekleyin. 22 santigrat derece ortam sıcaklığına aktarın ve karıştırın.Dokuyu PTFE astarlı vidalı kapaklı kalın duvarlı, cam, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Gram doku başına 6,5 mililitre kloroform ekleyin, kapatın ve iyice karıştırın. 15 dakika boyunca 450 kez g'de santrifüj.Daha sonra şeffaf süpernatantı taze, vidalı kapaklı bir tüpe aktarın ve hacmi geri kazanılan ekstrakt hacmi olarak ölçün. Bölümleme için, berrak süpernatana geri kazanılan ekstrakt su hacminin 0.173 katını ekleyin. Sonra kapağını kapatın.Vorteksi kuvvetlice yapın. 15 dakika boyunca 450 kez g'de santrifüj. Gangliosidleri içeren üst fazı, PTFE astarlı vidalı kapaklı taze, cam bir tüpe aktarın.Ters fazlı kartuş kromatografisi yapmak için, beş mililitrelik bir cam şırınga kullanarak bir tC18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunu üç mililitre metanol ile yıkayın. Daha sonra iki ila 43 ila 55 oranında üç mililitre kloroform-metanol su ekleyin. Önceki adımdaki üst fazı aynı cam şırıngadan tC18 kartuşuna yükleyin.Akış akışını toplayın ve adsorpsiyonu optimize etmek için sütuna yeniden yükleyin. Kartuşu üç mililitre kloroform-metanol su ve ardından üç mililitre metanol su ile yıkayın. Gangliosidleri üç mililitre metanol ile taze, vidalı kapaklı bir tüp haline getirin.45 santigrat dereceden daha düşük veya eşit bir sıcaklıkta yumuşak bir azot akışı altında kuruluğa buharlaştırın. Metanol içinde orijinal doku ıslak ağırlığının gramı başına bir mililitrede çözün. Bir karıştırıcıya 100 gram beyin gri maddesi yerleştirin ve gram başına bir mililitre beyin ıslak ağırlığı, pH 6.8'in soğutulmuş, 10 milimolar potasyum fosfat tamponunu ekleyin.Daha sonra 20 saniye boyunca düşükte homojenize edin. Gram beyin ıslak ağırlığı başına sekiz mililitre tetrahidrofuran ekleyin ve 10 saniye boyunca düşük hızda homojenize edin. Cam santrifüj şişelerine dekant yapın ve 15 dakika boyunca 5.000 kez g'de santrifüj yapın.Süper nantantı toplayın, hacmini ölçün ve ardından bir cam ayırıcı huniye aktarın. Süpernatanın mililitresi başına 0.3 mililitre etil eter ekleyin. Kuvvetlice sallayın.Daha sonra, iki fazın, bir üst eter fazının ve bir alt sulu fazın ayrıldığı 30 dakika boyunca bozulmadan oturmasına izin verin. Gangliosidleri içeren alt fazı, PTFE astarlı kapaklı bir cam şişede toplayın. Ayırma hunisinde kalan üst eter fazına, önceki adımdan mililitre orijinal süpernatant başına 0.1 mililitre su ekleyin.Kuvvetlice sallayın. Aşamaların ayrılmasına izin verin. Daha sonra alt sulu fazı toplayın ve daha önce toplanan alt faz ile birleştirin.Kombine alt fazları kuru bir toza buharlaştırın ve tartın. Ters faz kromatografisi yapmak için, büyük ölçekli bir tC18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunu, yıkama başına bir dakikadan az bir süre vakum veya basınç kullanarak kolondan 50 mililitre çözücü geçirerek önceden yıkayın. Üst fazı, sabunlaşma sonrası faz ayrımından kolona vakum veya basınçla yükleyin.Ardından akışı toplayın, yeniden yükleyin ve sonraki analizler için akışı yeniden toplayın. Kolonu her biri 30 mililitre kloroform-metanol su, ardından metanol su ile yıkayın. Daha sonra gangliosidleri 50 mililitre metanol ile ve daha sonra tekrar 10 mililitre metanol ile süzün.Her yıkama ve elüsyonu ayrı ayrı toplayın. Gangliosidlerin akışta bulunmadığını doğrulamak için ince tabaka kromatografisi veya TLC kullanın ve metanolün ilk elüsyonunda yıkayıp salınımını yapın. Salınımlı gangliosidleri kuru bir toza buharlaştırın ve tartın.TLC'yi gerçekleştirmek için, çalışan çözücüyü, çözücü derinliği 0,5 santimetre olacak şekilde paslanmaz çelik kapaklı 10 x 10 santimetrelik bir cam TLC odasına dökün. Odayı örtün ve yaklaşık 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Metanol kullanarak 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasını eğimli bir iğne ile yıkayın.İğnenin ölü hacmini doldurmak için bir mikrolitre metanolü bir cam şırıngaya ve ardından bir mikrolitre numune veya standart olarak çekin. Şırıngada bir mikrolitreden az metanol çözücü kalana kadar numuneyi beş milimetrelik, önceden işaretlenmiş çizgiler üzerine eşit şekilde yerleştirin. Tüm numuneler tespit edildikten sonra plakanın 22 santigrat derecede kurumasına izin verin.Benekli ve kurutulmuş plakayı, alt kenarı çalışan çözücüye batırılmış olacak şekilde önceden dengelenmiş TLC odasına yerleştirin. Solvent önü plakanın üst kısmından bir santimetre içeri ulaşana kadar çalışan çözücünün kılcal hareketle plakayı yukarı doğru ilerletmesine izin verin. Plakanın kenarındaki çözücü önünü çıkarın ve bir kalemle işaretleyin.Çözücülerin bozulmadan veya hafif hava akışı altında tamamen buharlaşmasına izin verin. Kimyasal bir duman davlumbazında, davlumbazın duvarlarını asit spreyinden korumak için çözülmüş gangliosid kökenli TLC plakasını kesilmiş bir karton kutuya baş aşağı yerleştirin. Resorsinol sprey reaktifini bir cam TLC püskürtücüye yerleştirin.Bir basınçlı azot kaynağına takın ve plakayı dikey ve yatay yönlerde çapraz olarak hafifçe püskürtün. Plakayı hemen aynı boyutlarda temiz, kuru, cam bir kapak plakasıyla örtün ve kapak plakasını bağlayıcı klipslerle yerine sabitleyin. Kapalı plakayı 20 dakika boyunca 125 santigrat derecede ısıtın.Gangliosidler beyaz bir arka plana karşı koyu mor görünecektir. Lipid boyama işlemini gerçekleştirmek için, TLC plakasını, çözülmüş gangliosid orijinli tarafı aşağı doğru olan anisaldehit boyası içeren bir beherin içine batırın. İki saniyeden biraz fazla bir süre boyunca koşu cephesine daldırın.Sonra boşalmasına izin verin. TLC plakasını bir sıcak plaka üzerinde düşük bir sıcaklıkta ısıtmak için ısıtın. Bu protokol, kalitatif ve kantitatif belirleme için yeterli miktarda ve saflıkta gangliosidler sağlar.Bir mikrolitrenin TLC çözünürlüğü, resorsinol tespiti için yeterli malzeme sağlar ve vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fareler için tüm büyük beyin gangliosidlerini çözer. Hazırlanan karışık gangliosidler diğer majör lipitlerden arındırılmış olmamakla birlikte, negatif modda doğal saflaştırılmış gangliosidler olarak veya pozitif modda pre-metilasyondan sonra kütle spektrometrik tayini için yeterli saflığa sahiptirler. Büyük ölçekli saflaştırma, biyolojik deneyler ve daha ileri kimyasal ve enzimatik modifikasyonlar için uygun saflaştırılmış majör beyin gangliosidleri sağlamak için ekstraksiyon, sabunlaştırma ve HPLC çözünürlüğünü içerir.Örnek bir HPLC profili ve ardından gelen TLC analizleri gösterilmiştir. Alkali muamelesi veya sabunlaştırma, kirletici fosfolipitleri hidrolize etmek ve uzaklaştırmak için gereklidir, ancak aynı zamanda bazı bağlamlarda önemli olabilecek O-asetillenmiş sialik asitler gibi gangliosidlerin doğal modifikasyonlarını hidrolize edecektir. Ekstraksiyon, solvent bölümleme ve TLC çözünürlüğü için doğru çözücü oranları, geri kazanımı, saflığı ve analizleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.Kanserden metabolizmaya ve beyin fonksiyonuna kadar, gangliosidler fizyolojik değiştiriciler ve terapötik hedeflerdir. Ganglioside izolasyonu, saflaştırma ve analizler, biyomedikal keşif ve terapötik gelişim için temel taşlardır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis

Ayıklama ve Tayvanlı yeşil Propolis Analizi

Taiwanese green propolis is rich in prenylated flavonoids and exhibits a broad range of biological activities, such as antioxidant, antibacterial, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...