Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 871124 Laserlab-Europe ، من قبل وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) ، ومن قبل Ente Cassa di Risparmio di Firenze. تم دعم A.V. Kashchuk من قبل زمالة متعددة التخصصات لبرنامج علوم الحدود البشرية LT008 / 2020-C.

1. الإعداد البصري
ملاحظة: يتكون الإعداد التجريبي من ملاقط بصرية مزدوجة مع ثبات تأشير نانومتر وتقلبات شدة ليزر < 1٪. في ظل هذه الظروف ، يتم ضمان استقرار الدمبل على مستوى النانومتر تحت صلابة المصيدة النموذجية (0.1 pN / nm) والتوتر (1 pN - بضع عشرات من pN). يوضح الشكل 2 مخططا ...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

على الرغم من أن تقنيات الجزيء الواحد ، مثل الفحص ثلاثي الخرز ، تمثل تحديا تقنيا وإنتاجية منخفضة ، إلا أن UFFCS يحسن اكتشاف التفاعلات الجزيئية بفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للبيانات. يسمح UFFCS بدراسة الاعتماد على الحمل للبروتينات الحركية ، مع المزايا الرئيسية لتطبيق القوة بسرعة كبيرة ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

في العقود الأخيرة ، كانت الملقط البصري أداة قيمة لتوضيح الكيمياء الميكانيكية لتفاعلات البروتين على مستوى الجزيء الواحد ، نظرا للإمكانية المذهلة للتلاعب المتزامن وقياس التغيرات التوافقية والحركية الأنزيمية 1,2. على وجه الخصوص ، فإن القدرة على تطبيق وقياس القوى في نطاق تلك التي تمارسها المحركات الجزيئية في الخلية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على قياس التغيرات التوافقية دون النانومتر ، جعلت الملقط البصري أداة فريدة من نوعها أحادية الجزيء لكشف الخواص الميكانيكية الكيميائية للبروتينات الحركية وتنظيمها الميكانيكي.
التحليل الطيفي فائق السرعة (UFFCS) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء تعتمد على ملاقط بصرية ، تم تطويرها لدراسة الحركية السريعة للمحركات الجزيئية تحت الحمل في هندسة ثلاثية الخرز (الشكل 1 أ) 3,4. يقلل UFFCS من الفارق الزمني لتطبيق القوة على البروتين الحركي إلى الحد المادي للملاقط الضوئية ، أي وقت الاسترخاء الميكانيكي للنظام ، مما يسمح بتطبيق القوة بسرعة بعد بداية تشغيل الميوسين (بضع عشرات من الميكروثانية)3. تم استغلال هذه القدرة للتحقيق في الأحداث الميكانيكية المبكرة في الميوسين العضلي الهيكلي السريع 3 والقلب5 للكشف عن الاعتماد على الحمل لضربة القوة ، وحالات الربط الضعيفة والقوية ، بالإضافة إلى ترتيب الأحداث البيوكيميائية (Pi) والميكانيكية (powerstroke).
عادة ما يتم استخدام هندسة الخرز الثلاثة لدراسة المحركات غير المعالجة ، وقد تم استخدام هندسة حبة واحدة مع مشبك قوة بشكل شائع للتحقيق في الميوسين غير التقليدي مثل الميوسين Va6. ومع ذلك ، هناك عدة أسباب لتفضيل مقايسة UFFCS ثلاثية الخرزات أيضا للميوسينات العملية. أولا ، يسمح التطبيق السريع للحمل مباشرة بعد ربط الأكتين-الميوسين بقياس الأحداث المبكرة في تطور القوة كما هو الحال في المحركات غير المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة المحركات المعالجة ، فإنه يسمح أيضا بقياس دقيق لأطوال تشغيل المحرك وفترات التشغيل تحت قوة ثابتة طوال تقدمها (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، نظرا لارتفاع معدل ردود الفعل للقوة ، يمكن للنظام الحفاظ على ثبات القوة أثناء التغييرات السريعة في الموضع ، مثل شوط عمل الميوسين ، وبالتالي ضمان حمل ثابت أثناء خطوة المحرك. تسمح الدقة الزمنية العالية للنظام باكتشاف التفاعلات الفرعية ، مما يفتح إمكانية التحقيق في الارتباط الضعيف للميوسين بالأكتين. أخيرا ، تضمن هندسة الفحص تطبيق القوة على طول خيوط الأكتين ، مع مكونات عرضية ورأسية لا تذكر للقوة. هذه النقطة ذات أهمية خاصة حيث ثبت أن مكون القوة الرأسية يؤثر بشكل كبير على اعتماد الحمل لحركية المحرك 7,8. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا تطبيق مجموعة من الأحمال المساعدة والمقاومة على الميوسين 5B المعالج وقياس اعتماد الحمل لعمليته مباشرة لمجموعة واسعة من القوى4.
كما هو موضح في الشكل 1 أ ، في هذا النظام ، يتم تعليق خيوط أكتين واحدة بين حبتين من البوليسترين محبوستين في بؤرة ملاقط بصرية مزدوجة ("الدمبل"). يتم فرض قوة صافية غير متوازنة F = F1-F 2 على الفتيل ، من خلال نظام تغذية مرتدة سريعة ، مما يجعل الفتيل يتحرك بسرعة ثابتة في اتجاه واحد حتى يصل إلى نقطة انعكاس يحددها المستخدم حيث يتم عكس القوة الكلية في الاتجاه المعاكس. عندما لا يتفاعل البروتين الحركي مع الفتيل ، يكون الدمبل حرا في التحرك ذهابا وإيابا في شكل موجة مثلثة (الشكل 1 ب ، اللوحة السفلية) تمتد على حبة القاعدة التي يرتبط بها بروتين محرك واحد. بمجرد إنشاء التفاعل ، يتم نقل القوة التي يحملها الدمبل بسرعة كبيرة إلى البروتين الحركي ويبدأ المحرك في إزاحة الفتيل عن طريق الدوس تحت شدة القوة والاتجاه الذي تم تطبيقه بواسطة نظام التغذية المرتدة في وقت التفاعل ، حتى ينفصل الميوسين عن الأكتين. نظرا لأن الإزاحة الناتجة عن خطوة المحرك تعتمد على قطبية خيوط الأكتين المحاصرة ، وفقا لاتجاه القوة المطبقة ، يمكن أن يكون الحمل إما مساعدا ، أي الدفع في نفس اتجاه إزاحة المحرك (الدفع في اللوحة العلوية الشكل 1 ب) ، أو مقاوما ، أي السحب في الاتجاه المعاكس فيما يتعلق بإزاحة المحرك (السحب في الشكل 1 ب اللوحة العلوية) مما يجعل من الممكن دراسة التنظيم الكيميائي الميكانيكي للعملية الحركية من خلال كل من شدة واتجاه الحمل المطبق.
في الأقسام التالية ، يتم وصف جميع الخطوات لقياس تفاعلات الأكتين-ميوسين-5B تحت أحمال مختلفة مع إعداد التحليل الطيفي فائق السرعة لمشبك القوة بشكل كامل ، بما في ذلك 1) إعداد الإعداد البصري ، ومحاذاة الفخاخ البصرية وإجراءات المعايرة ، 2) الاستعدادات لجميع المكونات وتجميعها في غرفة العينة ، 3) إجراء القياس ، 4) البيانات التمثيلية وتحليل البيانات لاستخراج المعلمات الفيزيائية الهامة ، مثل طول التشغيل وحجم الخطوة وسرعة البروتين الحركي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

التحليل الطيفي فائق السرعة بمشبك القوة (UFFCS) هو تقنية جزيء واحد تعتمد على ملاقط الليزر التي تسمح بالتحقيق في الميكانيكا الكيميائية لكل من الميوسين التقليدي وغير التقليدي تحت الحمل بدقة زمنية غير مسبوقة. على وجه الخصوص ، أظهرت إمكانية فحص محركات الميوسين تحت قوة ثابتة مباشرة بعد تكوين رابطة الأكتين والميوسين ، جنبا إلى جنب مع المعدل المرتفع لردود الفعل للقوة (200 كيلو هرتز) ، أن UFFCS أداة قيمة لدراسة الاعتماد على الحمل للديناميكيات السريعة مثل شوط عمل الميوسين. علاوة على ذلك ، يتيح UFFCS دراسة كيفية تأثر تفاعلات الميوسين والأكتين الإجرائية وغير العملية بكثافة واتجاه القوة المطبقة.
باتباع هذا البروتوكول ، سيكون من الممكن إجراء تجارب فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة وعلى مجموعة متنوعة من الميوسينات غير التقليدية. من خلال بعض التعديلات ، يمكن أيضا توسيع البروتوكول بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات المعالجة مثل kinesins و dyneins. يتضمن البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات وإجراءات المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها.

تتكون البيانات التمثيلية في سجلات الموقف بمرور الوقت كما هو موضح في الشكل 4. في سجل الموقف ، يمكن رؤية نوعين من الإزاحة. أولا ، عندما لا يتفاعل محرك الميوسين مع خيوط الأكتين ، تتحرك الحبيبات المحبوسة بسرعة ثابتة مقابل قوة السحب اللزجة للمحلول مما يدل على إزاحة خطية تتأرجح د?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.

تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

التحليل الطيفي فائق السرعة بمشبك القوة هو تقنية جزيء واحد تعتمد على ملاقط الليزر التي تجعل من الممكن التحقيق في الميكانيكا الكيميائية لمحركات الميوسين تحت الحمل بأعلى دقة زمنية. تسمح هذه التقنية بفحص الأحداث السريعة جدا في إنتاج القوة من خلال الحفاظ على ثبات القوة خلال كل مرحلة من مراحل التفاعل الحركي مع التحكم الكامل في اتجاه القوة. من خلال إجراء التعديلات المناسبة ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهولة على أنواع أخرى من المحركات المعالجة ، بما في ذلك kinesins و dyneins ، للكشف عن التنظيم بالقوة.بعد تركيب مجموعة واحدة من العاكسات الصوتية البصرية على مترجم خطي ، خذ قزحية واضبط فتحتها لتناسب حجم الفتحة الخلفية المستهدفة. استبدل الهدف بالقزحية المتمركزة على السكن الموضوعي الملولب. حرك المترجم باتجاه شعاع الليزر حتى يصبح جزء الحزمة المسدود بواسطة بلورة بيزو مرئيا بعد القزحية ، وأدر المترجم للخلف قليلا حتى يملأ الشعاع فتحة القزحية تماما.لإعداد حبات السيليكا في خلات بنتيل ، تمييع أولا 20 ميكرولتر من حبات السيليكا الصلبة 1.2 ميكرون 10 ٪ في 1-1.5 ملليلتر من الأسيتون مع دوامة و 30 ثانية من صوتنة. بعد صوتنة ، اجمع الخرز عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق حبيبات الخرزة في 1 ملليلتر من الأسيتون الطازج لغسل ثان. بعد غسل الأسيتون الثاني ، اغسل الخرز ثلاث مرات في 1 ملليلتر من أسيتات البنتيل الطازجة لكل غسلة في ظل نفس ظروف الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من 1٪ من النيتروسليلوز و 900 ميكرولتر من أسيتات البنتيل.بعد ذلك ، استخدم قطعة نقية مبللة بالإيثانول من أنسجة المختبر لمسح غطاء زجاجي مقاس 24 × 24 ملم بعناية قبل استخدام ملاقط نظيفة لشطف الزجاج مباشرة في الإيثانول والسماح لغطاء الغطاء بالجفاف تحت تدفق النيتروجين اللطيف. دوامة وصوتيك مخزون حبة السيليكا المحضرة لمدة 30 ثانية واستخدم غطاء 24 × 60 ملم منظف بالإيثانول لتشويه 2 ميكرولتر من محلول حبة السيليكا على سطح غطاء أصغر. أثناء تجفيف الخرز ، قم بتنظيف شريحة مقاس 26 × 76 ملم كما هو موضح ، وضع خطين بسمك 60-100 ميكرون من 3 ملم على الوجهين مسجلين على الحواف الطويلة للشريحة.باستخدام ملاقط نظيفة ، ضع الغطاء المطلي بالخرز على الشريط بحيث تواجه الخرز داخل حجرة الشريحة ، واملأ الحجرة بمحلول فوسفات 15 مليمولار ومحلول حبة البوليسترين العائم. ثم أغلق الغرفة بشحم السيليكون. لمعايرة نسبة البكسل إلى النانومتر لكاميرا برايت فيلد ، احصل على صورة أولى لحبة السيليكا على سطح الغطاء على بعد حوالي 5 ميكرون من مركز مجال الرؤية.حرك المسرح لإزاحة الخرزة 10 ميكرون باتجاه مركز مجال الرؤية والتقط صورة ثانية. احسب ثابت معايرة الكاميرا عن طريق قياس مسافة البكسل بين موضعين للخرزة. لمعايرة موضع المصيدة ، قم بحبس جسيم عائم واحد في مصيدة واحدة وحرك العاكسات الصوتية البصرية في خطوات 0.2 ميغا هرتز ، والحصول على صورة للجسيم والتردد المقابل للعاكسات لكل خطوة.ثم كرر معايرة المصيدة الثانية بنفس الطريقة. لمعايرة قوة المصيدة وصلابتها ، قم بحبس جسيم واحد في كل مصيدة وإزاحة كلا المصيدتين باستخدام العاكسات الصوتية البصرية في خطوات 0.2 ميغا هرتز ، مع تسجيل حركة براونية للجسيم في كلا المصيدتين باستخدام كاشفات الثنائي الضوئي الرباعية والتردد المقابل للعاكسات الصوتية البصرية. احصل على ثوابت المعايرة عن طريق تركيب دالة لورنتزيان على طيف طاقة للحركة البراونية المسجلة.لتجميع عينة للقياس ، أضف 1 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA البيوتينيل إلى غرفة جديدة بها حبات السيليكا على سطح الغطاء. بعد 5 دقائق ، اغسل الغرفة باستخدام AB buffer وأضف 1 ملليغرام لكل ملليلتر من الستربتافيدين إلى الغرفة. بعد 5 دقائق ، اغسل الحجرة كما هو موضح ، وأضف 3 بيوتينيل نانومولار بيوتينيل ميوسين-5B ثقيل ميروميوسين في مخزن M5B مكمل ب 2 ميكرومولار كالمودولين.بعد 5 دقائق ، اغسل الحجرة ثلاث مرات ب 1 ملليغرام لكل ملليلتر من BSA البيوتينيل المكمل ب 2 ميكرومولار كالمودولين في AB buffer وانتظر 3 دقائق بعد الغسيل النهائي. تدفق خليط التفاعل وختم الغرفة مع الشحوم السيليكون. لقياس العينة ، ضع الحجرة على مرحلة المجهر وحرك الهدف حتى يتم التركيز على حبات ألفا أكتينين العائمة.قم بتشغيل فخ واحد وفخ حبة واحدة. بمجرد شغل المصيدة الأولى ، حرك المترجم لوضع الخرزة المحاصرة بالقرب من سطح الغطاء لتجنب محاصرة حبات متعددة ، وحبس حبة في المصيدة الثانية. قم بإزاحة العينة من خلال المترجمين بعيدي المدى لتحديد خيوط الأكتين التي لا يقل طولها عن 5 ميكرون داخل المحلول.عند رصد خيط ، حرك العينة للسماح لحبة محاصرة بالاقتراب من أحد طرفي الفتيل. بمجرد توصيل الفتيل ، اضبط مسافة الخرزة على طول الفتيل التقريبي وحرك المرحلة لإنشاء تدفق في اتجاه الخرزة غير المرتبطة. سوف يتمدد الفتيل بفعل التدفق ويرتبط في النهاية بالخرزة الثانية.يسمى المجمع الناتج الدمبل"لإنشاء اتصال الأكتين والميوسين ، افصل الفخين برفق واضبط الفتيل على مستويات التظاهر حتى حوالي 3 بيكونوتون. للتحقق من صلابة الدمبل ، اجعل مصيدة واحدة تتأرجح في موجة مثلثة عن طريق تغيير تردد عاكس صوتي بصري واحد والتحقق من انتقال الحركة إلى الخرزة الخلفية من خلال إشارة موضعها. حرك المسرح لوضع الدمبل بالقرب من حبة السيليكا ذات القاعدة واضبط ارتفاع الدمبل بحيث يتلامس خيوط الأكتين مع سطح حبة السيليكا.كما لوحظ في سجل الموضع التمثيلي هذا، عندما لا يتفاعل محرك الميوسين مع خيط الأكتين، تتحرك الحبيبات المحبوسة بسرعة ثابتة عكس قوة السحب اللزجة للمحلول. بمجرد أن يبدأ محرك الميوسين في التفاعل مع الفتيلة، تنتقل القوة التي تحملها الخيوط المتحركة بسرعة كبيرة إلى البروتين، وتنخفض سرعة النظام إلى الصفر، مع حدوث أحداث التدرج تحت تأثير ثابت حتى نهاية المدى. يتم تبديل القوة من الاتجاه الإيجابي إلى الاتجاه السلبي بواسطة نظام التغذية المرتدة ، والذي يغير اتجاه القوة عندما تصل الخرزة إلى حافة نطاق التذبذب الذي حدده المستخدم.عندما يرتبط الميوسين بخيط الخيط ويزيحه في اتجاه الاتجاه الموجب، فإنه يدفع الخرزة نحو الحافة العلوية لنطاق الاهتزاز. إذا حدث هذا تحت تأثير القوة المساعدة، فسيتوقف مسار الميوسين بسبب انعكاس اتجاه القوة عند حافة الاهتزاز، مما يحد من طول المدى إلى سعة تذبذب الدمبل. تعد المحاذاة الدقيقة للنظام البصري ضرورية لتحقيق الدقة المكانية والزمانية المثلى ، في حين أن المعايرة الدقيقة ضرورية لتحديد قيم القوى المطبقة بدقة.تم تكييف هذه التقنية لدراسة البحث المنزلق والمستهدف لعوامل النسخ في الحمض النووي بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين بروتينات النقل الميكانيكي التي يتم تحريضها على خيوط الأنابيب الدقيقة.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

تشريح والتسجيل من مفرق العضلية جيم ايليجانس

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

تشريح الدماغ البشري غير الرئيسيات في الفضاء التجسيمي

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

عبارة في الدماغ : تشريح العين الرئيسيات

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

استكشاف الوظائف المعرفية لدى الأطفال والرضع والكبار مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء القريبة

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

تحفيز الصور بواسطة ليزر Femtosecond ينشط إشارات الكيناز (ERK) أو أحداث الميتوكوندريا في الخلايا المستهدفة

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

الكشف عن تجميع البروتين باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...