Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
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这项工作得到了欧盟Horizon 2020研究和创新计划的支持，该计划根据Laserlab-Europe 871124号资助协议，意大利大学和研究部（FIRB“Ricerca的未来”2013年资助号RBFR13V4M2）和Ente Cassa di Risparmio di Firenze支持。A.V. Kashchuk 得到了人类前沿科学计划跨学科奖学金 LT008/2020-C 的支持。

1. 光学设置
注意：实验装置由具有纳米指向稳定性和<1%激光强度波动的双光镊组成。在这些条件下，哑铃在典型的陷阱刚度（0.1 pN/nm）和张力（1 pN - 几十 pN）下保证了纳米级的稳定性。 图2 显示了光学设置的详细方案。
<ol><li>光镊设计与施工 9、10、11.<ol><li>根据 图...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

尽管单分子技术（例如三珠测定）在技术上具有挑战性且通量低，但由于数据的高信噪比，UFFCS提高了分子相互作用的检测。UFFCS允许研究运动蛋白的负载依赖性，其主要优点是在马达与灯丝结合时非常迅速地施加力，以探测力产生的早期和非常快速的事件以及在受控力下的弱结合状态;在整个运行过程中保持力恒定，并通过完全控制力方向性来探测电机依赖性。关于最后一点，我们在这里使用的?...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

在过去的几十年中，由于同时操纵和测量构象变化和酶动力学的可能性，光学镊子一直是阐明单分子水平蛋白质相互作用的机械化学的宝贵工具1，2。特别是，在细胞中分子马达施加的力范围内施加和测量力的能力，以及测量亚纳米构象变化的能力，使光镊成为一种独特的单分子工具，用于揭示运动蛋白的化学力学特性及其机械调节。
超快力钳谱 （UFFCS） 是一种基于光镊的单分子力谱技术，旨在研究三珠几何形状中分子电机在负载下的快速动力学（图 1a）3，4。UFFCS将施加到运动蛋白的力的时间滞后减少到光镊的物理极限，即系统的机械松弛时间，从而允许在肌球蛋白运行开始后快速施加力（几十微秒）3。这种能力已被用于研究快速骨骼 3 和心脏5 肌肉肌球蛋白的早期机械事件，以揭示动力冲程的负荷依赖性，弱结合状态和强结合状态，以及生化（Pi）和机械（动力冲程）事件的顺序。
三磁珠几何形状通常用于研究非加工性电机，具有力夹的单磁珠几何形状通常用于研究加工性非常规肌球蛋白，例如肌球蛋白Va6。然而，有几个原因也倾向于三珠UFFCS测定，用于治疗性肌球蛋白。首先，在肌动蛋白-肌球蛋白结合后立即快速施加负载，可以测量力发展的早期事件，就像在非过程性电机中一样。此外，对于加工型电机，它还允许在整个过程中精确测量电机在恒定力下的运行长度和运行持续时间（图 1b）。此外，由于力反馈率高，系统可以在快速改变位置时保持力恒定，例如肌球蛋白工作行程，从而保证电机步进期间的恒定负载。该系统的高时间分辨率允许检测亚毫秒相互作用，为研究肌球蛋白与肌动蛋白的弱结合提供了可能性。最后，测定几何形状保证力沿肌动蛋白丝施加，力的横向和垂直分量可以忽略不计。这一点特别重要，因为垂直力分量已被证明显着影响电机动力学的负载依赖性7，8。通过使用这种技术，我们可以对合成肌球蛋白-5B施加一系列辅助和电阻载荷，并直接测量其合成能力对宽范围力的负载依赖性4。
如图1a所示，在该系统中，单个肌动蛋白丝悬浮在捕获在双光镊聚焦中的两个聚苯乙烯珠（“哑铃”）之间。不平衡的净力F = F1-F 2通过快速反馈系统施加在灯丝上，该系统使灯丝在一个方向上以恒定的速度移动，直到到达用户定义的反转点，其中净力在相反方向上反转。当运动蛋白不与灯丝相互作用时，哑铃可以自由地以三角波形状（图1b，底图）来回移动，横跨附着单个运动蛋白的基座珠。一旦建立了相互作用，哑铃携带的力就会非常迅速地传递到运动蛋白上，并且马达开始在相互作用时反馈系统施加的力强度和方向下步进来取代细丝，直到肌球蛋白与肌动蛋白分离。由于电机步进产生的位移取决于被捕获的肌动蛋白丝的极性，根据施加力的方向，负载可以是辅助的，即沿电机位移的同一方向推动（图1b上图中的推动），也可以是电阻性的，即相对于电机位移以相反的方向拉动（图1b中的拉力） 上图），从而可以通过施加负载的强度和方向性来研究运动合成力的化学力学调节。
在接下来的部分中，将全面描述使用超快力钳谱设置在不同负载下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括 1） 光学设置的设置、光学陷阱对准和校准程序，2） 所有组件的制备及其在样品室中的组装，3） 测量程序， 4）代表性数据和数据分析，提取重要的物理参数，如运行长度、步长和运动蛋白的速度。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

超快力钳谱（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，可以以前所未有的时间分辨率研究传统和非常规肌球蛋白在负载下的化学力学。特别是，在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力下探测肌球蛋白马达的可能性，以及高速率的力反馈（200 kHz），表明UFFCS是研究快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的负载依赖性的宝贵工具。此外，UFFCS能够研究过程和非过程性肌球蛋白 - 肌动蛋白相互作用如何受到施加力的强度和方向的影响。
通过遵循该协议，将有可能在合成性肌球蛋白-5电机和各种非常规肌球蛋白上进行超快力钳实验。通过一些调整，该协议也可以很容易地扩展到其他类别的合成电机的研究，如驱动蛋白和动力蛋白。该协议包括所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，校准程序，数据采集和分析。

代表性数据包含在一段时间内的位置记录中，如图 4 所示。在位置记录中可以看到两种位移。首先，当肌球蛋白马达不与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的珠子在溶液的粘性拖曳力下以恒定速度移动，显示线性位移在三角波3 中操作员设置的振荡范围内振荡（由于时间刻度较长，在图 4 中不可见）。其次，一旦肌球蛋白马...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

这里介绍的是在合成肌球蛋白-5电机上进行超快力钳实验的综合协议，可以很容易地扩展到其他类别的加工电机的研究。该协议详细说明了所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，数据采集和分析。

超快力钳谱分析合成性肌球蛋白的机械酶学特性

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

超快力钳谱是一种基于激光镊子的单分子技术，可以以最高的时间分辨率研究肌球蛋白马达在负载下的化学力学。该技术允许通过在电机相互作用的每个阶段保持力恒定并完全控制力方向性来探测力产生中的非常快速的事件。通过进行适当的调整，该协议可以很容易地应用于其他类型的过程性电机，包括驱动蛋白和动力蛋白，以发现强制调节。将一组声光偏转器安装到线性转换器上后，取一个光圈并调整其孔径以适合物镜后孔径大小。将物镜更换为以螺纹物镜外壳为中心的光圈。将转换器移向激光束，直到在虹膜之后可以看到被压电晶体阻挡的光束部分，并将转换器稍微向后转动，直到光束完全充满虹膜孔径。为了在乙酸戊酯中制备硅胶珠，首先在1-1.5毫升丙酮中稀释20微升1.2微米10%固体硅胶珠，涡旋和30秒超声处理。超声处理后，通过离心收集珠子，并将珠子沉淀重悬于1毫升新鲜丙酮中以进行第二次洗涤。第二次丙酮洗涤后，在相同的离心条件下，每次洗涤1毫升新鲜乙酸戊酯洗涤珠子三次，并将沉淀重悬于100微升1%硝酸纤维素和900微升乙酸戊酯中。接下来，使用纯乙醇浸泡的实验室组织仔细擦拭 24 x 24 毫米玻璃盖玻片，然后使用干净的镊子直接在乙醇中冲洗玻璃，让盖玻片在温和的氮气流下干燥。涡旋并超声处理准备好的硅胶珠原料 30 秒，并使用乙醇清洁的 24 x 60 毫米盖玻片将 2 微升硅胶珠溶液涂抹到较小的盖玻片表面上。当珠子干燥时，如图所示清洁26 x 76毫米的载玻片，并将两条60-100微米厚的3毫米双面线贴在载玻片的长边缘上。使用干净的镊子，将珠子涂层的盖玻片放在胶带上，珠子朝向载玻片室的内部，并用 15 毫摩尔磷酸盐缓冲液和浮动聚苯乙烯珠溶液填充腔室。然后，用硅脂密封腔室。为了校准明场相机的像素纳米比，请在距离视场中心约5微米的盖玻片表面上获取硅胶珠的第一张图像。移动载物台，将珠子向视场中心移动 10 微米，然后拍摄第二张图像。通过测量磁珠两个位置之间的像素距离来计算相机校准常数。要校准陷阱位置，将单个浮动粒子捕获在一个陷阱中，并以0.2兆赫兹的步长移动声光偏转器，获取粒子的图像和每个步骤的相应偏转器频率。然后，以相同的方式重复第二个疏水阀的校准。为了校准陷阱功率和刚度，在每个陷阱中捕获单个粒子，并使用声光偏转器以0.2兆赫的步长置换两个陷阱，使用象限光电二极管检测器和声光偏转器的相应频率记录两个陷阱中粒子的布朗运动。通过将洛伦兹函数拟合到记录的布朗运动的功率谱来获得校准常数。要组装样品进行测量，请将每毫升生物素化BSA加入1毫克到盖玻片表面上带有二氧化硅珠的新腔室中。5分钟后，用AB缓冲液清洗腔室，并向腔室中加入每毫升链霉亲和素1毫克。5分钟后，如图所示洗涤腔室，并在补充有2微摩尔钙调蛋白的M5B缓冲液中加入3纳摩尔生物素化的肌球蛋白-5B重甲木松素。5分钟后，用每毫升1毫克生物素化BSA在AB缓冲液中补充2微摩尔钙调蛋白洗涤腔室三次，并在最后一次洗涤后等待3分钟。流动反应混合物并用硅脂密封腔室。要测量样品，请将腔室放在显微镜载物台上并移动物镜，直到浮动的α-肌动蛋白珠聚焦。打开一个陷阱并捕获一个珠子。一旦第一个陷阱被占用，移动转换器将捕获的珠子放置在靠近盖玻片表面的位置，以避免捕获多个珠子，并将一个珠子困在第二个陷阱中。通过长距离翻译器置换样品，以在溶液中定位长度至少为5微米的肌动蛋白丝。当发现细丝时，移动样品以使被捕获的珠子接近灯丝的一端。连接灯丝后，将珠子的距离调整到近似的灯丝长度，并移动载物台以在未绑定的珠子方向上产生流动。细丝将被流动拉伸并最终与第二个珠子结合。由此产生的复合物称为哑铃“为了建立肌动蛋白 - 肌球蛋白接触，轻轻地分离两个陷阱并将灯丝设置为预张力水平至约3皮孔。为了探测哑铃的刚度，通过改变一个声光偏转器的频率并验证运动随后通过其位置信号传输到尾部珠子，使一个陷阱在三角波中振荡。移动载物台以将哑铃放置在基座二氧化硅珠附近，并调整哑铃的高度，使肌动蛋白丝与二氧化硅珠表面接触。如该代表性位置记录所观察到的，当肌球蛋白马达不与肌动蛋白丝相互作用时，被捕获的珠子在溶液的粘性拖曳力下以恒定的速度移动。一旦肌球蛋白马达开始与细丝相互作用，移动细丝携带的力就会非常迅速地传递到蛋白质上，系统速度下降到零，步进事件在恒定的力下发生，直到运行结束。反馈系统将力从正方向切换到负方向，当磁珠到达用户设置的振荡范围的边缘时，反馈系统会切换力方向。当肌球蛋白结合并将细丝向正方向位移时，它将磁珠推向振荡范围的上边缘。如果在辅助力下发生这种情况，肌球蛋白的运行将被振荡边缘处的力方向反转中断，从而将运行长度限制在哑铃振荡的幅度内。光学系统的精确对准对于实现最佳空间和时间分辨率是必要的，而精确的校准对于精确确定施加力的值是必要的。该技术已被应用于研究DNA中转录因子的滑动和靶向搜索以及诱导微管细丝上的机械转导蛋白之间的动态相互作用。

Research

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评估外胚层上皮细胞在颅面发育的信号属性

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

对大鼠的过程<em在原位</em骨骼肌收缩性能

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

结合单分子操纵和成像蛋白-DNA相互作用的研究

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

飞秒激光的光刺激激活目标细胞中的细胞外信号调节激酶(ERK)信号或线粒体事件

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

使用磁悬浮定量细胞密度和抗原特性

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...