Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 871124 Laserlab-Europe, af det italienske universitets- og forskningsministerium (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013-bevilling nr. RBFR13V4M2) og af Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk blev støttet af Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Optisk opsætning
BEMÆRK: Den eksperimentelle opsætning består af dobbelt optisk pincet med nanometerpegestabilitet og < 1% laserintensitetsudsving. Under disse forhold garanteres håndvægtens stabilitet på nanometerniveau under typisk fældestivhed (0,1 pN/nm) og spænding (1 pN - få titalls pN). Figur 2 viser et detaljeret skema over den optiske opsætning.
<ol><li>Optisk pincet design og konstruktion 9,10,11.<sup cl...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Selvom enkeltmolekyleteknikker, såsom treperleassayet, er teknisk udfordrende og lav gennemstrømning, forbedrer UFFCS detektionen af molekylære interaktioner takket være dataenes høje signal-støj-forhold. UFFCS tillader undersøgelse af belastningsafhængigheden af motorproteiner med de vigtigste fordele ved at anvende kraften meget hurtigt ved binding af motoren til glødetråden for at undersøge tidlige og meget hurtige begivenheder i kraftproduktion og svage bindingstilstande under kontrolleret kraft; Oprethold...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

I de sidste årtier har optiske pincetter været et værdifuldt værktøj til at belyse mekanokemien af proteininteraktioner på enkeltmolekyleniveau på grund af den slående mulighed for samtidig manipulation og måling af konformationsændringer og enzymatisk kinetik 1,2. Især evnen til at anvende og måle kræfter inden for dem, der udøves af molekylære motorer i cellen, sammen med evnen til at måle subnanometer konformationelle ændringer, gjorde optiske pincetter til et unikt enkeltmolekyleværktøj til at optrævle de kemomekaniske egenskaber af motorproteiner og deres mekaniske regulering.
Ultrafast force-clamp spektroscopy (UFFCS) er en enkeltmolekyle kraftspektroskopiteknik baseret på optisk pincet, udviklet til at studere den hurtige kinetik af molekylære motorer under belastning i en tre-perlegeometri (figur 1a)3,4. UFFCS reducerer tidsforsinkelsen for kraftpåføring på motorproteinet til den fysiske grænse for optisk pincet, dvs. systemets mekaniske afslapningstid, hvilket muliggør påføring af kraften hurtigt efter begyndelsen af en myosinkørsel (få titalls mikrosekunder)3. Denne evne er blevet udnyttet til at undersøge de tidlige mekaniske hændelser i hurtig skelet 3 og hjerte5 muskelmyosin for at afsløre belastningsafhængigheden af kraftslaget, de svage og stærke bindingstilstande samt rækkefølgen af biokemiske (Pi) og mekaniske (powerstroke) begivenheder.
Tre-perlegeometrien anvendes normalt til at studere ikke-processive motorer, en enkelt perlegeometri med en kraftklemme er blevet almindeligt anvendt til at undersøge processive ikke-konventionelle myosiner såsom myosin Va6. Der er dog flere grunde til at foretrække et tre-perle UFFCS-assay også for processive myosiner. For det første tillader den hurtige påføring af belastning lige efter actin-myosinbinding måling af de tidlige begivenheder i kraftudvikling som i ikke-processive motorer. Derudover giver det i tilfælde af procesmotorer også mulighed for en nøjagtig måling af motorens driftslængder og driftsvarighed under konstant kraft gennem hele deres progression (figur 1b). På grund af den høje hastighed af kraftfeedbacken kan systemet desuden opretholde kraftkonstanten under hurtige positionsændringer, såsom myosinarbejdsslaget, hvilket garanterer en konstant belastning under motortrin. Systemets høje tidsmæssige opløsning tillader påvisning af sub-ms-interaktioner, hvilket åbner muligheden for at undersøge svag binding af myosin til actin. Endelig garanterer analysegeometrien, at kraften påføres langs actinfilamentet med ubetydelige tværgående og lodrette komponenter af kraften. Dette punkt er af særlig relevans, da den vertikale kraftkomponent har vist sig at påvirke belastningsafhængigheden af motorens kinetikbetydeligt 7,8. Ved at bruge denne teknik kunne vi anvende en række assisterende og resistive belastninger til processiv myosin-5B og direkte måle belastningsafhængigheden af dens processivitet for en lang række kræfter4.
Som vist i figur 1a er der i dette system ophængt en enkelt actinglødetråd mellem to polystyrenperler, der er fanget i fokus på dobbelt optisk pincet ("håndvægten"). Glødetråden pålægges en ubalanceret nettokraft F= F 1-F2 gennem et hurtigt feedbacksystem, som får glødetråden til at bevæge sig med konstant hastighed i én retning, indtil den når et brugerdefineret inversionspunkt, hvor nettokraften vendes i modsat retning. Når motorproteinet ikke interagerer med glødetråden, er håndvægten fri til at bevæge sig frem og tilbage i en trekantet bølgeform (figur 1b, bundpanel), der spænder over piedestalperlen, hvorpå et enkelt motorprotein er fastgjort. Når interaktionen er etableret, overføres kraften, der bæres af håndvægten, meget hurtigt til motorproteinet, og motoren begynder at forskyde glødetråden ved at træde under den kraftintensitet og retning, der blev anvendt af feedbacksystemet på tidspunktet for interaktionen, indtil myosin løsner sig fra actin. Da belastningen er den forskydning, der frembringes ved motorens trin, afhængig af polariteten af det fangede actinfilament, kan belastningen i henhold til retningen af den påførte kraft enten være hjælpende, dvs. skubbe i samme retning af motorforskydningen (skub i figur 1b øverste panel) eller resistiv, dvs. trække i modsat retning i forhold til motorforskydningen (træk i figur 1b øverste panel), hvilket gør det muligt at studere den kemomekaniske regulering af motorprocessiviteten ved både intensiteten og retningen af den påførte belastning.
I de næste afsnit beskrives alle trin til måling af actin-myosin-5B-interaktioner under forskellige belastninger med en ultrahurtig kraftklemmespektroskopiopsætning fuldt ud, herunder 1) opsætning af den optiske opsætning, justering af optiske fælder og kalibreringsprocedurer, 2) forberedelserne af alle komponenter og deres samling i prøvekammeret, 3) måleproceduren, 4) Repræsentative data og dataanalyse for at udtrække vigtige fysiske parametre, såsom kørselslængden, trinstørrelsen og hastigheden af motorproteinet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Ultrafast force-clamp spektroskopi (UFFCS) er en enkelt molekyleteknik baseret på laserpincet, der muliggør undersøgelse af kemomekanikken af både konventionelle og ukonventionelle myosiner under belastning med hidtil uset tidsopløsning. Især muligheden for at undersøge myosinmotorer under konstant kraft lige efter actin-myosinbindingsdannelsen sammen med den høje hastighed af kraftfeedbacken (200 kHz) har vist, at UFFCS er et værdifuldt værktøj til at studere belastningsafhængigheden af hurtig dynamik såsom myosin-arbejdsslag. Desuden muliggør UFFCS undersøgelsen af, hvordan processive og ikke-processive myosin-actin-interaktioner påvirkes af intensiteten og retningen af den påførte kraft.
Ved at følge denne protokol vil det være muligt at udføre ultrahurtige kraftklemmeeksperimenter på processive myosin-5-motorer og på en række ukonventionelle myosiner. Ved nogle justeringer kunne protokollen også let udvides til studiet af andre klasser af processive motorer såsom kinesiner og dyneiner. Protokollen indeholder alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, kalibreringsprocedurer, dataindsamling og analyse.

Repræsentative data består af positionsregistreringer over tid som vist i figur 4. I stillingsposten er to slags forskydninger synlige. For det første, når myosinmotoren ikke interagerer med actinfilamentet, bevæger de fangede perler sig med konstant hastighed mod opløsningens viskøse trækkraft, hvilket viser en lineær forskydning, der oscillerer inden for oscillationsområdet, der er indstillet af operatøren i en trekantet bølge3 (ikke synlig i </s...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Præsenteret her er en omfattende protokol til udførelse af ultrahurtige kraftklemmeforsøg på processive myosin-5-motorer, som let kan udvides til undersøgelsen af andre klasser af processive motorer. Protokollen beskriver alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, dataindsamling og analyse.

Dissekering af mekanoenzymatiske egenskaber af processive myosiner med ultrahurtig kraftklemmespektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultrahurtig force-clamp spektroskopi er en enkeltmolekyleteknik baseret på laserpincet, der gør det muligt at undersøge kemomekanikken i myosinmotorer under belastning med den højeste tidsopløsning. Denne teknik gør det muligt at undersøge meget hurtige hændelser i kraftproduktion ved at opretholde kraftkonstanten under hver fase af motorinteraktionen med fuld kontrol over kraftretningsvirkning. Ved at foretage passende justeringer kunne denne protokol let anvendes på andre typer procesmotorer, herunder kinesiner og dyneiner, for at afdække reguleringen med magt.Efter montering af et sæt akustooptiske deflektorer på en lineær oversætter, skal du tage en iris og justere dens blænde, så den passer til den objektive bagblændestørrelse. Udskift målet med iris centreret på det gevindskårne objektivhus. Flyt oversætteren mod laserstrålen, indtil den del af strålen, der er blokeret af piezokrystallen, er synlig efter iris, og drej oversætteren lidt bagud, indtil strålen fylder irisblænden helt.For at forberede silicaperler i pentylacetat skal du først fortynde 20 mikroliter 1,2 mikron 10% faste silicaperler i 1-1,5 ml acetone med hvirvel og 30 sekunders sonikering. Efter sonicering samles perlerne ved centrifugering og resuspenderes perlepelleten i 1 ml frisk acetone til en anden vask. Efter den anden acetonevask vaskes perlerne tre gange i 1 ml frisk pentylacetat pr. vask under de samme centrifugeringsbetingelser, og pelleten resuspenderes i 100 mikroliter 1% nitrocellulose og 900 mikroliter pentylacetat.Brug derefter et rent ethanol-gennemblødt stykke laboratorievæv til forsigtigt at tørre en 24 x 24 millimeter glasdæksel, inden du bruger ren pincet til at skylle glasset direkte i ethanolen og lade dækslet tørre under blid nitrogenstrøm. Vortex og sonikere den tilberedte silicaperlebestand i 30 sekunder og brug en ethanolrenset 24 x 60 millimeter coverslip til at smøre 2 mikroliter silicaperleopløsning på overfladen af den mindre dæksel. Mens perlerne tørrer, skal du rengøre et 26 x 76 millimeter dias som demonstreret og placere to 60-100 mikron tykke linjer på 3 millimeter dobbeltsidet tapet på diasens lange kanter.Brug ren pincet til at placere det perlebelagte dæksel på båndet med perlerne vendt mod indersiden af glidekammeret, og fyld kammeret med 15 millimolær fosfatbuffer og flydende polystyrenperleopløsning. Derefter forsegles kammeret med siliciumfedt. For at kalibrere pixel-til-nanometer-forholdet mellem brightfield-kameraet skal du få et første billede af en silicaperle på dækseloverfladen ca. 5 mikron fra midten af synsfeltet.Flyt scenen for at forskyde perlen 10 mikron mod midten af synsfeltet, og tag et andet billede. Beregn kameraets kalibreringskonstant ved at måle pixelafstanden mellem to positioner af perlen. For at kalibrere fældepositionen skal du fange en enkelt flydende partikel i en fælde og flytte de akustooptiske deflektorer i 0,2 megahertz trin, erhverve et billede af partiklen og den tilsvarende frekvens af deflektorerne for hvert trin.Gentag derefter kalibreringen for den anden fælde på samme måde. For at kalibrere fældekraften og stivheden skal du fange en enkelt partikel i hver fælde og forskyde begge fælder ved hjælp af de akustooptiske deflektorer i 0,2 megahertz trin, idet du registrerer en brunsk bevægelse af partiklen i begge fælder med kvadrantfotodiodedetektorer og den tilsvarende frekvens af de akustooptiske deflektorer. Der opnås kalibreringskonstanter ved at montere en Lorentzian-funktion på et effektspektrum af den registrerede brownske bevægelse.For at samle en prøve til måling tilsættes 1 milligram pr. milliliter biotinyleret BSA til et nyt kammer med silicaperler på dækseloverfladen. Efter 5 minutter vaskes kammeret med AB-buffer og tilsættes 1 milligram pr. Milliliter streptavidin til kammeret. Efter 5 minutter vaskes kammeret som vist, og der tilsættes 3 nanomolære biotinylerede Myosin-5B tunge meromyosin i M5B buffer suppleret med 2 mikromolær Calmodulin.Efter 5 minutter vaskes kammeret tre gange med 1 milligram pr. milliliter biotinyleret BSA suppleret med 2 mikromolært Calmodulin i AB-buffer og vent 3 minutter efter den endelige vask. Flow reaktionsblandingen og forsegl kammeret med siliciumfedt. For at måle prøven skal du placere kammeret på mikroskopstadiet og flytte målet, indtil de flydende alfa-actininperler er i fokus.Tænd for en fælde og fang en perle. Når den første fælde er optaget, skal du flytte oversætteren for at placere den fangede perle tæt på dækslipfladen for at undgå at fange flere perler og fange en perle i den anden fælde. Fortræng prøven gennem langdistanceoversætterne for at lokalisere actinfilamenter med en længde på mindst 5 mikron i opløsningen.Når et filament er blevet opdaget, skal du flytte prøven for at lade en fanget perle nærme sig den ene ende af filamentet. Når filamentet er fastgjort, skal du justere perlens afstand til den omtrentlige filamentlængde og flytte trinnet for at skabe et flow i den ubundne perleretning. Filamentet bliver strakt af strømmen og binder til sidst til den anden perle.Det resulterende kompleks kaldes en håndvægt"For at etablere actin-myosinkontakt skal du forsigtigt adskille de to fælder og indstille filamentet til prætensionsniveauer op til ca. 3 piconewton. For at undersøge håndvægtens stivhed skal du få en fælde til at svinge i en trekantet bølge ved at ændre frekvensen af en akustooptisk deflektor og verificere den deraf følgende transmission af bevægelsen til den bageste perle gennem dens positionssignal. Flyt scenen for at placere håndvægten i nærheden af en piedestal silicaperle og juster håndvægtens højde, så actinfilamentet kommer i kontakt med silicaperleoverfladen.Som observeret i denne repræsentative positionsrekord, når myosinmotoren ikke interagerer med actinfilamentet, bevæger de fangede perler sig med konstant hastighed mod opløsningens viskøse trækkraft. Når myosinmotoren begynder at interagere med filamentet, overføres kraften, der bæres af det bevægelige filament, meget hurtigt til proteinet, og systemhastigheden falder til nul, hvor trinhændelserne forekommer under konstant kraft indtil slutningen af løbet. Kraften skiftes fra positiv til negativ retning af feedbacksystemet, som skifter kraftretningen, når perlen når kanten af det svingningsområde, der er indstillet af brugeren.Når myosinet binder og fortrænger filamentet mod den positive retning, skubber det perlen mod den øvre kant af svingningsområdet. Hvis dette sker under hjælpekraft, vil myosinets løb blive afbrudt af kraftretningsinversionen ved svingningskanten, hvilket begrænser løbets længde til amplituden af håndvægtoscillationen. Præcis justering af det optiske system er nødvendig for at opnå den optimale rumlige og tidsmæssige opløsning, mens en nøjagtig kalibrering er nødvendig for præcist at bestemme værdierne for de påførte kræfter.Denne teknik er blevet tilpasset til at studere glidende og målrettet søgning af transkriptionsfaktorer i DNA samt dynamiske interaktioner mellem mekanotransduktionsproteiner, der induktioner over mikrotubulusfilamenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Ved at kombinere Single-molekyle manipulation og Imaging for Studiet af protein-DNA interaktioner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Foto stimulation af Femtosecond laser aktiverer ekstracellulær-signal-reguleret kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hændelser i målcellerne

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantificering af cellulære tætheder og antigene egenskaber ved hjælp af magnetisk levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...